專利名稱：：兩親性聚合物和屬于bmp家族的成骨蛋白之間的復合物的制作方法兩親性聚合物和屬于BMP家族的成骨蛋白之間的復合物本發明涉及兩親性聚合物和屬于骨形態發生蛋白(BMP)家族的成骨蛋白之間的水溶性原始復合物的形成，所述復合物是在物理和化學上穩定的并因此改善了在體外和在體內BMP的物理和化學穩定性。骨形態發生蛋白(BMP)是參與骨誘導機制的生長因子。也稱為成骨蛋白(OP)的BMP最初于1965年由Urist進行了表征(UristMR.Science1965；150,893)這些從骨密質分離出的蛋白質具有在許多動物中誘導骨形成的能力(UristMR.Science1965；150,893)。BMP以前肽的形式進行表達，后者在翻譯后成熟之后，具有104至139個殘基的長度。它們彼此之間具有很大的序列同源性并且具有類似的三維結構。特別地，它們具有6個在形成“半胱氨酸結(cysteineknot)，，的分子內二硫鍵中所牽涉的半胱氨酸殘基(ScheuflerC.2004J.Mol.Biol.1999；287，103；SchluneggerMP,J.Mol.Biol.1993；231，445)。它們中的某些具有還在導致二聚體形成的分子間二硫鍵中所牽涉的第7個半胱氨酸(ScheuflerC.2004J.Mol.Biol.1999；287103)。在其活性形式下，BMP裝配成同二聚體，甚至異二聚體，如Israel等人所描述的那樣(IsraelDI，GrowthFactors.1996；13(3-4)，291)。二聚體BMP與BMPR類型的跨膜受體相互作用(Mundy等人，GrowthFactors，2004，22(4)，233)。該識別引發尤其牽涉Smad蛋白的細胞內信號傳導級聯，如此導致靶基因的激活或抑制。BMP(除了BMP1禾Π3夕卜)對于間充質細胞的分化起著直接或間接的作用，導致它們分化為成骨細胞(ChengH.,J.BoneandJointSurgery,2003,85A1544-1552)。此外，它們還具有趨化性并且誘導增殖、分化和血管發生。某些重組人BMP，尤其是rhBMP-2和rhBMP_7，清楚地顯示出在人中于體內誘導骨形成的能力并且已被批準用于某些醫學應用。因此，將重組人BMP-2(根據國際通用命名為代勃特明-α)配制在以inFUSE的名稱(在美國)和以InductOs的名稱(在歐洲)進行銷售的產品中。該產品被指定用于腰椎的融合和脛骨的骨再生(對于稱為骨不連合的骨折)。在用于腰椎融合的InFUSE的情況下，外科手術首先在于用rhBMP-2的溶液浸透膠原海綿，然后將海綿放置入預先植入到椎骨之間的空心支架(LT支架)中。重組人BMP-7(根據國際通用命名為依托特明-α)具有與BMP-2相同的治療適應癥并且構成了兩種產品的基礎用于脛骨的開放性骨折的0Ρ-1Implant和用于腰椎融合的0P-1Putty。OP-IImplant由待接納在0.9%鹽水溶液中的包含rhBMP-7和膠原的粉末組成。然后，將所獲得的糊狀物在外科手術期間應用在骨折處。0P-1Putty以兩種粉末的形式存在一種包含rhBMP-7和膠原，另一種包含羧甲基纖維素(CMC)。在外科手術過程中，CMC用0.9%鹽水溶液進行重構并與rhBMP-7和膠原相混合。將如此獲得的糊狀物應用在待處理的部位上。在目前已商業化的所有蛋白質中，BMP由于其強烈的疏水性和其聚集的能力(這導致在生理PH下非常低的溶解度)而顯得突出。在BMP-2的情況下，這些性質已在為了其臨床開發而進行的研究的范圍內被證明。它們在生理條件下溶解性差并且具有聚集的傾向(Schmoekel，2004J.Orthop.Res.2004；22(2)，376；Friess,W.，DrugDeliverySystemsBasedonCollagen,ShakerVerlag,ThesisAachenGermany1999；SchwartzDH,ThesisMunchenGermany2005)。因此，Abbatiello禾口Porter(ProteinSci.1997,6,Suppl299)已顯示，在低離子強度的緩沖液中，當PH增加至4.5以上時，BMP-2變得越來越不溶。對于高于6.5的pH，觀察到蛋白質發生沉淀，但在氯離子和/或硫酸根離子存在下在稍低的pH下(pH5.8,50mMNaCl；和ρΗ5·5,5mMNa2SO4)也觀察到沉淀，正如由Friess(Friess，W.，DrugDeliverySystemsBasedonCollagen,ShakerVerlag,ThesisAachenGermany1999)所顯示的。因此，在生理條件下BMP-2的配制完全是一個問題。BMP的物理不穩定性這個問題的另一個例子由Biopharm在專利US2004132653中用BMP-14類的蛋白質GDF-5(生長和分化因子(GrowthandDifferentiationFactor)，也稱為MP-52)進行了揭示。GDF-5的性質與BMP-2非常相似，并且已觀察到凍干物的不穩定性，所述凍干物具有在溶液重構過程中凝縮和不能完全再溶解的傾向。這兩個現象與蛋白質的不可逆聚集有關。為了解決這個問題，在凍干之前添加甘露醇，從而使得能夠在固體狀態下防止這些問題。然而，甘露醇僅提供了體外的低的穩定化而不能防止體內的物理不穩定性。