專利名稱：：一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法
技術領域：
：本發明涉及動物纖維蛋白原，尤其是涉及一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法。
背景技術：
：現有蛋白制品的病毒滅活/去除方法有其局限性，如S/D法(有機溶劑/表面活性劑法)只對包膜病毒有效，因而導致蛋白制品的應用仍有一定的風險。有研究報道靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)產品可能傳播丙肝病毒，輸注血漿蛋白制品可能傳播人類細小病毒B19。因此尋找一種能滅活所有病毒，且對蛋白制品活性影響較小、操作方便的方法，將有助于提高蛋白制品應用的安全性，1y射線滅活病原體的機理大量實驗證實y射線輻照對各種微生物均有殺滅作用，包括有包膜和無包膜病毒及所有的基因型物質。電離輻射對生物大分子的損傷既有能量傳遞的直接作用，也有通過水的輻解反應大量產生自由基的間接作用，這兩者之間除時間上有先后之分外，在損傷的類型與機理等方面也存在一定差異。直接作用離子射線的直接作用主要是光子存儲能量到"靶結構"上，這些能量的轉移主要導致分子的外部電子從分子上移位而破壞共價鍵。間接作用間接作用主要是射線作用于水分子、氧分子或其它的分子，形成高活性的自由基和活性氧，自由基和活性氧使病原體核酸斷裂。目前認為，傳染因子的基因物質比蛋白生物制品更容易受到y-射線的損傷，這主要是由于兩者物理特征(大小和密度)和化學結構的不同。生物大分子對射線輻照的敏感性與其本身質量大小有關，實際上，幾十年前人們就通過y_射線滅活病毒所需的劑量來估計病毒基因組的大小，一般情況下滅活微生物所需的劑量與微生物的核酸大小成反比。2y射線輻照消毒和滅菌的優點與傳統的消毒滅菌方法相比較，y射線輻照有其獨特的優點①不使物品升溫，適用于忌熱物品的消毒，除某些塑料、活細胞及其制劑外，許多醫用物品都可用它進行消毒滅菌；②穿透力強。射線可穿透被照物品的各個部位，一般不受物品包裝、形態的限制；③被照物品不會產生感生放射性，輻照后無殘留毒性；④方法簡便；⑤省能，尤其適于大規模工業化處理。3y射線輻照滅活蛋白制品中的病毒—般情況下，20-50kGy劑量的y射線輻照幾乎能滅活所有的病毒，但滅活病毒的同時，輻照劑量越大，對蛋白制品成分的損傷也越大，如何在滅活病毒的同時又保留蛋白有效成分、不破壞蛋白成分的活性，這將是y射線輻照應用于蛋白制品病毒滅活的關鍵。有文獻報道自由基對蛋白質的損傷主要表現在一級結構上的肽鍵斷裂、氨基酸組成變化和空間構象的13折疊的含量減少，緊密的結構趨于松散，無規則巻曲明顯增加。但也有實驗表明將白蛋白濃縮液經水溶液稀釋后用y射線輻照，下列條件可減少蛋白成分損傷①白蛋白含量高；②加入辛酸鈉；③低照射劑量率；④缺氧狀態。加入抗氧化劑或自由基清除劑，或者利用一種手段使輻照過程中產生最小量的活性氧都可減少y射線對蛋白成分的損傷。凍干狀態下的蛋白制品由于所含水分少，經電離輻射后所產生自由基少，對蛋白制品的損傷也會減弱。綜上所述，Y射線是一種有效滅活生物蛋白制品中病毒的方法。盡管對某些蛋白制品生物活性有不同程度的影響，但如果能研制出效果好的蛋白保護劑，Y-射線輻照技術將可用于蛋白制品的病毒滅活處理，蛋白制品的臨床應用安全系數也會得到明顯提高。
發明內容本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種在保證有效地殺滅可能污染的病原微生物的同時，維持生物材料的功能和結構的動物纖維蛋白原病毒滅活方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，該方法是將至少含一種生物材料及穩定劑的組成物質封裝、凍干、粉碎成凍干粉，在-104(TC下進行2040KGy的鈷6°伽馬射線的輻照。所述的組成物質中的生物材料為蛋白質，包括但不限于哺乳動物的血液蛋白組分凝血因子，包括維生素K依賴性蛋白，及非維生素K依賴性蛋白；白蛋白；脂蛋白；補體蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白組分包括因子I(纖維蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(組織因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血漿凝血激酶前質)，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(轉谷氨酰胺酶)，vonWillebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via，因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同時還包括血紅細胞中的蛋白。所述的維生素K依賴性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非維生素K依賴性蛋白包括因子VIII或vonWillebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血紅細胞中的蛋白包括血紅蛋白和各種生長因子，及這些蛋白的衍生物。所述的組成物質中的生物材料為蛋白質，包括但不限于從哺乳動物血液以外組織提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，膠原或上述混合物。