新的綴合蛋白質和肽的制作方法

專利名稱：新的綴合蛋白質和肽的制作方法
新的綴合蛋白質和肽本發明涉及新的綴合蛋白質和肽，及其制備方法。許多治療活性分子，例如蛋白質，不具有獲得臨床醫用藥效所需要的性質。例如， 許多天然蛋白質由于在施用于患者時具有一些固有缺陷而無法制成良藥，所述缺陷包括 (1)蛋白質被血液和組織中存在的許多內肽酶和外肽酶消化；(2)許多蛋白質在某種程度 上具有免疫性；以及(3)蛋白質可能通過腎超濾作用和內吞作用而被快速排泄。一些可在 醫藥中用作活性治療劑的分子具有全身毒性或缺乏最佳生物利用率和藥物代謝動力學。在 蛋白質從血液循環中快速清除的情況下，通常不得不將其頻繁地施用于患者。頻繁給藥進 一步增加了毒性——尤其是免疫誘發性毒性——的風險。水溶性的合成聚合物，特別是聚烷撐二醇，廣泛用于綴合治療活性分子如蛋白質。 以表明這些治療性綴合物可通過延長循環時間和降低清除率、降低全身毒性、以及在一些 情況下顯示出提高的臨床藥效而有利地改變藥物代謝動力學。使聚乙二醇PEG與蛋白質共 價綴合的方法通常被稱為“PEG化(PEGylation) ”。
對于最優化藥效以及確保劑量和劑量之間的一致性而言重要的是，對于每個分子 而言，每個蛋白質綴合的聚合物分子的數目是相同的，并且在每個蛋白質分子中，每個聚合 物分子均特定地共價綴合至相同的氨基酸殘基。沿蛋白質分子位點上的非特定綴合會引 起綴合產物的分布以及常常有未綴合的蛋白質，從而產生難以純化和純化昂貴的復雜混合 物。WO 2005/007197描述了一系列新的綴合試劑。所述綴合試劑可用以與生物分子例 如蛋白質中的親核基團反應，從而形成蛋白質-聚合物綴合物。這些試劑具有特別的效用， 因為它們能夠與蛋白質的一個二硫鍵中的兩個硫原子綴合而得到新的硫醚綴合物。固定金屬離子親和色譜(IMAC)是一種純化蛋白質和肽的標準技術。在此技術中， 通過合成方法將多聚組氨酸標簽——常被稱為“his-tag” (連續的多個組氨酸殘基的短鏈， 通常具有5或6個殘基，在天然蛋白質中不存在)——連接至一種蛋白質，通常是連接至氨 基酸鏈的末端之一。生成的蛋白質或肽被稱為“組氨酸標簽”蛋白質或肽。多聚組氨酸標 簽通過至少兩個組氨酸殘基與金屬例如鎳和鈷強鍵合。在IMAC中，多聚組氨酸標簽蛋白質 穿過含鎳柱或含鈷柱。多聚組氨酸標簽與所述柱強鍵合，從而使帶有標簽的蛋白質從混合 物中分離出來。多聚組氨酸標簽應用廣泛，其可被連接至寬范圍的蛋白質和肽，使它們或由 此獲得的產物之后從混合物中分離。—些不帶標簽的蛋白質含有彼此接近的組氨酸殘基，此類蛋白質也可鍵合至鎳和 鈷IMAC柱，但通常與多聚組氨酸標簽蛋白質相比鍵合強度較小。我們現已發現一種將聚合物，尤其是PEG，綴合至蛋白質和肽上的改進的方法。在 此方法中，聚合物被綴合至多聚組氨酸標簽上。可以相信的是，出人意料地，能夠結合至組 氨酸殘基上的反應試劑將優先與多聚組氨酸標簽反應，而不是與天然蛋白質中存在的單個 組氨酸殘基反應。生成的綴合物是新的。WO 2005/007197中的反應試劑對于含多聚組氨酸 標簽的蛋白質和肽、以及天然蛋白質中含類似的組氨酸結構的蛋白質和肽而言，可作為極 其有效且穩定的綴合劑來制備新的綴合物。
因此，本發明提供一種將聚合物綴合至含多聚組氨酸標簽的蛋白質或肽上的方 法，該方法包括使一種聚合的綴合試劑與所述蛋白質或肽在一定條件下反應，從而經由所 述多聚組氨酸標簽而發生綴合。本發明還提供一種將聚合物綴合至蛋白質或肽上的方法， 該方法包括將一種多聚組氨酸標簽引入所述蛋白質或肽中，然后使所述蛋白質或肽與一種 聚合的綴合試劑在一定條件下反應，從而經由所述多聚組氨酸標簽而發生綴合。本發明的聚合物綴合物是新的，因此，本發明還提供一種含綴合至蛋白質或肽上 的聚合物的化合物，所述綴合本質上經由多聚組氨酸標簽進行。