專利名稱：山茱萸提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種山茱萸提取物，還涉及該提取物的制備方法以及該提取物的醫藥用途，屬于中藥領域。
背景技術：
糖尿病是一種慢性全身進行性的內分泌代謝疾病，持續的高血糖會導致一些組織器官代謝異常，繼而引起其功能障礙及形態改變。糖尿病病程超過10年，大部分患者合并程度不等的血管并發癥，尤其是微血管并發癥。糖尿病微血管病變是指微循環障礙、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚，主要包括糖尿病腎病和糖尿病性視網膜病變，嚴重者可導致尿毒癥或失明，給患者造成了巨大的身心痛苦。因此，發現和研制防治糖尿病微血管病變、降低血糖的藥物具有重要意義。
山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zu cc.)具有補益肝腎、澀精固脫的作用，是臨床常用中藥，我國自古就有山茱萸應用于糖尿病(中醫稱為“消渴癥“)治療的記載。近年來，國內外學者對山茱萸進行了多方面的研究，從山茱萸中分離得到多個環烯醚萜苷類化合物，主要有馬錢素(1oganin)，莫諾苷(morroniside)，獐芽菜苷(sweroside)等，從山茱萸中還分離得到了熊果酸(ursonic acid)和齊墩果酸(oleanolic acid)等三萜酸類化合物。中國專利96109637.7公開了具有免疫抑制作用的山茱萸水煎提取物及其制備工藝。中國專利申請02159502.X公開了具有防治缺血性血管病作用的山茱萸水煎提取物及其制備方法。
但是，迄今為止，尚未見有同時得到山茱萸環烯醚萜總苷和總三萜酸兩個有效部位的制備工藝，也未見山茱萸提取物用于制備防治糖尿病血管病變和降低血糖藥物用途的報導。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種山茱萸提取物及其制備方法，以及該提取物的醫藥新用途。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下。
本發明所述的山茱萸提取物是通過下述方法獲得的提取物(1)山茱萸藥材用乙醇提取，合并乙醇提取液，過濾后減壓濃縮；(2)將濃縮液加水沉淀后離心，上清液減壓濃縮備用；(3)收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A；(4)將(2)得到的濃縮液上中等極性或非極性大孔吸附樹脂柱；(5)用去離子水洗脫除去雜質后，再用乙醇梯度洗脫；(6)收集乙醇洗脫液減壓干燥，粉碎后得到提取物B；(7)將提取物A和B均勻混合，即得粉末狀的山茱萸提取物。
上述提取方法的條件范圍為步驟(1)中乙醇濃度為10～90％，步驟(5)中乙醇濃度為20～70％，步驟(7)中提取物A和B按照重量比1∶3～8的比例均勻混合。
上述提取方法的優選條件范圍為步驟(1)中乙醇濃度為60％～90％，步驟(5)中乙醇濃度為30～50％。
在上述提取方法中，山茱萸提取物可以采用乙醇回流法、浸漬法和滲漉法提取。
本發明山茱萸提取物中，提取物A主要為環烯醚萜類化合物(iridoids)，提取物B主要為三萜酸(triterpene acids)類化合物。
本發明所說的山茱萸是山茱萸屬植物山茱萸Cornus officinalis Siebet Zucc.的成熟果肉，包括生藥和炮制品。
本發明對山茱萸提取物進行了薄層鑒別和含量測定。
(1)本發明提取物的薄層鑒別條件如下①提取物A中的馬錢素和莫諾苷薄層鑒別薄層板硅膠G板，展開劑氯仿-甲醇(7∶3)，顯色劑噴10％硫酸-乙醇后于105℃烘10分鐘，于日光下檢測可看到馬錢素和莫諾苷的斑點。
②提取物B中的熊果酸薄層鑒別薄層板硅膠G板，展開劑石油醚-醋酸乙酯(5∶5)，顯色劑噴10％硫酸-乙醇后于105℃烘10分鐘，置日光下檢測可看到熊果酸的斑點；或于紫外光燈(365nm)下觀察熒光，可看到熊果酸的亮黃色熒光。
(2)本發明提取物應用高效液相儀進行了定量分析，其含量測定條件如下①提取物A的色譜條件色譜柱PhenomenexLuna 5μmC18，250×4.60mm；流動相甲醇-水(30∶70)；流速1ml/min；檢測波長240nm；柱溫28℃。
經分析，提取物A中主要為環烯醚萜苷類化合物，其中包括馬錢子苷(loganin)，莫諾苷(morroniside)，獐芽菜苷(sweroside)等成分，其含量占本發明山茱萸提取物的50％以上。
②提取物B的色譜條件色譜柱Kromasil ODS-1(Zirchrom)5μmC18，250×4.60mm；流動相乙腈-甲醇-0.5％醋酸銨水(69∶15∶16)；流速1.2ml/min；柱溫30℃。
經分析，提取物B中主要為三萜酸類化合物，其中包括熊果酸(ursonic acid)和齊墩果酸(oleanolic acid)等成分，其含量占本發明山茱萸提取物的3.5％以上。
本發明山茱萸提取物的用途為在制備防治糖尿病血管病變和降低血糖藥物中的應用。
本發明的有益效果如下1.本發明的提取工藝簡便合理，可同時得到水溶性和脂溶性兩個有效部位。
