山銀花提取物及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：：山銀花提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥制藥領域，具體涉及一種山銀花提取物及其制備方法和用途，具體地，是從傳統中藥山銀花中提取的有效活性部位提取物——總皂苷，并研究確定了制備該提取物的一種工藝精簡、得率高的制備方法，以及該提取物在制備預防和治療癌癥藥物中的應用。
背景技術：
：忍冬屬(Lonicera)植物多為落葉或常綠的直立灌木、矮灌木和藤本,很少呈小喬木狀。現已記載的藥用忍冬屬植物共47種，對許多致病菌有較強的抗菌作用，我國早在1500多年前就有對忍冬藥用價值的記載，其根莖、葉、花均可入藥。山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬丄o"/wmmfltrawAo/ffeyHand.-Mazz、紅腺'忍、冬Zow'cera/j>pog/m/caMiq.或華南;忍、冬丄om'cera(co"/w7DC.的干燥花蕾或帶初開的花，湛江道地藥材之一。主要有效成分是綠原酸，具有清熱解毒，涼散風熱的作用，用于治療癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫熱發病。在2005版藥典之前，作為金銀花入藥，為華南地區"金銀花"中藥材的主要品種。但由于兩者化學成分存在比較明顯的差異，2005版藥典將山銀花和金銀花分別收載，臨床應用時也不再相互代用(陳亞等，山銀花研究進展，中國科技信息，2007年05期73-74)。有文獻報道其所含的皂苷類成分具有保肝(時京珍等，黃褐毛忍冬和灰氈毛忍冬幾種成分對大、小鼠化學性肝損傷的保護作用，中國中藥雜志，1999，24(6):363-364)、抗癌(CytotoxicsaponinsfromtherootOfDipsacusasperWall.ArchPharmRes.2005,28(9):1053.6.)活性。目前已經先后分離并鑒定出多種山銀花植物中的皂苷類成分，但是這些分離提取方法多屬于實驗室中的研究方法，方法復雜，成本高，并且分離出的皂苷類成分得率低，不適合用于工業化生產，此外提取物中成分含量不明確，不利于應用于制藥和治療領域。本實驗室多年從事山銀花藥用成分的分離提取和研究工作，在我們之前的申請200610039294.4中公開了從灰氈毛忍冬中提取的總皂苷提取物，該提取物中總皂苷含量為50%_90%，其中灰氈毛忍冬次皂苷乙灰氈毛忍冬次皂苷甲=126:1,同時還公開了其制備方法和用于預防和治療肝癌的用途，在我們的另外一件申請200710023243.7中公開了單體成分灰氈毛忍冬次皂苷乙的制備方法及其治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌的用途，但是上述該請中的提取方法得率還比較低，所公開的治療癌癥的種類有限。
發明內容本實驗室在之前的基礎上經過大量的試驗研究和篩選，確定了一種新的山銀花提取物及其制備成的藥物組合物和制備方法，并對其抗癌效果進行了系統的驗證。該提取物成分明確，抗癌效果好，有利于制備預防和治療癌癥藥物；該方法工藝過程簡單，產品得率高，適于工業化生產。本發明目的在于提供一種山銀花提取物，該山銀花提取物的主要成分為灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲、3-0-a-L-吡喃鼠李糖基(l-2)-ci-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元和3-0-e-0-吡喃葡萄糖基(1-4)-e-0-吡喃葡萄糖基(1-3)-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-a-L-吡喃阿拉伯糖基-齊墩果酸，所述4種成分的重量比依次為4210:9~1:12~1:1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的50%-100%。其中所述4種成分的重量比優選為2714:5~1:9~1:1;所述4種成分的總重量優選占該提取物的70%-99.6%。本發明所述山銀花提取物中主要成分的鑒別和含量測定可以采用常規的測定方法，但是優選本發明所提供的方法1.成分的鑒別采用薄層色譜法將提取物用甲醇溶解，點樣于硅膠板上，等溶劑揮發干后，置于層析缸中，用新配的展開劑(氯仿甲醇水=7:3:0.5的下層透明溶液)在25攝氏度下展開。將展開后的硅膠板揮掉溶劑后噴顯色劑香草醛一濃硫酸，于105攝氏度加熱1分鐘，與灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲、3-0-c丄-吡喃鼠李糖基(1-2)-(1-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元和3-0-e-0-吡喃葡萄糖基(1-4)-e-0-吡喃葡萄糖基(1-3)-a丄-卩比喃鼠李糖基(1-2)-a-L-吡喃阿拉伯糖基-齊墩果酸對照品顯示相同斑點。2.成分的含量測定采用高效液相色譜法高效液相色譜儀AglientllOO系列，四元泵，自動進樣器，檢測器AlltechELSD2000(Alltech，Deerfield，IL，USA)，色譜柱AglientZorbaxSB-C18柱(150X4.6腿，5.0pm)，乙腈為色譜純，磷酸為分析純。