考慮到由這些生長因子的物理性質所施加的約束，產品InFUSE應當在酸性pH(乙酸緩沖液，pH4)下和在表面活性劑聚山梨醇酯80存在下進行配制，以便確保rhBMP-2的溶解性和物理穩定性。然而，基于治療性蛋白質的藥物的制造商極度地受到所述蛋白質的物理穩定性問題的困擾。這是因為，BMP聚集體的形成可以導致生物學活性種類的數量的減少，生物活性或吸收速度的改變，針對這些聚集體的可能的免疫應答，由于產品的乳光而引起的不希望的外觀，·過濾設備和注射裝置的阻塞。為了獲得的所希望的治療效果，必需采用非常大的、高于生理劑量10000倍的BMP的治療劑量。這種情況特別是在用產品例如InFUSE進行椎骨融合的治療時，因為施用幾毫克的rhBMP-2。這種待施用的BMP的巨大數量意味著必須在大約1.5mg/ml的BMP溶液的高濃度下進行工作。在這樣的濃度，BMP非常容易聚集，因而不是在物理上穩定的。所提供的溶液采用酸性緩沖液和表面活性劑。然而，從治療應用的角度看，采用酸性且包含表面活性劑的溶液是有問題的。已開發了幾種方法以解決物理和化學穩定性的這些問題。首先，公知肝素和硫酸乙酰肝素用于使生長因子(包括BMP)穩定，因為這些多糖是內源的穩定分子(Ruppert等人，Eur.J.Biochem.1996，237，295)。然而，肝素和硫酸乙酰肝素具有非常強的抗凝和抗補體活性，因而不能用于藥物組合物。Hubbell描述了蛋白質的嫁接方法，其在于在蛋白質和載體之間形成化學鍵以便在纖維蛋白類型的基質中穩定所述蛋白質。所述鍵借助于可被酶切割的融合蛋白來建立。在出版物Biotechno.Bioeng.2005，89，3，253中所報道的這種方法使得能夠通過阻止聚集而有效地在物理上穩定該蛋白質。然而，該方法導致采用了BMP-2的類似物，其迄今還未顯示出其治療效力和其無害性。在專利US20050209145中，Stupp等人描述了用于生長因子(特別是BMP-2)的載體化的兩親性肽。這些兩親性肽由末端烷基鏈、親水性肽序列和允許BMP-2的粘附的表位構成。這些肽在溶液中進行組織排列，從而形成小棍類型的大分子結構，其中疏水基團重集聚在中心。周圍的氨基酸使得能夠提供與水的相容性和蛋白質的粘附。然而，這些肽由于其復雜的一級結構而具有免疫風險。在專利US6258382中，Takaoka等人所感興趣的是BMP的載體化以用于骨再生的應用。這些作者開發出了基于乳酸和/或乙醇酸、對-二氧雜環己酮、聚乙二醇的新型聚合物，其允許控制這些蛋白質的釋放。然而，這些作者沒有解決任何在物理或化學穩定性方面的與該生長因子有關的問題。此外，這些聚合物在水中是不溶的，但吸附水從而形成凝膠。相反地，這些聚合物在有機介質中是可溶的，并且溶于丙酮。因此，聚合物-BMP-2制劑的制備需要采用有機溶劑，這意味著蛋白質變性的風險(NatureBiotechnology,2001,19,332)0在專利US2005/0287135中，Wyeth描述了通過疏水基團(芐醇)進行修飾的乙酰透明質酸，用于BMP的載體化。在這些聚合物中，疏水基團的比率為50至100%，以致該聚合物在水中不溶但是可以吸附水。在這種情況下，這些吸濕的聚合物不能與該蛋白質形成水溶性復合物，以便使得能夠解決BMP的穩定性問題。在FidiaetGeneticslnstitute的EP1454640中，也描述了相同類型的制劑，然而，所描述的制劑不形成復合物，所例示的多糖不溶于水并且包含多于50%的疏水性酯基團。在專利NZ530701中，Brodbeck等人采用PLAGA來用于BMP的載體化。這些聚合物在水中不溶，因此不能與該蛋白質形成水溶性復合物。與申請人相反，所述作者的目標是使在由PLAGA構成的固體中的BMP不溶于水性介質，這仍需要采用有機溶劑，這意味著蛋白質變性的風險。作為例子，可以提及以題目“Effectsofheparin-likepolymersassociatedwithgrowthfactorsonosteoblastproliferationandphenotypeexpression",1998,J.Biomed.Mater.Res.，第44卷，第63-72頁發表的Blanquaert等人和Barritault等人的工作，其描述了用被認為與各種生長因子相互作用的芐胺進行修飾的葡聚糖的用途。所述聚合物被描述為本身具有治療活性。這些作者還聲稱，這些葡聚糖中的某些，更特別是用羧甲基(CM)、芐基酰胺(B)和磺酸(S)基團取代的葡聚糖，(化合物CMDBS)，使得能夠在不添加生長因子的情況下刺激骨重建(1995，Bone,17，6，499-506)。根據類似的方法，在專利FR2794649中，Blanchat等人描述了用芐胺進行修飾的葡聚糖和通過借助于磷酸三甲酯使聚合物鏈交聯而變得不溶的硫酸酯。這些在水性介質中的海綿充當BMP的儲庫，因為它們能夠保留住該蛋白質。在交聯之前，兩親性聚合物與BMP-2形成復合物，如在通過凝膠電泳進行的相互作用分析中所顯示的那樣。然而，所用的聚合物/BMP的質量比非常高，大于5000。采用這樣的高比例是由于非常弱的聚合物/蛋白質相互作用，其導致復合物在溶液中解離。此外，沒有證明BMP的化學或物理穩定性。此種比例對于開發藥物產品來說是主要障礙。