2.經實驗證明，本發明山茱萸提取物在防治糖尿病血管并發癥、降低血糖方面有確切的療效，特別是用于治療糖尿病腎病和糖尿病視網膜病變等糖尿病微血管病變。所說的糖尿病微血管病變是指微循環障礙、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等，表現為結節性腎小球硬化型病變，彌漫性腎小球硬化型病變，腎小球基底膜增厚，蛋白排泄率增高；視網膜微血管瘤，出血，硬性滲出或棉絮狀滲出。所說的降低血糖是指降低糖尿病導致的血糖升高。
3.本發明提取物能降低糖尿病導致的血糖升高；顯著降低血清蛋白質糖基化終產物-肽(AGE-P)水平；降低尿微量白蛋白的排除量；降低血清早期蛋白質非酶糖化產物-果糖胺的生成量；改善糖尿病血管并發癥引起的血管內皮和腎組織形態學病理改變；抑制腎皮質AGEs的形成，使其受體mRNA表達水平下降，具有減輕糖尿病腎病變的作用；顯著降低糖尿病大鼠視網膜毛細血管的內周比，對實驗性糖尿病視網膜病變具有一定的防治作用；顯著增加血清SOD的含量，對由糖尿病血管并發癥引起的氧化應激損傷具有保護作用；顯著升高糖尿病血管并發癥大鼠血清NO、NOS的含量，并降低血漿ET含量，部分恢復NO和ET的動態平衡，保護血管內皮細胞；顯著降低糖尿病血管并發癥模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α的含量，有利于控制糖尿病血管并發癥的發生和發展。
實驗例1.山茱萸提取物對鏈脲佐菌糖尿病大鼠高血糖的治療作用實驗目的觀察本發明提取物對鏈脲佐菌糖尿病大鼠高血糖的治療作用實驗方法取正常大鼠80只，隨機取10只作為正常對照組，其余禁食24h，由大鼠腹腔注射新鮮配制的鏈脲佐菌素60mg/kg造成糖尿病模型，1周后(禁食12h)取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L并出現多飲、多尿、消瘦的大鼠則列為糖尿病模型動物。取糖尿病模型大鼠36只隨機分為3組，模型對照組(生理鹽水10ml/kg，ig.)，陽性對照氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)，發明提取物組(0.15g.kg-1，ig.)，另設10只作為正常對照組(生理鹽水10ml/kg，ig.)，連續12周，分別給藥并禁食2h后6周與12周測定空腹血糖。
實驗結果造模后大鼠血糖明顯升高，并出現多飲、多尿和消瘦的體征。用藥12周后，除正常對照組以外，各組均見不同程度的死亡，本發明提取物及氨基胍均能降低糖尿病大鼠血糖，以本發明提取物尤佳。結果見表1。
表1 山茱萸提取物對鏈脲佐菌糖尿病大鼠空腹血糖的影響(X±S)劑量動物數 血糖(mmol/L)組別(g.kg-1) (只) 藥前 藥后6周 藥后12周正常對照組 -10 5.0±1.1 5.1±1.1 5.3±1.1模型對照組 -821.4±2.4△△20.9±2.1△△20.6±1.4△△本發明提取物組 0.15 921.5±2.1△△18.1±1.7△△*##16.4±0.4△△**##氨基胍組0.1 821.4±2.2△△18.5±1.9△△*#16.6±0.6△△**##*p＜0.05**p＜0.01與模型組比較；#p＜0.05##p＜0.01與給藥前比較；△△p＜0.01與正常對照組比較。
表明本發明提取物對糖尿病大鼠具有一定的降糖作用。
實驗例2.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥大鼠血清、血清糖基化終產物-肽(AGE-P)水平的影響實驗目的觀察本發明提取物對糖尿病血管并發癥大鼠血清糖基化終產物-肽(AGE-P)水平的影響。
實驗方法取雄性SD大鼠，180～220g，在正常進食條件下，大鼠先以30mg.kg-1ip.STZ溶液，第二天再按0.11ml/只ip.弗氏完全佐劑(FCA)，每周1次，連續3周。3周后取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖≥16.7mmol/L者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組(生理鹽水10ml/kg，ig.)、氨基胍組(0.1g.kg-1)和本發明提取物組(0.15g.kg-1)，同期另設一正常組(生理鹽水10ml/kg，ig.)，各組連續ig.12周。給藥12周后大鼠眼眶取血，分離血清后運用流動注射分析技術檢測AGE-P水平。
實驗結果造模12周的糖尿病血管并發癥大鼠血清AGE-P水平較正常組顯著升高，而本發明提取物II組及氨基胍組均能顯著降低血清AGE-P水平(P＜0.01)，見表2。