此類化合物可由以下通式 表不X-Q，-(his)u-Z (I)其中X代表一種聚合物；Q’代表一種連接基團；(his)u代表含u個組氨酸單元的 多聚組氨酸標簽；并且Z代表通過所述多聚組氨酸標簽連接的一種蛋白質或肽。能夠鍵合至多聚組氨酸標簽上的任意聚合的綴合試劑均可用于本發明方法。此類 試劑包括WO 2005/007197中的雙官能試劑，所述雙官能試劑除了能結合至多聚組氨酸標 簽之外，還被發現能夠結合至天然蛋白質或肽中存在(即在多聚組氨酸標簽中不存在)的 兩個組氨酸殘基，其中所述殘基在天然結構中的位置足夠靠近，能夠使所述雙官能試劑綴 合至兩個組氨酸殘基。因此，本發明還提供一種以下通式的化合物
X—Q-W. a
Z
X丨-Q入B' (Ia)其中X和X’中的一個代表一種聚合物，另一個代表氫原子；每個Q獨立地代表一種連接基團；W代表一種吸電子基團或可通過還原一種吸電子基團而得到的基團；或者，如果 X’代表一種聚合物，則X-Q-W-可一起代表一種吸電子基團；另外，如果X代表一種聚合物， 則V和吸電子基團W可與其間的原子一起形成環；Z代表經由各組氨酸殘基連接至A和B的一種蛋白質或一種肽；A為一種CV5亞烷基或亞烯基鏈；并且B為一個鍵，或一種CV4亞烷基或亞烯基鏈。本發明的另一個組的新化合物由以下通式代表X- [Q-ff- (CH = CH) v_ (CH2) 2_Z] v’ (Ib)其中X代表一種聚合物；Q代表一種連接基團；W代表一種吸電子基團或可通過還 原一種吸電子基團而得到的部分；ν代表0或1至4的整數；ν’代表1至8的整數；并且Z 代表經由一種多聚組氨酸標簽連接的一種蛋白質或一種肽。在這些化合物中，ν’優選代表 1至6的整數，優選1至4，例如1。優選地，ν為0。可用于本發明方法的其它試劑包括能夠酰基化或烷基化的試劑。所述試劑可為單 官能或多官能的，包括例如PEG碳酸酯(例如PEG-對硝基苯基碳酸酯、PEG-琥珀酰亞胺碳 酸酯、PEG-苯并三唑基碳酸酯)、PEG羧酸酯和PEG酯(例如PEG-琥珀酰亞胺酯和PEG-對硝基苯基酯及其衍生物)、PEG醛、PEG-氟代乙烷磺酰基化物(PEG-tresyl)或PEG-甲苯 磺酰基化物(PEG-tosyl)、PEG- 二氯三嗪或PEG-氯三嗪、PEG乙烯基砜、PEG馬來酰亞胺和 PEG-碘乙酰胺；以及含有除PEG之外的聚合物的相應試劑。在本發明的新綴合物中，Z可由蛋白質或肽得到。在本說明書和通篇中，為簡便將 使用“蛋白質”一詞，當提及“蛋白質”時，應當理解為提及的是“蛋白質或肽”，上下文另有 要求的除外。形成式Ia新綴合物的一部分的蛋白質必須含有至少兩個組氨酸殘基。這兩個殘 基可存在于天然蛋白質中，在這種情況下，所述兩個殘基在天然結構中的位置必需足夠靠 近，以能夠綴合至基團A和B。當兩個組氨酸殘基在蛋白質鏈中彼此鄰近，或者它們可能會 由于蛋白質的折疊而靠近時，所述綴合即可發生。這類蛋白質通常可結合至IMAC柱。例如， 原核生物大腸桿菌(Escherichia c oli)具有一種蛋白質Y0DA，由此可結合至IMAC柱。然 而，優選的是，所述兩個組氨酸殘基構成已通過合適的方式連接至蛋白質或肽的多聚組氨 酸標簽——即在天然蛋白質或肽中不存在的組氨酸鏈——的一部分，所述方式例如化學方 式、與多聚組氨酸標簽或含有多聚組氨酸標簽的部分一起進行轉譯后標記，或者通過蛋白 質工程在與靶蛋白質融合的過程中插入組氨酸序列，例如通過使用編碼所需長度的多聚組 氨酸標簽的具有短編碼序列的基因。多聚組氨酸標簽可含有任意所需數目的組氨酸殘基，例如最高達約12個殘基。其 必須含有至少2個殘基；優選含有至少3個殘基，尤其是4至10個殘基，尤其是5至8個殘 基，例如5或6個殘基。其可僅含有組氨酸殘基，或除了組氨酸殘基之外，也可含有一種或 多種間隔殘基或序列。目前尚未獲知本發明的綴合物中存在的結合的確切性質。一種可能的綴合物的制 備方法示于附