色譜條件流動相0-10min,乙腈0.5%磷酸溶液維持比例(29:71)，10.25min，流動相比例由(29:71)線形改變到(46:54)，25-30min，流動相維持比例(46:54)。ELSD管溫度106'C。氮氣流速2.6L/min。分別精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲、3-0-a-L-吡喃鼠李糖基(l-2)-ci-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元和3-0-e-0-吡喃葡萄糖基(1-4)-e-0-吡喃葡萄糖基(1-3)-a-L-吡喃鼠李糖基(l-2)-a-L-吡喃阿拉伯糖基-齊墩果酸對照品，各加甲醇制成每lml分別含0.03mg的溶液，作為對照溶液。取本品粉末約20mg(同時另取本品粉末測定水分)，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇回流提取4小時，放冷后，轉移至100ml容量瓶中，甲醇定容即得。各樣品經高效液相檢測，計算得4種成分的重量比依次為42~10:9~1:12~1:1。本發明的山銀花提取物可與一種或多種藥學上可以接受的輔料制成藥學上的制劑。所述藥學上可以接受的輔料是指藥學領域常規的藥物載體或輔料，例如水；稀釋劑、賦形劑或填充劑如淀粉、糊精、甘露醇、蔗糖、乳糖，微晶纖維素等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯垸酮；潤濕劑如甘油；崩解劑如甲基淀粉鈉，羥丙纖維素，瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六垸醇，吐溫類，十二垸基硫酸鈉吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、微粉硅膠和聚乙二醇等。所述制劑可通過經腸道給藥或非腸道給藥的方式施用于癌癥患者。用于經腸道給藥方式的制劑時，可將其制成常規的固體制劑如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑等，制成液體制劑如水或油懸浮劑，其它液體制劑如糖漿、合劑、酏劑等；用于非腸道給藥方式的制劑時，可將其制成注射用的溶液、粉針、水或油性懸浮劑等。本發明優選的形式是粉針劑、片劑和膠囊劑。本發明還提供了所述山銀花提取物制備方法取山銀花的花及花蕾，用極性溶劑提取，提取液回收溶劑，降溫至0—5攝氏度，過濾，濾液加w/v為0.5—50。/。的NaOH或KOH進行水解，用正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的PH值〉7的堿性水溶液反萃取，將萃取后的溶液PH值調節為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物。所述山銀花主要是藥典中山銀花項下的忍冬屬植物，包括灰氈毛忍冬(&"i"ra附flcra"f/zo油sHand.-Mazz)、華南忍冬(Zom'ceraco"加aiDC.)、紅腺忍冬(Zo"/cera—og/awcaMiq.)等。本發明所述的山銀花提取物還可以從黃褐毛忍冬(丄o剛'cera/w/w/o附e"toy"HsuetSCCheng)和細氈毛忍冬aow'cera^w/to)中提取得到。所述極性溶劑選自水、v/v為0—100%的甲醇或乙醇溶液中的一種或多種。所述水解的時間為3—15小時。本發明的藥物組合物具有抗癌的作用，應用于制備預防和治療癌癥的藥物。所述的癌癥包括肝癌、肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌、結腸癌、腹水癌、前列腺癌、骨癌或白血病等癌癥。本發明中的提取物與申請200610039294.4中公開的總皂苷提取物相比成分更加明確，藥物抗癌效果更好(見主要藥效學試驗)，本發明中所公開的制備方法的原料來源更廣，提取物的得率更高，可達到上述發明的十倍之多，更適于工業化生產。本發明所述提取物的HPLC圖譜。具體實施例方式下面通過具體實施方式及主要藥效學試驗對本發明作進一步的說明實施例1灰氈毛忍冬花及花蕾，用8倍體積的濃度為60%乙醇，在90攝氏度提取，提取液回收溶劑至原體積的五分之一，降溫至0攝氏度，過濾得濾液，濾液加8W的KOH，在80攝氏度水解10小時，冷卻后用正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的PH值13的堿性水溶液反萃取，將反萃取后的正丁醇溶液調節PH值為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物，經檢測，以重量計，其中灰氈毛忍冬次皂苷乙(以下簡稱組分a):灰氈毛忍冬次皂苷甲(以下簡稱組分b):3-0-a-L-吡喃鼠李糖基(l-2)-a-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元(以下簡稱組分c):3-0-e-0-吡喃葡萄糖基(1-4)-e-0-吡喃葡萄糖基(1-3)-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-a-L-吡喃阿拉伯糖基-齊墩果酸(以下簡稱組分d)=22:3:3:1,并且所述4種成分的總重量占該提取物的99.6%，得率15%。