表2對大鼠糖尿病血管并發癥血糖及血清AGE-P水平的影響(X±S)劑量 動物數血糖(mmol/L) AGE-P組別(g.kg-1) (只) 藥前 藥后 (mg.L-1)正常組 -8 4.9±0.5 4.9±0.5 2.8±0.4##模型組 -8 20.7±2.6##19.8±2.3##14.3±3.9##氨基胍組 0.1 8 20.6±2.3##17.7±1.5##9.1±0.9##**本發明提取物組 0.15 8 20.4±2.6##17.4±2.2##8.5±1.7##****p＜0.01與模型組比較；##p＜0.01與正常組比較本實驗結果表明本發明提取物組能顯著降低糖尿病血管并發癥模型大鼠血清AGE-P含量的作用(p＜0.01與模型組比較)，提示本發明提取物具有一定的治療糖尿病血管并發癥的AGE-P水平升高的作用。
實驗例3.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥大鼠血清果糖胺及尿微量白蛋白等的影響實驗目的觀察本發明提取物對糖尿病血管并發癥大鼠的作用。
實驗方法取雄性SD大鼠，體重為180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組(生理鹽水10ml/kg，ig.)、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)、本發明提取物組(0.15gkg-1，ig.)。同期另設一組正常對照組(生理鹽水10ml/kg，ig.)。各組連續灌胃12周。于給藥后第6、12周，分別測定大鼠血清果糖胺、尿微量白蛋白等，動態觀察糖尿病血管并發癥大鼠的演變及本發明提取物的防治作用。
實驗結果本發明提取物及氨基胍能顯著減少果糖胺及尿微量白蛋白(與模型組比較，P＜0.05，0.01)，結果見表3。
表3本發明提取物對糖尿病血管并發癥大鼠血清果糖胺及尿微量白蛋白等的影響(X±S)組別 劑量 動物數 血清果糖胺(mM) 尿微量白蛋白(mg.24h-1)(g.kg-1) (只) 6w 12w6w 12w正常組 -81.77±0.21 1.76±0.22 0.1±0.1 0.1±0.1模型組 -82.30±0.23##2.45±0.24##8.4±4.2##6.9±3.7##氨基胍組0.1 81.69±0.37**1.95±1.45**3.4±3.2*2.5±1.2**本發明提取0.15 81.82±0.39**1.88±0.34**2.6±1.6**2.5±1.4**物組##P＜0.01與正常組比較；*P＜0.05**P＜0.01與模型組比較本實驗表明本發明提取物組能顯著降低糖尿病血管并發癥模型大鼠果糖胺及尿微量白蛋白的形成(與模型組比較，P＜0.05，0.01)，提示其對糖尿病血管并發癥果糖胺及尿微量白蛋白的升高具有一定的抑制作用。
實驗例4.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥大鼠胸主動脈血管內皮及腎組織形態學的影響實驗目的從形態學的角度探討本發明提取物是否具有防治糖尿病血管并發癥的作用。
實驗方法腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)、本發明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另設一組正常對照組。各組連續灌胃12周。實驗結束后用掃描電鏡的方法觀察胸主動脈血管內皮通透性。內皮細胞的形態改變以及白細胞等在動脈壁內皮粘附等病理改變本文選用光鏡并經相應染色(如HE及PAS)。觀察腎小球的形態變化如基底膜增厚、糖原沉積、毛細血管擴張等用透射電鏡觀察腎小球基底膜等結構的改變。
實驗結果模型組各樣本在形態學上呈觀明顯的病理改變，如血管內皮細胞腫脹，細胞排列紊亂并向血管腔突起，內皮表面凹凸不平，相鄰細胞間有明顯的縫隙存在以致內皮通透性增高細胞表面粗糙，有很多紅細胞、細胞粘咐其表面腎小球體積明顯縮小并伴有彌漫性系膜增生，腎小球基底膜由正常圈襻狀擠壓成髓紋狀并增厚，球體毛細血管閉塞，而球囊相對擴大。腎小管有明顯空泡透明變性(AE變性)。腎間質中小動脈、入球細動脈玻變、增厚，血管內皮細胞腫脹并呈立方狀凸入管腔。而本發明提取物組上述病變明顯減輕，表現出較好的血管內皮保護作用及抗腎小球內基質增生、基底膜增厚等作用。表明本發明提取物具有改善糖尿病大鼠形態學病理改變的作用，我們推斷本發明提取物對糖尿病血管并發癥所引起的結構和功能改變都具有一定的防治作用。
實驗例5.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥大鼠腎皮質AGEs及其受體(RAGE)mRNA表達的影響實驗目的探討本發明提取物對糖尿病血管并發癥大鼠腎皮質AGEs的抑制作用，及在分子水平上探討其對腎皮質內AGEs受體(RAGE)mRNA轉錄水平的影響。
實驗方法取雄性SD大鼠，體重為180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組(生理鹽水10ml/kg，ig.)、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)、本發明提取物組(0.15g kg-1，ig.)。同期另設一組正常對照組(生理鹽水10ml/kg，ig.)。各組連續灌胃12周。實驗結束后取右腎皮質，根據AGEs具有產生熒光的特點，通過測定其熒光強度，間接表示腎皮質內AGEs的含量；用RT-PCR半定量的方法，體外擴增目的基因RAGE，并以β-action(house-keejping gene)作為內參，根據兩者結合的EB光密度積分的比值進行組間比較腎皮質內RAGE mRNA的表達情況。