圖1中，該制備方法使用一種具體試劑示出，其中SO2R各自代表離去基團，且 其中R優選代表烷基、芳基、烷芳基或芳烷基，尤其是甲苯基。圖2(a)和2(b)示出可通過圖 1的方法制備的其它綴合物。在圖1和2中，設想的是連接至相鄰的組氨酸殘基上，但是，如 果不是間距太大阻礙了綴合物的形成，則也不能排除連接至間隔開的組氨酸殘基的情況。除了帶有多聚組氨酸標簽外，如果需要，蛋白質還可進行衍生化或官能化。特別 是，在綴合之前，天然蛋白質可先與各種保護基團反應以保護其上的敏感基團；或者可預 先使用本發明方法或其它方法使其與一種或多種聚合物或其它分子綴合。另外，本發明的 綴合物還可具有在根據本發明進行綴合之后綴合至蛋白質上的一種或多種另外的聚合物 (包括蛋白質)或其它分子。本發明的新綴合物——其中蛋白質與一種或兩種另外的聚合 物綴合——分別示于附圖3(a)、3(b)和3(c)中。在這些圖中，聚合物與其連接基團一起示 意地表示為A、B和C，而χ、y和ζ代表以任意結合方式經由組氨酸殘基與蛋白質綴合的聚 合物A、B和C的總數目。當然，一種或多種聚合物經由除組氨酸之外的殘基綴合也是可行 的。除了與一種或多種另外的聚合物(包括蛋白質)綴合外，所述蛋白質還可與一種或多 種選自例如小分子，如治療物或診斷物；唾液酸；糖；和淀粉的分子綴合。因此，圖3中的B 和C可代表此類分子。另外，圖3示出的A、B和C位于彼此相鄰的位置，但這僅是示意性 的，它們也可彼此間隔開。許多市售的蛋白質含有多聚組氨酸標簽，這或者是因為這些蛋白質之前已經通過 IMAC進行過純化，或者是為了有助于以后對蛋白質本身或由其獲得的產物進行純化。如果需要使蛋白質與一種聚合物綴合，則與多聚組氨酸標簽的綴合提供了一種極其方便的路 徑，這在之前是沒有想到的。綴合產物、尤其是PEG化產物，可以高度一致性地獲得。使用 WO 2005/007197中的導致與兩個組氨酸殘基發生綴合的綴合試劑使得形成一個大環，從而 形成一種特別穩定的選擇性的綴合物，其通常以高產率獲得。 因為組氨酸標簽通常是連接至蛋白質的表面——通常為蛋白質鏈的一端，并可位 于蛋白質中任意所需位點，所以在引入多聚組氨酸標簽之后，以及在多聚組氨酸標簽上的 特定位點與聚合物綴合之后，蛋白質的生物活性仍能很大程度地保留。因此，本發明可用于 形成先前被證明使用常規綴合方法難以獲得的蛋白質綴合物。只要多聚組氨酸標簽含有足夠數目的組氨酸殘基，本發明的綴合物就仍可使用 IMAC純化。為實現所述純化，在多聚組氨酸標簽中，至少兩個、優選更多個組氨酸殘基需保 持未綴合和可用于與IMAC柱中的鎳結合的狀態。在綴合后，游離組氨酸殘基數目的減少使 得與IMAC柱的結合在未綴合的肽或蛋白質和綴合的衍生物之間具有選擇性。當與相同的 生物分子發生多重綴合時，IMAC能夠使所述多重綴合的衍生物分離。在本發明的綴合物中，聚合物(例如X或X’)可為例如聚烷撐二醇、聚乙烯吡咯烷 酮、聚丙烯酸酯(如聚丙烯酰嗎啉)、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或 聚甲基丙烯酰胺(如聚羧甲基丙烯酰胺)或具有磷脂酰膽堿側基的聚丙烯酸酯或聚甲基丙 烯酸酯(例如2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿)，或HPMA共聚物。另外，所述聚合物還可為 一種對酶或水解降解敏感的物質。此類聚合物包括例如聚酯、聚縮醛、聚(原酸酯)、聚碳酸 酯、聚(碳酸亞氨酯)、和聚酰胺如聚(氨基酸)。所述聚合物可為均聚物、無規共聚物或一 種結構確定的共聚物如嵌段共聚物。例如，其可為由兩種或更多種環氧烷，或者由聚(環氧 烷)與聚酯、聚縮醛、聚(原酸酯)或者聚(氨基酸)獲得的嵌段共聚物。可使用的多官能 聚合物包括二乙烯基醚_馬來酸酐和苯乙烯_馬來酸酐的共聚物。也可使用天然存在的聚合物，例如多醣，如殼多糖、右旋糖苷、糊精、脫乙酰殼多 糖、淀粉、纖維素、糖原、聚(唾液酸)，及其衍生物。