還已知芐胺可能具有一定的毒性和可能損害在前面提及的兩篇專利中所描述的聚合物的生物相容性。用于骨重建的此類蛋白質的蓋侖氏制劑應當必須滿足賦形劑的無害性要求，并且為了到達這些要求，必需使用生物相容性化合物但還要限制其相對于活性成分的量。因此，開發出允許使成骨蛋白例如BMP增溶和穩定的可注射制劑這一問題沒有得到滿意解決，所述BMP選自BMP-2(代勃特明-α)、ΒΜΡ_4、ΒΜΡ_7(依托特明-α),BMP-14和GDF-5o本發明使得能夠在成骨蛋白和生物相容性兩親性聚合物之間以低于700的聚合物/BMP質量比形成穩定的水溶性復合物。該復合物使得能夠避免在體外和在體內在生理pH下由于其疏水性而發生的BMP聚集，在37°C下在細胞存在下穩定BMP。該水溶性復合物在完全水性的介質中形成，而無需憑借于使用有機溶劑。因此，本發明涉及在物理和化學上穩定的、可溶于水的兩親性聚合物-BMP復合物，其特征在于■所述兩親性聚合物由通過疏水取代基和親水基團進行官能化的親水性多糖骨架構成，根據下述通式I:Jm1「Iηγη「η1FF'Y一ιIL」yDP=m個單體單元RR'γIιΓIHyΧL」nLJO_JhL·R,R'，相同或不同，并且表示鍵或包含1至18個碳的鏈，所述鏈任選地是支化的和/或不飽和的，且包含一個或多個雜原子例如0、N或/和S，#F,F'，相同或不同，并且表示酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚或胺，·X表示親水基團，其選自羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，·Y表示親水基團，其選自硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，·Hy表示疏水基團，其選自下列〇線性或支化的C8-C3tl烷基，其任選地是不飽和的和/或包含一個或多個雜原子例如0、N或S，〇線性或支化的C8-C18烷基芳基或芳基烷基，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個或多個雜原子例如0、N或S，〇C8-C30多環，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個或多個雜原子例如0、N或S，〇芐胺除外，眷11和0為1至3，·h表示疏水基序相對于糖單元而言的摩爾份數，其為0.01至0.5，·χ表示親水基團相對于糖單元而言的摩爾份數，其為0至2.0，·y表示親水基團相對于糖單元而言的摩爾份數，其為0至0.5，■所述BMP選自在治療上有活性的BMP(骨形態發生蛋白)，■聚合物/BMP的質量比小于或等于700。在一個實施方案中，在根據本發明的復合物中，所述多糖選自如前面所定義的通式I的多糖，其中y=0。在一個實施方案中，在根據本發明的復合物中，所述多糖選自如前面所定義的通式I的多糖，其中X表示羧酸根。在一個實施方案中，在根據本發明的復合物中，根據本發明的多糖的特征在于基團R選自下列基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>在一個實施方案中，本發明涉及復合物，其特征在于，聚合物/BMP的質量比小于或等于600。在一個實施方案中，本發明涉及復合物，其特征在于，聚合物/BMP的質量比小于或等于500。治療用途的BMP的濃度為在溶液中大約1.5mg/ml。當所述比例大于700時，獲得包含1.0g/ml的兩親性聚合物的組合物。基于這樣的聚合物濃度，制劑具有不再適合于藥學應用的物理化學行為，例如在粘度方面。本發明涉及復合物，其特征在于，所述BMP選自BMP_2(代勃特明-α)、BMP-4、ΒΜΡ-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。所述兩親性聚合物的取代基以受控方式或隨機方式分布。在具有取代基的受控分布的聚合物中，可以提及例如嵌段共聚物和交替共聚物。無規共聚物*一單體一單體——單體一單體一單體一單體—*III疏水物疏水物疏水物嵌段共聚物*一單體一單體一單體一單體一單體一單體一*III疏水物疏水物疏水物交替共聚物*一單體一單體一單體一單體一單體一單體一*III疏水物疏水物疏水物因此，在一個實施方案中，本發明還涉及兩親性聚合物-BMP復合物，其特征在于，所述聚合物選自其取代基以隨機方式分布的聚合物。在一個實施方案中，所述多糖選自乙酰透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖、聚半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素。纖維素的組由通過酸進行官能化的纖維素例如羧甲基纖維素構成。葡聚糖的組由通過酸進行官能化的葡聚糖例如羧甲基葡聚糖構成。在一個實施方案中，所述多糖選自乙酰透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖。這些不同的多糖可以如下來表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>聚半乳糖醛酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>殼聚糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>藻酸鹽。