所述的組成物質中的生物材料為蛋白質，包括但不限于細胞培養所獲得的蛋白質或多肽。所述的穩定劑為L-精氨酸鹽酸鹽，枸櫞酸三鈉和氯化鈉；所述的生物材料為從哺乳動物體內提取的纖維蛋白原復合物，哺乳動物包括人、牛、馬、豬和羊。所述的組成物質的制劑配比以重量克/100ml計為蛋白質0.l20g%L-精氨酸鹽酸鹽0.110g%氯化鈉0.0110g%枸櫞酸鈉0.015g%。所述的組成物質的制劑配比以重』蛋白質315g%L-精氨酸鹽酸鹽0.52g%:克/100ml計為氯化鈉0.3lg%枸櫞酸鈉l3g%。所述的組成物質中殘留水份含量為0.515g^;所述的凍干粉的直徑為5100微米所述的組成物質中殘留水份含量為0.55g%。與現有技術相比，本發明采用至少含一種生物材料及穩定劑的組成物質；該組成物質可以承受20-40KGy的鈷^伽瑪射線的輻照制備抗輻照的動物源纖維蛋白原，本發明中生物材料及穩定劑的組成物質可以承受20-407的鈷6°伽瑪射線的輻照；在保證有效地殺滅可能污染的病原微生物(包括除口病毒以外的病毒，細菌，支原體，霉菌等)的同時，維持該生物材料的功能和結構。圖1為實施例3中SDS-PAGE電泳圖。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1根據生產標準操作流程，采用無菌技術獲取經過嚴格屠宰前和屠宰后檢疫的定點養殖場生產的食用豬全血；在潔凈度100級的生產場地內進行血漿的分離，纖維蛋白原復合物粗提，純化；測定純化后纖維蛋白復合物的蛋白含量，計算蛋白重量，將穩定劑加入，攪拌混勻。最終溶液含有蛋白質8.6%、氯化鈉2.3%、卜精氨酸鹽酸鹽3%、枸櫞酸三鈉2.4%;封裝，凍干；微生物限量測定細菌總數于100CFU/瓶(7ml西林瓶)。然后，在室溫下，進行總劑量為25KGy的鈷6°伽瑪射線輻照。以實現最終滅菌滅病毒。實施例2采用無菌采血法經過心臟穿剌獲取無菌豬血20L，在潔凈車間(潔凈度為10000級保護下的100級)內，離心法4000rpm得到9L血漿，在2t:，pH值7.0條件下，加入1:9的冷酒精，4000rpm離心，收集沉淀；將沉淀等分為兩份。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>第一份加入溶解液，溶解后液體的組成成分如下蛋白質8.6%、氯化鈉2.3%、L-精氨酸鹽酸鹽3%、枸櫞酸三鈉2.4%;第二份加入溶解液，溶解后液體的組成成分如下蛋白質8.6X，維生素C:200mM，氯化鈉2.3%，枸櫞酸三鈉2.4%。將上述兩部分液體取樣，各自分成3等分，每等分分別加入約107qfU/ml的豬細小病毒(PPV)，分裝到西林瓶，1ml/瓶，粉碎后，再次冷凍干燥，使凍干粉的水分含量《1%。送輻照中心在-10-4(TC條件下進行鈷60伽馬射線輻照，輻照劑量為分別為5，10，15，20，25，30，35，40KGy.采用Reed-咖enchTCID5。法測定輻照前后病毒滴度降低(TotalReductionFactorTRF)情況，實驗數據如下結果表明，與抗壞血酸相比較，采用精氨酸鹽酸作為保護劑，在25-30KGy的輻照劑量下，PPV的TRF降低了近5.O，而抗壞血酸組僅僅降低了2-3.5.從而說明，松力保護劑較抗壞血酸組更加有效地增強了輻照的滅病毒作用。實施例3根據生產標準操作流程，采用無菌技術獲取經過嚴格屠宰前和屠宰后檢疫的定點養殖場生產的食用豬全血；在潔凈度100級的生產場地內進行血漿的分離，纖維蛋白原復合物粗提，純化；測定純化后纖維蛋白復合物的蛋白含量，計算蛋白重量，將穩定劑加入，攪拌混勻。最終溶液含有蛋白質8.6%、氯化鈉2.3%、卜精氨酸鹽酸鹽3%、枸櫞酸三鈉2.4%;封裝，凍干；微生物限量測定細菌總數于100CFU/瓶(7ml西林瓶)。然后，在室溫下，進行總劑量為25KGy的鈷6°伽瑪射線輻照。以實現最終滅菌滅病毒。隨機抽取兩組批號進行穩定性測試。測定指標見實施例1.從每一批號中分別取120套置于冷凍箱中(為期3年)、120套置于37t:及75X相對濕度的烘箱中(為期6個月)、120套置于25t:空調房中(為期6個月)作為測試樣本。在此之前，已進行過基線時間測試，且測試結果均合格.在為期3年的實時測試過程中，前半年內每月選取IO套樣品進行檢測，此后，每一年選取10套樣品進行檢測，檢測結果記錄在表中。進行加速測試中，前半年內每月選取10套樣品進行測試，在滿1年儲存期時再進行測試.檢測結果均符合實施例1的要求。因此，本次抽樣穩定性測試結果為合格。實施例4—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從牛體內提取的纖維蛋白原復合物加入穩定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質O.lg%、L-精氨酸鹽酸鹽10g^、氯化鈉10g^、枸櫞酸鈉5g^，封裝、凍干、殘留水份含量為0.5g^，然后粉碎成直徑為5微米凍干粉，在-l(TC下進行20KGy的鈷6°伽馬射線的輻照。實施例5—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從羊體內提取的纖維蛋白原復合物加入穩定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質20g^、L-精氨酸鹽酸鹽O.lg^、氯化鈉0.01g^、枸櫞酸鈉0.01g^，封裝、凍干、殘留水份含量為15g^，然后粉碎成直徑為100微米凍干粉，在4(TC下進行40KGy的鈷6°伽馬射線的輻照。