也可使用蛋白質作為聚合物。這使得一 種蛋白質(例如抗體或抗體片段)可與第二種蛋白質(例如酶或其它活性蛋白質)綴合。 此外，如果使用含有催化序列(catalytic sequence)的肽，例如糖基轉移酶的0_多糖受體 位點，則能夠為隨后的酶促反應提供基點(substrate)或靶。也可使用以下聚合物，例如多 聚谷氨酸，以及由天然單體(如糖類或氨基酸)和合成單體(如環氧乙烷或甲基丙烯酸) 獲得的雜化聚合物。如果聚合物為聚烷撐二醇，則優選含有C2和/或C3單元，尤其是聚乙二醇。聚合 物、特別是聚烷撐二醇可含有單一的線型鏈，或具有支鏈結構，并可由許多或大或小的鏈組 成。所稱的Pluronic是一類重要的PEG嵌段共聚物。它們由亞乙基氧基和亞丙基氧基嵌 段獲得。可使用取代的聚烷撐二醇，例如甲氧基聚乙二醇。在本發明的一個優選實施方案 中，單鏈聚乙二醇由一個合適的基團起頭，而鏈的另一端連接至連接基團Q或Q'，如下文 所討論；所述合適的基團例如烷氧基(如甲氧基)、芳氧基、羧基或羥基。所述聚合物可任選地以任意所需方式衍生化或官能化。反應基團可在聚合物的末 端或端基處連接，或經由側鏈連接基團沿聚合物鏈連接；在此情況下，所述聚合物為例如聚 丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或一種馬來酸酐共聚物。含有多 于一個生物分子的多聚體綴合物可產生協同和加合效果。如果需要，可使用常規方法將所述聚合物連接至固體載體。當然，聚合物的最佳分子量取決于預期用途。優選地，數均分子量在從250g/mol， 例如500g/mol，至約75，000g/mol的范圍內。如果意欲使通式I化合物脫離循環和滲透組 織，例如用于治療由惡性腫瘤、感染或自身免疫性疾病或者由外傷引起的炎癥，則可有利地 使用在2000-30，000g/mol范圍內的較低分子量聚合物。對于意欲使通式I化合物保留在 循環系統中的應用而言，可有利地使用較高分子量的聚合物，例如在20，000-75，000g/mol 范圍內。待使用的聚合物應當選擇為能夠使綴合物溶于其預期用途的溶劑介質中。對于生 物應用，特別是對于對哺乳動物臨床治療給藥的診斷和治療應用而言，綴合物應可溶于水 性介質。許多蛋白質，例如酶，具有工業用途，例如用于催化化學反應。對于意欲用于此類 應用的綴合物而言，其可能需要同時溶于水性和有機溶劑，或溶于二者之一。當然，所述聚 合物不應過度削弱所述蛋白質的預期功能。優選地，所述聚合物為一種合成聚合物，并且優選地，其為一種水溶性聚合物。對 許多應用而言，使用水溶性聚乙二醇是特別優選的。所述聚合物經由一個連接基團而合適地與多聚組氨酸標簽共價連接。式I的連接 基團Q'可包括基團W(即，Q'可等同于式Ia的-Q-W-)。連接基團Q’或Q可為例如直接 的鍵、亞烷基(優選CV1。亞烷基)或任選被取代的芳基或雜環基，所有上述基團可被一個或 多個氧原子、硫原子、-NR基團(其中R含義如下)、酮基、-0-C0-基團和/或-C0-0-基團 封端或間隔。合適的芳基包括苯基和萘基，合適的雜環基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、 吡唑、噁唑、噠嗪、嘧啶和嘌呤。與聚合物的連接可通過水解性不穩定鍵或穩定鍵進行。可存在于一個任選取代的芳基或雜環基上的取代基包括例如一個或多個相同或 不同的選自以下的取代基-cn、-no2、-co2r、-coh、-ch2oh、-cor、-or、-ocor、-oco2r、-sr、-so R、-S02R、-NHC0R、-NRC0R、-NHC02R、-NR，C02R、-N0、-NH0H、-NR，0H、-C = N-NHC0R、-C = N-NR， COR、-N+R3^-N+H3, -N+HR2, -N+H2R,鹵素(例如氟或氯)、-C 三 CR、-C = CR2 和-C = CHR，其中 R或R’各自獨立地代表氫原子或烷基(優選Cp6烷基)或芳基(優選苯基)。