所述多糖可以具有10至10000的平均聚合度。在一個實施方案中，所述多糖具有10至1000的平均聚合度。在另一個實施方案中，所述多糖具有10至500的平均聚合度。在一個實施方案中，本發明還涉及兩親性聚合物-BMP復合物，其特征在于，所述疏水基團Hy選自天然來源的疏水氨基酸或者其醇、酯、脫羧基或酰胺衍生物，所述天然來源的疏水氨基酸選自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。在一個實施方案中，本發明還涉及兩親性聚合物-BMP復合物，其特征在于，所述疏水基團Hy是色氨酸或者色氨酸的酯或酰胺衍生物。在色氨酸的衍生物中，可提及色氨醇(tryptophanol)、色氨酰胺(tryptophanamide)、2_吲哚乙胺。在一個實施方案中，根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物是可逆的。所使用的聚合物按照本領域技術人員已知的技術來合成，或者從制造商例如Sigma-Aidrich、N0FCorp.或CarboMerInc.購買。所述BMP選自重組人BMP，其按照本領域技術人員已知的技術獲得，或者從制造商例如ResearchDiagnosticInc.(USA)公司購買。BMP是非常疏水的生長因子。在生理pH下，該蛋白質的疏水性導致聚集，然后導致沉淀。根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物使得能夠在物理上穩定在處于生理pH的溶液中的該蛋白質。“物理或化學降解”是指任何物理范疇的事件，例如聚集，或者化學范疇的事件，例如蛋白水解，其導致該蛋白質的生物學活性降低。平行地，“蛋白質的物理或化學穩定化”是指保持該蛋白質的生物學活性的動作。復合物的穩定性通過測量BMP的穩定性來進行監測。因此，可以尤其是通過進行下列測試來證明通過兩親性聚合物的該蛋白質的穩定化通過凝膠混合電泳來揭示兩親性聚合物-BMP復合物的測試，在37°C和中性pH下進行的在兩親性聚合物-BMP復合物中在細胞存在下BMP的熱穩定性的測試，在生理PH下在所述復合物中BMP的物理穩定化的測試。通過凝膠混合電泳來揭示兩親性聚合物-BMP復合物的測試基于在電場的影響下離子的移動。陰離子復合物向陽極遷移，而陽離子復合物向陰極移動。在遷移后，通過毛細管作用將蛋白質轉移到PVDF膜上，并且通過該蛋白質的特異性抗體(其被與過氧化物酶相偶聯的二抗所識別)來揭示。單獨的蛋白質不遷移；與兩親性聚合物相復合的蛋白質依照該復合物的總電荷而向陽極或陰極遷移。在細胞存在下BMP的熱穩定性的測試在37°C和中性pH下進行，并且在于將BMP的溶液放置入包含成肌細胞C2C12的培養基中。在放置后(J2)和在5天的培養結束時(J7)通過ELISA測定法來測定BMP溶液的濃度。通過測定在成肌細胞分化為成骨細胞的過程中在J2和J7之間所產生的堿性磷酸酶的活性來評價BMP的生物學活性。生理pH下BMP的物理穩定化的測試基于通過將蛋白質的初始緩沖液(通常在酸性pH下)與pH7.4的PBS溶液進行交換來將蛋白質溶液帶至生理pH。進行三次交換，同時保持BMP在交換結束時處于恒定的濃度。在該過程結束時，通過在離心后進行ELISA測定法來測定溶液中BMP的濃度。該測試還可以通過用固定在pH7.4的緩沖液稀釋濃縮的BMP-2溶液來進行。通過在不存在任何能夠使該蛋白質變性的有機溶劑的情況下，在生理pH下將BMP和兩親性聚合物制成水溶液來形成根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物。兩親性聚合物-BMP復合物的形成是自發的，并且不牽涉BMP和兩親性聚合物之間的共價鍵。這種締合通過弱鍵來進行，所述弱鍵主要是疏水相互作用和離子相互作用。復合物的這種形成不需要任何有機溶劑。任選地，可以布置其他測試以完善根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物的證明。·BMP的三級結構的維持的測試，通過圓二色性來測定。在生理pH和脅迫下，在根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物中BMP的穩定性的測試。所述脅迫可以是特定的攪拌方式、鹽的存在，等等。對于蛋白水解酶例如嗜熱菌蛋白酶的抗性的測試。通過本發明解決的問題之一是增加了蛋白質的穩定化，并因此在體外和在體內保持了生物學活性。該生物學活性可以通過能夠顯示BMP使成肌細胞分化為成骨細胞的能力的各種測試來進行評價。所述分化可以通過下列方式來測量測定在細胞培養物中所產生的堿性磷酸酶的活性，產生堿性磷酸酶的細胞的著色，在細胞培養物中所產生的骨鈣蛋白的RNA的RT-PCR。本發明還涉及治療組合物，其特征在于，所述治療組合物包含根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物。“治療組合物”是指在人類醫學或獸醫學中可用的組合物。