實驗結果模型組AGEs沉積顯著增加，RAGE表達明顯上調。而本發明提取物在減少AGEs在腎皮質過度沉積的同時，亦能顯著抑制RAGE的過高表達。表明其具有減輕糖尿病腎病變的作用。結果見表4。
表4 本發明提取物對模型大鼠腎皮質AGEs及RAGF的影響(X±S)劑量 動物數 AGEs組別 RAGE(g.kg-1) (只)(AU/mg羥脯氨酸)正常組 -10 13.8±4.6 0.56±0.19模型組 -844.3±14.5##2.75±1.28##氨基胍組 0.1 922.8±4.2**1.23±0.39**本發明提取物 0.15 921.0±5.8**0.83±0.17**##p＜0.01與正常組比較；**p＜0.01與模型組比較。
本實驗表明本發明提取物在減少AGEs在腎皮質過度沉積的同時，亦能顯著抑制RAGE的過高表達，表明其具有減輕糖尿病腎病變的作用。
實驗例6.山茱萸提取物對糖尿病大鼠視網膜病變的影響實驗目的觀察本發明提取物對由STZ誘導的糖尿病視網膜病變的防治作用。
實驗方法取雄性SD大鼠，體重為180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mgkg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組(生理鹽水10ml/kg，ig.)、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)、本發明提取物組(0.15gkg-1，ig.)。同期另設一組正常組(生理鹽水10ml/kg，ig.)。各組連續灌胃12周。12周后，處死大鼠后立即取出眼球固定于4％甲醛溶液中24～48小時。沿赤道部切開眼球，去除前節及玻璃體，余下眼球分為6等分，小心剝離視網膜，流水沖洗24小時后，用3％胰酶(用PH7.4的Tris緩沖液配制)消化3～4小時，取出置蒸餾水中輕沖搖，分離出血管網，鋪于載波片上自然吹干。PAS加蘇木精染色，光鏡觀察。每張鋪片隨機取7個視野，于400倍下計數內皮細胞(EC)與周細胞(PC)數目及其灰度面積，并計算兩者的比值(E/P值)，同時觀察新生血管形成情況。
實驗結果模型組視網膜毛細血管內皮細胞數及其灰度面積均明顯高于正常大鼠，而周細胞數目則明顯減少，本發明提取物及陽性對照物氨基胍均能顯著降低糖尿病大鼠視網膜毛細血管的內周比(P＜0.01)，表明本發明提取物對實驗性糖尿病視網膜病變具有一定的防治作用。結果見表5。
表5 本發明提取物對糖尿病大鼠視網膜病變的影響(X±S)組別劑量 動物數 EC PC Ec area Pc areaE/PE/P(g.kg-1)(只)(n/view) (n/view)(um2)(um2)area- 8 21 27 0.8079.9 82.81.08正常組±5±6 ±0.22 ±24.2±29.4 ±0.44- 9 32 12 2.94135.0 85.11.77模型組±6## ±5##±1.07## ±47.6## ±39.4 ±0.71#
本發明提取 0.1510 24141.77 86.1 55.5 1.62物組±5**±5 ±0.43**±23.1**±15.5*±0.430.1 10 27151.92 100.2 65.9 1.59氨基胍組±6 ±5 ±0.29**±20.1*±23.3±0.27##P＜0.01與正常組比較；*P＜0.05**P＜0.01與模型組比較本實驗表明本發明提取物能顯著降低糖尿病大鼠視網膜毛細血管的內周比，表明其對實驗性糖尿病視網膜病變具有一定的防治作用。
實驗例7.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥模型大鼠血清SOD的影響實驗目的通過對血清SOD值的變化分析，初步探討出SFZ誘導的糖尿病血管并發癥大鼠模型的氧化應激觀象，以及本發明提取物的保護作用。
實驗方法腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig)、本發明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另設一組正常對照組。各組連續灌胃12周。試驗結束后用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD的含量。
表6本發明提取物對模型大鼠血清SOD的含量的影響(X±S)劑量 動物數組別 SOD(活性/U.mL-1)(g.kg-1) (只)正常組 - 10 50.5±5.0模型組 - 8 38.9±4.5##氨基胍組 0.1 9 48.8±5.2**本發明提取物 0.15 8 47.5±5.4**##p＜0.01與正常組比較；**p＜0.01與模型組比較。
實驗結果造模12周后，糖尿病血管并發癥模型大鼠血清SOD值較正常組顯著降低；而本發明提取物及氨基胍均能顯著增加SOD的含量。本實驗表明本發明提取物對由糖尿病血管并發癥引起的氧化應激損傷具有保護作用。