尤其優選存 在吸電子取代基。優選地，式Ia化合物中連接氫原子的基團Q為亞烷基或直接的鍵。最優選地，式 Ia中的X為一種聚合物，且X’ -Q-為H-。W可代表例如酮基或醛基C0、酯基-0-C0-或砜基-S02-，或一個通過還原例 如 CH. OH 基團、醚基 CH. 0R、酯基 CH. 0. C(O)R,氨基 CH. NH2, CH. NHR 或 CH. NR2,或酰胺基 CH. NHC (0) R或CH. N (C (0) R) 2而獲得的基團。如果X-Q-W- —起代表一個吸電子基團，則該
基團可為例如氰基。當然，本發明的綴合方法中使用的精確條件取決于使用的綴合劑和被綴合的蛋白 質或肽。這些條件為本領域技術人員的公知常識。例如，反應的PH通常在pH 4至pH 10 之間，一般在約6和約8. 5之間，例如約6. 5至8. 0，優選約7. 0-7. 5。反應混合物中的蛋白 質或肽的濃度通常會在0. 20mg/ml以上，一般在0. 4mg/ml以上，例如0. 5mg/ml至1. 5mg/ ml。當使用WO 2005/007197中的雙官能試劑時，所述方法包括使以下物質之一與含有至少 兩個組氨酸殘基的蛋白質或肽反應⑴一種通式(II)化合物，
<formula>formula see original document page 10</formula>(II)其中X和V中的一個代表一種聚合物，另一個代表氫原子；Q代表一種連接基團；W’代表一種吸電子基團，例如酮基、酯基-0-C0-或砜基-SO2-；或者如果X’代表 一種聚合物，則X-Q-W’ 一起可代表一種吸電子基團； A代表一種CV5亞烷基或亞烯基鏈；B代表一個鍵，或一種Ch亞烷基或亞烯基鏈；并且每個L獨立地代表一種離去基團；或者(ii) 一種通式(III)化合物，<formula>formula see original document page 10</formula>
(III)其中X、X’、Q、W’、A和L具有通式II中所給出的含義，此外，如果X代表一種聚合 物，則X’和吸電子基團W’可與其間的原子一起形成環，m代表1至4的整數。綴合劑II和III彼此化學等價，并記載于WO 2005/007197中。它們的特征是具 有一個交叉官能化的、潛在交叉綴合的雙烷基化部分，所述部分對兩種親核試劑具有選擇 性。所述反應在一定條件下進行，以使所述試劑與待綴合的蛋白質中的兩個組氨酸殘基結 合。出人意料的是，可獲得對兩個組氨酸殘基的高選擇性。其它綴合方法易于生成產物的 混合物；例如，之前已發現，選擇性地與組氨酸殘基鍵合而不與賴氨酸殘基鍵合是困難的。所述或每個離去基團L可代表例如-SR、-SO2R, -OSO2R, -N+R3> -N+HR2、-N+H2R,鹵 素、或-O0,其中R含義如上，0代表含有至少一個吸電子取代基的取代芳基，尤其是苯 基，所述吸電子取代基例如-CN、-NO2, -CO2R, -C0H、-CH2OH, -COR、-OR、-0C0R、-OCO2R, -SR、-SOR、-SO2R, -NHC0R、-NRC0R、-NHCO2R, _NR，CO2R, -NO、-ΝΗ0Η、_NR，OH、-C = N-NHC0R、-C = N-NR，COR、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、鹵素(尤其是氯或氟)、_C 三 CR,-C = CR2 和-C = CHR，其 中R和R’含義如上。其中W’和V 一起形成環的典型結構包括<formula>formula see original document page 11</formula>在本發明方法的一個優選實施方案中，使用一種以下通式的試劑