優選地，根據本發明的藥物組合物是局部應用的組合物，其可以以溶液、凝膠、霜劑、凍干物、粉劑或糊劑的形式存在。能夠與根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物一起進行配制的賦形劑的種類根據蓋侖氏醫學學者(galSniste)的常識依照該復合物的呈現形式來進行選擇。因此，當根據本發明的組合物以糊劑的形式存在時，該糊劑可以例如從諸如羧甲基纖維素(CMC)、磷酸三鈣和膠原的產品來獲得。為了調節該制劑的參數，在本發明中可以使用其他賦形劑，例如用于調節pH的緩沖液，使得能夠調節等滲性的試劑，防腐劑例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、間甲酚或苯酚，或者抗氧化劑例如鹽酸L-賴氨酸。根據本發明，所述治療組合物的特征在于，所述治療組合物使得能夠施用大約1.5mg/ml的BMP。本發明還涉及根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物在制備用于在體內誘導骨形成的治療組合物中的用途。本發明還涉及用于人或獸醫學使用的治療性治療方法，其特征在于，所述方法在于在治療部位處施用包含根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物的治療組合物。兩親性聚合物的合成實施例1通過色氨酸乙酯進行修飾的羧甲基葡聚糖(PA1)從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩爾質量的羧甲基葡聚糖開始來合成該兩親性聚合物。根據采用氯甲酸乙酯和N-甲基嗎啉的在有機溶劑中的常規偶聯方法，將色氨酸乙酯嫁接到該聚合物的酸上。在將反應介質在水中進行稀釋并通過添加INNaOH將pH調節至7后，通過超濾來純化該聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TrpOEt/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過1HNMR而測定的，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過電勢分析法而測定的。實施例2通過色氨酸(鈉鹽)進行修飾的羧甲基葡聚糖(PA2)通過PA1的堿性水解來獲得該兩親性聚合物。向兩親性聚合物1的水溶液(64ml，31mg/ml)中添加IN氫氧化鈉(3.79ml)以達到pH12.7。將所獲得的溶液在環境溫度下攪拌過夜。通過逆水(0.9%NaCl和H2O)進行透析來純化該聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TrpONa/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過1HNMR而測定的，X1.0的以“羧酸根(甲基羧酸根，色氨酸的羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過電勢分析法而測定的。實施例3通過苯丙氨酸乙酯進行修飾的羧甲基葡聚糖(PA3)根據實施例1，從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩爾質量的羧甲基葡聚糖開始來合成該兩親性聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“PheOEt/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過1HNMR而測定的，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過電勢分析法而測定的。實施例4通過酪氨酸甲酯進行修飾的羧甲基葡聚糖(PA4)根據實施例1，從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩爾質量的羧甲基葡聚糖開始來合成該兩親性聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TyrOMe/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過1HNMR而測定的，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過電勢分析法而測定的。實施例5通過色氨酸乙酯進行修飾的葡聚糖琥珀酸(PA5)從根據(Sanchez-Chaves,Manuel等人，Polymer1998，39(13)，2751-2757)的文章獲得的具有1.0的以“琥珀酸/糖單元”表示的取代度和70kg/mol的平均摩爾質量的葡聚糖琥珀酸開始來合成該兩親性聚合物。根據采用氯甲酸乙酯和N-甲基嗎啉的在有機溶劑中的常規偶聯方法，將色氨酸乙酯嫁接到該聚合物的酸上。