實驗例8.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥大鼠NO、NOS和ET的影響實驗目的探討環山茱萸提取物對NO、NOS、ET的影響，以了解其對糖尿病血管并發癥大鼠的作用及作用機理。
實驗方法腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)、本發明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另設一組正常對照組。各組連續灌胃12周。實驗結束后取血，測定大鼠血清NO、NOS和血漿ET。
表7本發明提取物對模型大鼠血清NO、NOS和血漿ET的影響(X±S)劑量動物數組別 (g.kg-NO/μmol.L-1NOS/U.mL-1ET/pg.mL-1(只)1)正常組 -10 68.55±7.44 0.66±0.08 64.55±17.12模型組 -842.13±7.46##0.39±0.06##132.15±33.77##氨基胍組0.1 963.55±8.12**0.54±0.12*78.45±18.34**本發明提取物0.15 860.12±10.43**0.53±0.10*76.15±18.18**##p＜0.01與正常組比較；*p＜0.05，**p＜0.01與模型組比較。
實驗結果模型組與正常組比較，NO、NOS含量顯著降低(P＜0.01，p＜0.05)，ET含量顯著升高(P＜0.01)而本發明提取物組與氨基胍組均能顯著升高糖尿病血管并發癥大鼠血清NO、NOS的含量，并降低血漿ET含量。本實驗表明本發明提取物可部分恢復NO和ET的動態平衡，保護血管內皮細胞，對糖尿病血管并發癥具有改善作用。
實驗例9.山茱萸提取物對糖尿病血管并發癥大鼠sICAM-1、TNF-α的影響實驗目的探討本發明提取物對糖尿病血管并發癥大鼠血清可溶性細胞間粘附分子(slCAM-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，分析本發明提取物防治糖尿病血管；并發癥的作用及其作用機理。
實驗方法腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾靜脈血用血糖儀測血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠。按血糖值范圍隨機分為模型組、氨基胍組(0.1g.kg-1，ig.)、本發明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另設一組正常對照組。各組連續灌胃12周后，取血清用相應的EIA Kit分別測定slCAM-1、TNF-α的含量。
表8本發明提取物對模型大鼠血清slCAM-1、TNF-α的影響(X±S)劑量動物數組別 (g.kg-sIAM-1(pg.ml-1) TNF-α(pg.ml-1)(只)1)正常組- 100.35±0.075.5±1.2模型組- 8 0.82±0.07##9.7±2.5##氨基胍組 0.1 9 0.45±0.12**5.8±2.7**本發明提取物 0.158 0.46±0.09**5.9±1.9**##p＜0.01與正常組比較；**p＜0.01與模型組比較。
實驗結果糖尿病血管并發癥模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α較正常組上調，而本發明提取物及氨基胍均能顯著降低糖尿病血管并發癥模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α的含量。這一作用可能有利于控制糖尿病血管并發癥的發生和發展。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明進行詳細描述。但是，本發明不局限于所給出的這些實施例。
實施例1將山茱萸藥材1000g用乙醇回流提取3次，乙醇濃度70％，加醇量為藥材重量的15倍，提取時間120min，提取溫度80℃。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液加4倍量水沉淀后離心，收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A，將離心后的上清液減壓濃縮備用。
取非極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1∶1的比例裝柱，然后將上述備用的濃縮液以1柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再用30％和50％乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為2柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥粉碎后得到提取物B。
將上述提取物A和B按照重量比1∶6的比例混勻后得到山茱萸提取物，得率為7.02％。