實施例2紅腺忍冬花及花蕾，用10倍體積的水，在60攝氏度提取，提取液回收溶劑至原體積的六分之一，降溫至2攝氏度，過濾得濾液，濾液加50n/。的NaOH,在100攝氏度下水解3小時，冷卻后用正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的0.1^的NaOH水溶液反萃取，將反萃取后的正丁醇溶液調節PH值為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物，經檢測，以重量計，組分a:組分b:組分C:組分d=42:9:10:1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的62%，得率12%。實施例3重量比為1:1的紅腺忍冬花及花蕾與黃褐毛忍冬花及花蕾，用3倍體積的濃度為100%甲醇，在常溫下提取，提取液回收溶劑至原體積的四分之一，降溫至4攝氏度，過濾得濾液，濾液加0，/。的KOH,在40攝氏度下水解10小時，正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的0.8Q/。的KOH反萃取，將反萃取后的正丁醇溶液調節PH值為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物，經檢測，以重量計，成分a:成分b:成分C:成分d-14:2:3:1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的74%,得率11%。先將聚乙二醇120g、乳糖30g混勻，再加入上述提取物300g混勻，再加入羥丙甲纖維素漿，制粒，干燥，整粒，裝入膠囊殼，即得膠囊。實施例4黃褐毛忍冬花及花蕾，用20倍體積的濃度為甲醇，在10攝氏度下提取，提取液回收溶劑至原體積的十分之一，降溫至5攝氏度，過濾得濾液，濾液加3M的KOH，在常溫下水解15小時，正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的l°/NaOH反萃取，將反萃取后的正丁醇溶液調節PH值為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物，經檢測，以重量計，成分a:成分b:成分C:成分d-27:5:12:1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的67.2%，得率9%。將提取物制粒，干燥，整粒，裝入膠囊殼，即得膠囊。實施例5華南忍冬花及花蕾，用25倍體積的濃度為100%甲醇，在0攝氏度提取，提取液回收溶劑至原體積的二十分之一，過濾得濾液，濾液加10W的KOH，在常溫下水解14小時，正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的pH值14的水溶液反萃取，將反萃取后的正丁醇溶液調節PH值為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物，經檢測，以重量計，成分a:成分b-成分c:成分d-34:5:1:1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的66.2%，得率14%。先將聚乙二醇120g、乳糖30g混勻，再加入上述提取物300g混勻，再加入輕丙甲纖維素漿，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂混勻，壓片，包衣，即得緩釋片。實施例6細氈毛忍冬花及花蕾，用18倍體積的水，在100攝氏度提取，提取液回收溶劑至原體積的十分之一，過濾得濾液，濾液加1X的K0H，在60攝氏度下水解11小時，正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的0.1%的NaOH反萃取，將反萃取后的正丁醇溶液調節PH值為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物，經檢測，以重量計，成分a:成分b:成分C:成分d-Kh1:2:1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的80.3%,得率10%。提取物加注射用水適量使溶解，煮沸，放冷，濾過，濾液加甘露醇，補加注射用水適量，調pH，凍干，即得凍干粉針劑。以上實施例僅為了對本發明作進一步的說明，而本發明的范圍不受所舉實施例的局限。主要藥效學試驗采用本領域經典的抗腫瘤藥物實驗方法(《藥理實驗方法學》第三版，徐叔云等主編，人民衛生出版社出版)選用體外試驗和體內試驗方法對本發明山銀花提取物的抗癌活性進行驗證。一、體外細胞試驗1、受試藥物本發明實施例1制備的山銀花提取物(提取物I);實施例2制備的山銀花提取物(提取物n)，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。2、受試細胞MDA-MB-231(人乳腺癌)、Hela(子宮頸癌)、Hq>G2(肝癌)、IA-9(卵巢癌)、U-87-MG(人腦星形膠質母細胞瘤)、CAKI-1(人腎透明細胞癌皮膚轉移細胞)、PC-3(人前列腺癌)、KB(人口腔上皮癌)、KB-VIN(鼻咽癌)、A-549(肺癌)、SK-MEL-2(皮膚癌)、HCT-15(人結直腸腺癌)細胞。