在將反應介質在水中進行稀釋并通過添加INNaOH將pH調節至7后，通過超濾來純化該聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TrpOEt/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過1HNMR而測定的，X0.55的以“羧酸根(琥珀酸的羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過電勢分析法而測定的。相反實施例1通過十二烷胺進行修飾的羧甲基葡聚糖(PA6)根據實施例1，從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mo1的平均摩爾質量的羧甲基葡聚糖開始來合成該兩親性聚合物。最終的聚合物的特征為X0.10的以“十二烷胺/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過1HNMR而測定的，X0.90的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過電勢分析法而測定的。相反實施例2通過芐胺進行修飾的羧甲基葡聚糖(PA7)該兩親性聚合物在專利FR2794649A中作了描述，它的特征為X0.45的以“芐胺/糖單元”表示的取代度，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度。通過共電泳的BMP-2對兩親性聚合物的親和力BMP-2/兩親性聚合物復合物的制備向7μ1的緩沖至ρΗ7.4的100mg/mlPA溶液中添加5μ1在緩沖液H20/AcN/TFA(64.9/35/0.1%)中的0.28mg/mlBMP-2溶液。用0.9%NaCl溶液將該溶液補足至14μ1。該溶液具有0.lmg/ml的BMP-2的濃度和1/500的BMP-2/PA比例。將該溶液在環境溫度下溫和地攪拌30分鐘。BMP-2/兩親性聚合物復合物的證明將BMP-2/PA溶液在遷移緩沖液(pH7的tris-乙酸鹽溶液)中稀釋20倍。然后，向8μ17jC和7μ1上樣緩沖液(水中的甘油、tris-乙酸鹽和溴酚藍)中添加2μ1經稀釋的溶液。將包含IOngΒΜΡ-2和5μgPA的這17μ1置于0.8%瓊脂糖凝膠的孔中。合上電泳槽，并將電發生器調至30V。遷移持續1小時。在遷移后，在電場下將凝膠轉移至置于陽極處的PVDF膜上(20分鐘，15V，Bio-Rad的Trans-BlotSD)。在環境溫度下用脫脂乳使該膜飽和1小時，接著與BMP-2的一抗一起進行溫育(于4°C下過夜)，并最后與二抗即兔抗山羊-HRP—起進行溫育(在環境溫度下1小時)。通過HRP對于0pti-4CN的反應來進行揭示。當著色足夠時終止揭示，因為反應產物吸收可見光。當BMP-2與PA形成復合物時，在離上樣處0.7cm處以單個點的形式檢測到該復合物(向陽極遷移)。當BMP-2是單獨的或者不與PA形成復合物時，它在上樣的地方被檢測至IJ，因此沒有遷移。關于所述5種聚合物的結果概括在下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>生理PH下在兩親性聚合物存在下BMP-2的穩定性BMP-2/兩親件聚合物復合物的制備從在緩沖液H20/AcN/TFA(64.9/35/0.)中的0.28mg/mlBMP-2溶液開始，制備下列各種溶液1.通過在水中進行稀釋而獲得的0.084mg/ml的BMP-2溶液，2.通過用14mg/ml的PA溶液稀釋BMP-2而獲得的0.084/9.8mg/ml的BMP-2/兩親性聚合物溶液。然后，將每種溶液用pH7.4和300m0sm的IOmMPBS溶液稀釋至1/10，隨后通過在Microcon組件(cellule)(YM10,IOkD,500μ1)上進行離心而再濃縮。該操作重復兩次。在這三次洗滌后，離心每種溶液，并通過ELISA測定法來測定上清液中的ΒΜΡ-2的濃度。一部分的0.084mg/ml的BMP-2溶液不經歷任何洗滌以便作為對照。另一部分的0.084mg/ml的BMP-2溶液經歷三個循環的用ImMHCl溶液(pH3)進行的洗滌。已知該緩沖液穩定BMP-2，但是與藥學應用是不相容的。沒有經歷任何洗滌的BMP-2溶液的ELISA測定給出83.4μg/ml的BMP-2的濃度。該值相應于100%的BMP-2。將通過在三次用PBS進行的洗滌結束時其他溶液的ELISA所測定的濃度與未洗滌的BMP-2的該值相聯系。將所測得的BMP-2的百分比集中在下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>能夠與BMP-2形成復合物的PA致使BMP-2在生理pH下穩定。在不存在PA時，在生理pH下BMP-2不再存在于溶液中。同樣地，在不與BMP-2形成復合物的PA存在下，該蛋白質不再存在于溶液中。在37°C和生理pH下，在培養基中，在兩親性聚合物存在下BMP-2的穩定性和生物學活性在J0，將C2C12細胞(小鼠的肌細胞)接種于包含具有10%FCS和1%TBA的DMEM的96孔培養板中(7000個細胞/孔)，然后置于培養箱中24小時。在J1，在細胞粘著后，將該培養基替換成具有2%FCS和1%TBA的DMEM，持續24小時。在J2，將該培養基替換成補充有單獨BMP-2溶液(0.3ug/ml)或BMP-2/PA1復合物溶液(0.3/150ug/ml,1/500的比例)的具有2%FCS和1%TBA的DMEM。