實施例6—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從馬體內提取的纖維蛋白原復合物加入穩定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質3g%、L_精氨酸鹽酸鹽2g%、氯化鈉lg%、枸櫞酸鈉3g^，封裝、凍干、殘留水份含量為5g^，然后粉碎成直徑為20微米凍干粉，在20°C下進行30KGy的鈷6°伽馬射線的輻照。實施例7—種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將從馬體內提取的纖維蛋白原復合物加入穩定劑攪拌均勻，得到溶液含有蛋白質15g%、L-精氨酸鹽酸鹽O.5g^、氯化鈉70.3g^、枸櫞酸鈉lg^，封裝、凍干、殘留水份含量為lg^，然后粉碎成直徑為60微米凍干粉，在25t:下進行25KGy的鈷6°伽馬射線的輻照。權利要求一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，該方法是將至少含一種生物材料及穩定劑的組成物質封裝、凍干、粉碎成凍干粉，在-10～40℃下進行20～40KGy的鈷60伽馬射線的輻照。2.根據權利要求1所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質中的生物材料為蛋白質，包括但不限于哺乳動物的血液蛋白組分凝血因子，包括維生素K依賴性蛋白，及非維生素K依賴性蛋白；白蛋白；脂蛋白；補體蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白組分包括因子I(纖維蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(組織因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血槳凝血激酶前質)，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(轉谷氨酰胺酶)，vonWillebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via，因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同時還包括血紅細胞中的蛋白。3.根據權利要求2所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的維生素K依賴性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非維生素K依賴性蛋白包括因子VIII或vonWillebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血紅細胞中的蛋白包括血紅蛋白和各種生長因子，及這些蛋白的衍生物。4.根據權利要求1所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質中的生物材料為蛋白質，包括但不限于從哺乳動物血液以外組織提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，膠原或上述混合物。5.根據權利要求1所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質中的生物材料為蛋白質，包括但不限于細胞培養所獲得的蛋白質或多肽。6.根據權利要求1所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的穩定劑為L-精氨酸鹽酸鹽，枸櫞酸三鈉和氯化鈉；所述的生物材料為從哺乳動物體內提取的纖維蛋白原復合物，哺乳動物包括人、牛、馬、豬和羊。7.根據權利要求1所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質的制劑配比以重量克/100ml計為蛋白質0.l20g%L-精氨酸鹽酸鹽0.l10g%氯化鈉0.0110g%枸櫞酸鈉0.015g%。8.根據權利要求7所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質的制劑配比以重量克/100ml計為蛋白質315g%L-精氨酸鹽酸鹽0.52g%氯化鈉0.3lg%枸櫞酸鈉l3g%。9.根據權利要求1所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質中殘留水份含量為0.515g%;所述的凍干粉的直徑為5100微米10.根據權利要求5所述的一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，其特征在于，所述的組成物質中殘留水份含量為0.55g%。全文摘要本發明涉及一種動物纖維蛋白原病毒滅活方法，該方法是將至少含一種生物材料及穩定劑的組成物質封裝、凍干、粉碎成凍干粉，在-10～40℃下進行20～40KGy的鈷60伽馬射線的輻照。與現有技術相比，本發明具有在保證有效地殺滅可能污染的病原微生物的同時，維持生物材料的功能和結構等優點。文檔編號A61L2/08GK101757651SQ20081020290公開日2010年6月30日申請日期2008年11月18日優先權日2008年11月18日發明者何紅兵申請人:上海松力生物技術有限公司