3、方法與結果試驗方法為國際通用的MTT法將處于對數生長期的要進行實驗的腫瘤細胞按定量接種于96孔培養板內，培養24小時后加入藥量，細胞在37'C、5哆，C02條件下繼續培養48小時后，加入5mg/ml的MTT液20M.1，再繼續培養4小時，加入DMSO溶解后迅速用酶標儀在570nm處測定OD值，按下面公式計算細胞生長抑制率，實驗結果見表l(表1.1和表1.2)。生長抑制率(％)=(1-加藥孔平均A值/空白對照孔平均A值)X100%。表1.1體外細胞毒實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>45.30表1.2體外細胞毒實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果表明，用不同濃度的山銀花提取物處理各腫瘤細胞，使腫瘤細胞的生長均受到抑制，呈濃度和時間依賴性。表明本發明山銀花提取物對腫瘤細胞有較強的抑制作用。同時同樣濃度下，本發明山銀花提取物對HepG2和A549細胞毒作用強于申請200610039294.4中公開的總皂苷提取物。二、體內抗腫瘤試驗1、對小鼠肝癌(H22)細胞的抑制作用l.l受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；本發明實施例l制備的山銀花提取物(提取物I);實施例2制備的山銀花提取物(提取物II);臨用前用生理鹽水配成相應濃度。1.2受試動物昆明種雄性小鼠，體重(20±2g)，實驗室溫度20t3'C，相對濕度75%。1.3方法與結果無菌條件下剝取傳代10天的肝癌H22癌塊，制成勻漿，用生理鹽水l:3稀釋，計數調整細胞濃度為2x1061/1,每只0.21111，接種于小鼠右腋部皮下，24小時后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)，每組均灌胃相應濃度藥物或生理鹽水，每天一次，十天后稱重處死，腫瘤塊稱重按下面公式計算腫瘤生長抑制率，結果見表2。腫瘤生長抑制率抑制率(％)=(l-治療.組平均瘤重/對照組平均瘤重)xl00%。2、對小鼠肺癌(Lewis)的抑制作用2.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；本發明實施例l制備的山銀花提取物(提取物I);實施例2制備的山銀花提取物(提取物I1)，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。2.2受試動物Cs7BL/6雄性小鼠，體重(20±2g),實驗室溫度20士3'C，相對濕度75%。2.3方法與結果無菌條件下剝取傳代10天的肝癌Lewis癌塊，制成勻漿，用生理鹽水I:3稀釋，計數調整細胞濃度為lxl071/1，每只0.2ml,接種于小鼠右腋部皮下，24小時后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物180mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)，每組均灌胃相應濃度藥物或生理鹽水，每天一次，十天后稱重處死，腫瘤塊稱重按下面公式計算腫瘤生長抑制率，結果見表2。腫瘤生長抑制率抑制率(％)=(l-治療.組平均瘤重/對照組平均瘤重)xi00%。3、對小鼠乳腺癌(MA737)的抑制作用3.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；本發明實施例l制備的山銀花提取物(提取物I);實施例2制備的山銀花提取物(提取物I1)，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。3.2受試動物昆明種雌性小鼠，體重(20±2g)，實驗室溫度20i3'C,相對濕度75%。3.3方法與結果按常規方法于無菌條件下每鼠右前肢腋部皮下注入生長7d的含1X107個細/ml的細胞懸液0.1ml，然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水);提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。腫瘤移植次日開始灌胃。陰性對照組灌胃生理鹽水。第9日處死全部小鼠，分離瘤塊，稱量腫瘤塊重量，按下面公式計算腫瘤生長抑制率，結果見表2。腫瘤生長抑制率抑制率(％)=(l-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)xl00%。4、對小鼠宮頸癌(U14)的抑制作用4.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；提取物I;提取物II，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。4.2受試動物昆明種雌性小鼠，體重(20±2g)，實驗室溫度20i3'C，相對濕度75%。4.3方法與結果:按常規方法于無菌條件下每鼠右前肢腋部皮下注入生長7d的含3X106~4Xl(^個細胞/ml的細胞懸液0.2ml，然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物180mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。