通過在具有2%FCS和1%TBA的DMEM中分開地稀釋BMP-2和PA來制備該復合物。在放置之前，讓蛋白質/PA1混合物靜置1小時。在J7，即放置后5天，抽取上清液以便通過ELISA來測定殘留的BMP-2的量。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與細胞接觸5天后，留下少于5%的單獨BMP-2，而當它與PA1復合時，留下多于40%的BMP-2。在J7，在相同的實驗中，將細胞用PBS洗滌2次，隨后用50u1裂解緩沖液進行裂解并經歷3個循環的冷凍(-80°C)/解凍(37°C)。在底物即磷酸對硝基苯酯(其在405nm處吸收)上，在裂解物中測量堿性磷酸酶的酶活性。將該活性歸并為通過microBCA測量的蛋白質的量，并因此表示為nmolpnP/分鐘.Pg蛋白質。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在存活條件下BMP-2通過復合物而被穩定5天以上，而在這樣的持續時間內它在單獨時則是不穩定的。BMP-2的活性通過細胞分化的緩慢過程來顯現，BMP-2的復合物在體外比單獨BMP-2更具活性。聚合物保護了BMP-2免于酶促降解BMP-2/聚合物復合物的制備將19ill在TFA乙腈緩沖液中的0.315mg/mlBMP-2溶液混合入4.6yl的66mg/ml聚合物(PA2)溶液、50ii1的50mMTris(pH7.5)、60ii1的25iig/ml嗜熱菌蛋白酶和366.4ulH20中。制備相似但不含有聚合物的溶液作為對照。在這兩種溶液中，嗜熱菌蛋白酶為所述蛋白質的25%(質量/質量)。消化的動力學將包含嗜熱菌蛋白酶的單獨BMP-2溶液和復合物溶液在60°C下溫育6小時。在T=0,20分鐘、40分鐘、1小時、2小時和6小時處抽取20ill樣品。向每個樣品中立即添加5ill的250mM(即50mM的終濃度)EDTA以抑制酶促反應。然后，將樣品于_20°C進行冷凍。揭示借助于使用15%SDS-Page凝膠的Western印跡來進行所述揭示。將7yl的每個樣品(含有65ng的BMP-2)混合入7u1的含有SDS的Laemli上樣緩沖液中。然后，將所述樣品在95°C下變性10分鐘，隨后置于15%SDS-Page凝膠上。作為對照，將相等量的BMP-2(65ng)和嗜熱菌蛋白酶(16.25ng)也置于凝膠上。合上電泳槽，并將電發生器調至125V。遷移持續1小時15分鐘。在遷移后，在100伏特下，在1小時期間，通過BioRad轉移系統將凝膠轉移至PVDF膜上。然后，在環境溫度下用脫脂乳使該膜飽和1小時，接著與抗-BMP-2—抗一起進行溫育(在4°C下過夜)，并最后與偶聯至HRP的二抗一起進行溫育(在環境溫度下1小時)。通過HRP對于0pti-4CN的反應來進行揭示。當著色足夠時終止揭示，因為反應產物吸收可見光。當BMP-2是單獨的時，從20分鐘開始觀察到出現了較低分子量的條帶，這說明了嗜熱菌蛋白酶對于該蛋白質的降解。在聚合物存在下，不存在該條帶，這表明該聚合物保護該蛋白質免于降解。在已驗證了該聚合物不抑制嗜熱菌蛋白酶的作用之后，可以得出結論所獲得的結果因此證明，聚合物PA2很好地保護BMP-2免于酶促降解。生理pH下在水中以復合物形式的BMP-2的增溶生理pH下BMP-2的溶解度BMP-2具有8.5的等電點，這意味著，在7.4的生理pH下，BMP-2接近其最小溶解度。這可以通過BMP-2的酸性溶液的中和實驗而得到證明。在酸性緩沖液(Infuse緩沖液，pH4.5)中制備1.5mg/mL的BMP-2的澄清溶液。通過添加磷酸鹽緩沖液來中和該溶液，以達到7.4的pH(l.2mg/mL的BMP-2的終濃度)。在PH7.4下，BMP-2沉淀出來并且所形成的聚集體是可見的。該中和導致獲得懸浮液。牛理dH下BMP-2/PA2的溶解度在酸性緩沖液(Infuse緩沖液，pH4.5)中制備1.5mg/mL的BMP-2的澄清溶液。向該溶液中添加凍干的PA2以達到75mg/mL的PA2濃度。然后，通過添加磷酸鹽緩沖液來中和該BMP-2/PA2復合物溶液，以達到7.4的pH(l.2mg/mLBMP-2和60mg/mLPA2的終濃度)。在PH7.4下，BMP-2是完全溶解的，并且沒有見到任何聚集體。因此，大大地提高了在生理pH下以BMP-2/PA2復合物形式的BMP-2的溶解度。1權利要求在物理和化學上穩定的、可溶于水的兩親性聚合物-BMP復合物，其特征在于■所述兩親性聚合物由通過疏水取代基和親水基團進行官能化的親水性多糖骨架構成，根據下述通式I●R，R′，相同或不同，并且表示鍵或包含1至18個碳的鏈，所述鏈任選地是支化的和/或不飽和的，且包含一個或多個雜原子例如0、N或/和S，●F，F′，相同或不同，并且表示酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚或胺，●X表示親水基團，其選自羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，●Y表示親水基團，其選自硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，●Hy表示疏水基團，