實施例2將山茱萸藥材1000g用乙醇回流提取2次，乙醇濃度85％，加醇量為藥材重量的12倍，提取時間90min，提取溫度75℃。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液加5倍量水沉淀后離心，收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A，將離心后的上清液減壓濃縮備用。
取中等極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1∶2的比例裝柱，然后將上述備用的濃縮液以1.5柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再用50％～70％乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為3柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥粉碎后得到提取物B。
將上述提取物A和B按照重量比1∶5的比例混勻后得到山茱萸提取物，得率為6.98％。
實施例3將山茱萸藥材1000g粉碎后過40目篩，用20％乙醇浸漬48小時后滲漉提取，流速4～5毫升/分鐘，滲漉量為藥材重量的10倍。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液加4倍量水沉淀后離心，收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A，將離心后的上清液減壓濃縮備用。
取中等極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1∶3的比例裝柱，然后將上述備用的濃縮液以1柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再用30％～70％乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為2柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥粉碎后得到提取物B。
將上述提取物A和B按照重量比1∶7的比例混勻后得到山茱萸提取物，得率為6.01％。
實施例4將山茱萸藥材1000g粉碎后過30目篩，用60％乙醇浸漬36小時后滲漉提取，流速3～4毫升/分鐘，滲漉量為藥材重量的12倍。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液加6倍量水沉淀后離心，收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A，將離心后的上清液減壓濃縮備用。
取非極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1∶2的比例裝柱，然后將上述備用的濃縮液以1.5柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再用50％～80％乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為2.5柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥粉碎后得到提取物B。
將上述提取物A和B按照重量比1∶4的比例混勻后得到山茱萸提取物，得率為5.94％。
實施例5將山茱萸藥材1000g粉碎后過30目篩，用乙醇浸漬法提取。乙醇濃度60％，加醇量為藥材重量的5倍，浸漬時間72小時，提取3次。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液加5倍量水沉淀后離心，收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A，將離心后的上清液減壓濃縮備用。
取中等極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1∶1的比例裝柱，然后將上述備用的濃縮液以0.5柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再用30％～70％乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為2柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥粉碎后得到提取物B。
將上述提取物A和B按照重量比1∶5的比例混勻后得到山茱萸提取物，得率為5.79％。
實施例6將山茱萸藥材1000g粉碎后過20目篩，用乙醇浸漬法提取。乙醇濃度50％，加醇量為藥材重量的6倍，浸漬時間96小時，提取2次。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液加4倍量水沉淀后離心，收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A，將離心后的上清液減壓濃縮備用。