腫瘤移植次日開始灌胃。陰性對照組灌胃生理鹽水。第16日處死全部小鼠，分離瘤塊，稱量腫瘤塊重量，計算腫瘤生長抑制率。結果見表2腫瘤生長抑制率抑制率(％)=(i-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)xioo%。5、對裸鼠胃癌(人SGC7901)的抑制作用5.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；提取物I;提取物II，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。5.2受試動物裸鼠雌雄各半，體重(20±2g)，實驗室溫度20士3"，相對濕度75%。5.3方法與結果按常規方法于無菌條件下每鼠左腹股溝皮下注入含1Xl(^個細胞/ml的細胞懸液0.2ml，然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。腫瘤移植次日開始灌胃。陰性對照組灌胃生理鹽水。第12日處死全部小鼠，分離瘤塊，稱量腫瘤塊重量，按下面公式計算腫瘤生長抑制率，結果見表2。腫瘤生長抑制率抑制率(％)=(l-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)xioo%。6、對小鼠肉瘤(SRS-82)的抑制作用。6.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；提取物I;提取物II，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。6.2受試動物昆明種雄性小鼠，體重(20±2g)，實驗室溫度20i3'C，相對濕度75%。6.3方法與結果把培養的SRS-82肉瘤細胞接種昆明小鼠后第8夭，自腹水瘤小鼠腹腔中抽取腹水約5ml，用生理鹽水稀釋成細胞數為lX107/ml,每只小鼠左腹股溝皮下注射0.2ml(2.X10V只)。然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。腹腔注射給藥，均于接種腫瘤后的第2天開始給藥，1/天，共10天。于接種后的第12天，斷頸處死各組小鼠，剝離腫瘤塊，稱取腫瘤重量，并按以下公式計算抑瘤率，見表2。腫瘤生長抑制率(％)=(l-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)xiOO%。表2對H22荷瘤小鼠和Lewis荷瘤小鼠抑瘤率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明，本發明山銀花提取物能顯著抑制H22、Lewis、MA737、U14、人SGC7901、SRS-82荷瘤小鼠瘤重，呈濃度依賴性。表明本發明山銀花提取物具有抑制腫瘤生長和抗癌的作用。7、對小鼠艾氏腹水癌(ECA)的影響7.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品本提取物I;提取物II，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。7.2受試動物昆明種雄性小鼠，體重(20±2g),實驗室溫度20士3。C，相對濕度75%。7.3方法與結果按常規方法于無菌條件下每鼠腹腔接種癌細胞懸液0.21111/只，接種后24小時隨機分組，然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。腫瘤移植次日開始灌胃。陰性對照組灌胃生理鹽水9日。停藥后觀察小鼠存活情況，記錄死亡數和存活天數，計算各組動物的生命延長率％，并進行組問比較，結果見表3:生命延長率(ILS一(給藥組平均生存天數/對照組平均生存天數-l)X100%表3對腹水癌ECA荷瘤小鼠存活時間的影響Groupn生存天數(d)存活時間延長率P值陰性對照組813.24±2.32--提取80mg/kg821.86±4.7565.1%<0.01物I40mg/kg820.36±3.2353.8%<0.0120mg/kg817.11±4.4629.2%-提取80mg/kg821.25±5.2560.5%<0.01物II40mg/kg818.91±3.2142.8%<0.0520mg/kg816.32±4.2523.3%-陽性對照組821.66±3.2363.6%<0.01結果表明，本發明山銀花提取物能顯著延長腹水癌ECA荷瘤小鼠存活時間，呈劑量依賴性，結果具有顯著差異。表明本發明山銀花提取物具有抑制腫瘤生長和抗癌的作用。8、對小鼠腹水瘤(S180)的抑制作用8.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；提取物I;提取物II，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。8.2受試動物昆明種雄性小鼠，體重(20±2g),實驗室、溫度20i3'C，相對濕度75%。8.3方法與結果把培養的S180細胞接種昆明小鼠后第8天，自S180腹水瘤小鼠腹腔中抽取腹水約7ml,用生理鹽水稀釋成細胞數為1X107/ml，每只小鼠腹腔注射0.2m](2.0X106/只)。