其選自下列○線性或支化的C8-C30烷基，其任選地是不飽和的和/或包含一個或多個雜原子例如O、N或S，○線性或支化的C8-C18烷基芳基或芳基烷基，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個或多個雜原子例如O、N或S，○C8-C30多環，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個或多個雜原子例如O、N或S，○芐胺除外，●n和o為1至3，●h表示疏水基序相對于糖單元而言的摩爾份數，其為0.01至0.5，●x表示親水基團相對于糖單元而言的摩爾份數，其為0至2.0，●y表示親水基團相對于糖單元而言的摩爾份數，其為0至0.5，■所述BMP選自在治療上有活性的BMP(骨形態發生蛋白)，■聚合物/BMP的質量比小于或等于700。FPA00001058579000011.tif2.根據權利要求1的復合物，其特征在于，所述多糖選自通式I的多糖，其中y=0。3.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述多糖選自通式I的多糖，其中X表示羧酸根。4.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，聚合物/BMP的質量比小于或等于600。5.根據權利要求1至3中任一項的復合物，其特征在于，聚合物/BMP的質量比小于或等于500。6.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述BMP選自BMP-2(代勃特明-a)、BMP-4、BMP-7(依托特明_a)、BMP-14和GDF-5。7.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述聚合物選自其取代基以隨機方式分布的聚合物。8.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述多糖選自乙酰透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖、聚半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素。9.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，纖維素的組由通過酸進行官能化的纖維素例如羧甲基纖維素構成。10.根據權利要求1至8中任一項的復合物，其特征在于，葡聚糖的組由通過酸進行官能化的葡聚糖例如羧甲基葡聚糖構成。11.根據權利要求1至8中任一項的復合物，其特征在于，所述多糖選自乙酰透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖。12.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述疏水基團Hy選自天然來源的疏水氨基酸或者其醇、酯、脫羧基或酰胺衍生物，所述天然來源的疏水氨基酸選自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。13.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述疏水基團Hy是色氨酸或者色氨酸的酯或酰胺衍生物。14.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述兩親性聚合物-BMP復合物的形成是可逆的。15.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述BMP在生理pH下是穩定的。16.根據前述權利要求中任一項的復合物，其特征在于，所述BMP在37°C和中性pH下具有生物學活性。17.制備根據前述權利要求中任一項的兩親性聚合物-BMP復合物的方法，其特征在于，在水性介質中和在不存在能夠使該蛋白質變性的有機溶劑的情況下制備所述聚合物/BMP復合物。18.治療組合物，其特征在于，所述治療組合物包含根據權利要求1至16中任一項的兩親性聚合物-BMP復合物。19.根據權利要求18的治療組合物，其特征在于，所述治療組合物使得能夠施用大約1.5mg/ml的BMP。20.根據權利要求1至16中任一項的兩親性聚合物-BMP復合物在制備用于在體內誘導骨形成的治療組合物中的用途。全文摘要本發明涉及在物理和化學上穩定的、可溶于水的兩親性聚合物-BMP復合物，其特征在于所述兩親性聚合物由通過疏水取代基和親水基團進行官能化的親水性多糖骨架構成；所述BMP選自在治療上有活性的BMP(骨形態發生蛋白)；聚合物/BMP的質量比小于或等于700。本發明還涉及在水性介質中和在不存在能夠使該蛋白質變性的有機溶劑的情況下制備所述兩親性聚合物-BMP復合物的方法。本發明還包括根據本發明的兩親性聚合物-BMP復合物的治療組合物。文檔編號A61K38/18GK101835493SQ200880107383公開日2010年9月15日申請日期2008年7月25日優先權日2007年7月27日發明者G·蘇拉,O·蘇拉,R·蘇拉申請人:阿道恰公司