取非極性性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1∶1.5的比例裝柱，然后將上述備用的濃縮液以1柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再用30％～50％乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為3柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥粉碎后得到提取物B。
將上述提取物A和B均勻混合后得到山茱萸提取物，得率為5.67％。
以上實施例所得山茱萸提取物，經高效液相色譜儀分析，提取物A中主要為環烯醚萜苷類化合物，其中包括馬錢子苷(loganin)，莫諾苷(morroniside)，獐芽菜苷(sweroside)等成分，其含量占本發明山茱萸提取物的50％以上；提取物B中主要為三萜酸類化合物，其中包括熊果酸(ursonic acid)和齊墩果酸(oleanolic acid)等成分，其含量占本發明山茱萸提取物的3.5％以上。
權利要求
1.一種山茱萸提取物，其特征在于所說的提取物是通過下述方法獲得的提取物(1)山茱萸藥材用乙醇提取，合并乙醇提取液，過濾后減壓濃縮；(2)將濃縮液加水沉淀后離心，上清液減壓濃縮備用；(3)收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A；(4)將(2)得到的濃縮液上中等極性或非極性大孔吸附樹脂柱；(5)用去離子水洗脫除去雜質后，再用乙醇梯度洗脫；(6)收集乙醇洗脫液減壓干燥，粉碎后得到提取物B；(7)將提取物A和B均勻混合，即得粉末狀的山茱萸提取物。
2.根據權利要求1所述的提取物，其特征是所說的提取物是通過乙醇回流提取法獲得的提取物。
3.根據權利要求1所述的提取物，其特征是所說的提取物是通過乙醇滲漉提取法獲得的提取物。
4.根據權利要求1所述的提取物，其特征是所說的提取物是通過乙醇浸漬提取法獲得的提取物。
5.根據權利要求1所述的提取物，其特征是所說的提取物是通過下述方法獲得的提取物步驟(1)中乙醇濃度為10～90％，步驟(5)中乙醇濃度為20～70％，步驟(7)中提取物A和B按照重量比1∶3～8的比例均勻混合。
6.根據權利要求5所述的提取物，其特征是所說的提取物是通過下述方法獲得的提取物步驟(1)中乙醇濃度為60％～90％，步驟(5)中乙醇濃度為30～50％。
7.一種山茱萸提取物的制備方法，其特征是包括下列步驟(1)山茱萸藥材用乙醇提取，合并乙醇提取液，過濾后減壓濃縮；(2)將濃縮液加水沉淀后離心，上清液減壓濃縮備用；(3)收集沉淀減壓干燥，粉碎后得到提取物A；(4)將(2)得到的濃縮液上中等極性或非極性大孔吸附樹脂柱；(5)用去離子水洗脫除去雜質后，再用乙醇梯度洗脫；(6)收集乙醇洗脫液減壓干燥，粉碎后得到提取物B；(7)將提取物A和B均勻混合，即得粉末狀的山茱萸提取物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征是乙醇提取采用回流提取法。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征是乙醇提取采用滲漉提取法。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征是乙醇提取采用浸漬提取法。
11.根據權利要求7所述的方法，其特征是步驟(1)中乙醇濃度為10～90％，步驟(5)中乙醇濃度為20～70％，步驟(7)中提取物A和B按照重量比1∶3～8的比例均勻混合。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征是步驟(1)中乙醇濃度為60％～90％，步驟(5)中乙醇濃度為30～50％。
13.山茱萸提取物在制備防治糖尿病血管病變和降低血糖藥物中的應用。
14.根據權利要求13所述的山茱萸提取物在制備藥物中的應用，其特征是所說的糖尿病血管病變包括糖尿病微血管病變。
15.根據權利要求14所述的山茱萸提取物在制備藥物中的應用，其特征是所說的糖尿病微血管病變包括糖尿病腎病和糖尿病視網膜病變。
全文摘要
山茱萸提取物及其制備方法和用途，包括山茱萸藥材用乙醇提取，提取液減壓濃縮后加水沉淀，收集沉淀減壓干燥，得到提取物A；上清液上大孔吸附樹脂柱，水洗脫除去雜質，乙醇梯度洗脫，收集洗脫液減壓干燥，得到提取物B；將提取物A和B均勻混合，即得本發明山茱萸提取物，其醫藥新用途為在制備防治糖尿病血管病變和降低血糖藥物中的應用。
文檔編號C07H17/00GK1569119SQ200410014769
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月28日 優先權日2004年4月28日
發明者肖偉, 潘揚, 丁崗, 章晨峰, 韓淑燕, 曹亮 申請人:江蘇中康新藥指紋圖譜開發有限公司