然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。于接種腫瘤后的第2天開始給藥，另lj灌胃給藥0,2ml，共10天。每天記錄死亡小鼠數量，并按以下公式計算小鼠存活時間延長比例。見表4。小鼠存活時間延長率氣該組小鼠平均存活時間順性對照組小鼠平均存活時間-l)X100X。表4對肉瘤S180荷瘤小鼠存活時間的影響Groupn生存天數(d)活時間延長率P值陰性對照組816.24±2.12--提取80mg/kg827.85±5.6271.5%<0.01物I40mg/kg824.20±3.4249.0%<0.0120mg/kg821.78±3.7534.1%-提取80mg/kg826.18±5.8861.2%<0.01物II40mg/kg823.68±3.4245.8%<0.0520mg/kg820.54±3.1225.9%<0.05陽性對照組827.48±4.8869.2%<0.01結果表明，本發明山銀花提取物能顯著延長肉瘤S180荷瘤小鼠存活時間，呈劑量依賴性，結果具有顯著差異。表明本發明山銀花提取物具有抑制腫瘤生長和抗癌的作用。9、對小鼠白血病(L1210)的抑制作用9.1受試藥物5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；提取物I;提取物II，臨用前用生理鹽水配成相應濃度。9.2受試動物L615小鼠，體重(20士2g)，實驗室溫度20i3。C，相對濕度75%。9.3方法與結果把培養的L1210細胞接種L615小鼠后第8天，自L1210白血病小鼠腹腔中抽取腹水約7ml，用生理鹽水稀釋成細胞數為lX10Vml，每只小鼠皮下注射0.2m](4Xl(T/只)。然后隨機分為8組，即陰性對照組(生理鹽水)；提取物I80mg/kg組、5mg/kg組、2.5mg/kg;提取物I80mg/kg組、40mg/kg組、20mg/kg;陽性對照組(5-氟尿嘧啶)。于接種腫瘤后的第2天開始給藥，分別灌胃給藥0.21111，共10天。每天記錄死亡小鼠數量，并按以下公式計算小鼠存活時間延長比例。見表5。小鼠存活時間延長率(該組小鼠平均存活時間/陰性對照組小鼠平均存活時間-l)X100%表5對白血病L12100荷瘤小鼠存活時間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結果表明，本發明山銀花提取物能顯著延長白血病L12100荷瘤小鼠存活時間，呈劑量依賴性，結果具有顯著差異。表明本發明山銀花提取物具有抑制腫瘤生長和抗癌的作用。權利要求1、一種山銀花提取物，其特征在于所述提取物的主要成分為灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元和3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-齊墩果酸，重量比依次為42～10∶9～1∶12～1∶1，并且所述4種成分的總重量占該提取物的50％-100％。2、根據權利要求1所述的山銀花提取物，其中所述4種主要成分的重量比為27~14:5~1:9~1:1，所述4種成分的總重量占該提取物的70%-99.6%。3、一種藥物制劑，其特征在于如權利要求l所述的山銀花提取物與一種或多種藥學上可以接受的輔料制成。4、如權利要求3所述的制劑，其特征在于是可通過經腸道給藥或非腸道給藥的方式使用。5、如權利要求4所述的制劑，其特征在于為片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、噴霧劑、糖漿、合劑、凍干粉針劑、注射劑、噴霧劑等。6、根據權利要求1所述山銀花提取物的制備方法其特征在于取山銀花的花及花蕾，用極性溶劑提取，提取液回收溶劑，降溫至0—5攝氏度，過濾，濾液加w/v為0.5—50%的NaOH或KOH進行水解，用正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的PH值>7的堿性水溶液反萃取，將萃取后的溶液PH值調節為7，回收正丁醇溶液得到山銀花提取物。7、如權利要求6所述的制備方法，所述的山銀花可以選自灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬或細氈毛忍冬中的一種或多種。8、如權利要求6所述的制備方法，所述極性溶劑選自水、v/v為0—100%的甲醇或乙醇溶液中的一種或多種，所述水解的時間為3—15小時。9、如權利要求l所述的山銀花提取物的用途，其特征在于在制備預防和治療癌癥的藥物中的應用。10、如權利要求9所述的用途，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌、結腸癌、腹水癌、前列腺癌、骨癌或白血病等。全文摘要本發明設計一種山銀花提取物，該提取物的主要成分為灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元和3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-齊墩果酸。以及該類化合物的制備方法，和其在癌癥方面的應用。文檔編號A61P35/00GK101406509SQ20081023553公開日2009年4月15日申請日期2008年11月28日優先權日2008年11月28日發明者煦馮,敏印,鳴王,董云發,賈曉冬,趙興增,雨陳申請人:江蘇省中國科學院植物研究所