<formula>formula see original document page 11</formula>以制備一種新的以下通式的綴合物<formula>formula see original document page 11</formula>本發明方法的該實施方案的一個關鍵特征是α-亞甲基離去基團和雙鍵與作為 邁克爾(Michael)活化部分的吸電子官能團交叉綴合。如果在交叉官能性試劑中，離去 基團傾向于發生消除而不是直接取代，并且吸電子基團是適于發生Michael反應的活化部 分，則通過相繼的邁克爾反應和逆邁克爾反應可發生連續的分子內二烷基化。所述離去部 分用以掩蔽潛在綴合的雙鍵，該雙鍵直到第一個烷基化發生之后才暴露，然后由相繼交互 發生的邁克爾和逆邁克爾反應引發二烷基化，如J. Am. Chem. Soc. 1979，101，3098-3110和 J. Am. Chem. Soc. 1988，110，5211-5212中所述。吸電子基團和離去基團最好選擇為使雙烷 基化可通過相繼的邁克爾反應和逆邁克爾反應進行。也可制備具有與雙鍵綴合的、或位 于離去基團和吸電子基團之間的另外的多重鍵的交叉官能團烷基化試劑，如J.Am. Chem. Soc. 1988，110,5211-5212 中所述。本發明的新綴合物的一些實例包括下列物質<formula>formula see original document page 12</formula>可用于本發明方法的試劑的一些實例包括下列物質<formula>formula see original document page 12</formula>
對于蛋白質而言，無論是在天然蛋白質中還是在多聚組氨酸標簽中，組氨酸殘基 之間都彼此靠近，優選彼此相鄰。當然，除聚乙二醇之外的聚合物也可代替上式中的PEG。 不愿受任何理論束縛，與組氨酸殘基的鍵合可如下式所示<formula>formula see original document page 13</formula>但與組氨酸中其它氮原子鍵合也是可行的。上述方法的中間產物是一種通式Ia的化合物，其中W為一個吸電子基團。此類化 合物本身也具有實用性；由于本發明方法在合適的條件下是可逆的，因此其中W為一個吸 電子部分的式Ia化合物還可用于需要釋放游離蛋白質的應用中，例如直接的臨床應用中。 然而，吸電子部分W可被還原為一個抑制釋放蛋白質的部分，此類化合物也可用于許多臨 床、工業和診斷應用。另外，一旦W被還原，就不能再發生逆反應，這意味著如果添加一種更 強的親核物質，將不會觀察到交換現象。因此，成為可能的是，例如，經由一個多聚組氨酸標 簽PEG化；還原W ；然后還原蛋白質中的二硫鍵；隨后通過還原的二硫鍵進行PEG化反應。 對于一些蛋白質，也可不還原基團W而進行所述過程。如此，例如含有酮基的部分W可被還原為含有CH(OH)基團的部分；醚基CH. OR可 通過羥基與醚化劑的反應而獲得；酯基CH. 0. C(O)R可通過羥基與酰化劑的反應而獲得； 胺基CH. NH2、CH. NHR或CH. NR2可由酮或醛通過還原胺化而制備；或者酰胺CH. NHC (0) R或 CH. N(C(O)R)2可通過胺的酰化而形成。為氰基的基團X-Q-W-可被還原為胺基。所述方法可在所有反應物可溶的溶劑或溶劑混合物中進行。可使蛋白質與通式II 或III的化合物在水性反應介質中直接反應。根據親核試劑的PH要求，也可對所述反應介 質進行緩沖。所述反應的最佳PH通常為至少6. 0，一般在約6. 8至約8. 5之間，例如約6. 5 或7. 0至8. 0，例如約7. 5-8. 0，但優選約7. 0至7. 5。出人意料的是，本發明的方法在堿性 PH下能夠選擇性地連接至組氨酸殘基(特別是多聚組氨酸標簽中的組氨酸殘基)，而PEG 化作用的文獻方法傾向于教導堿性條件會導致非選擇性的PEG化，包括賴氨酸殘基的PEG 化，并且教導組氨酸的PEG化在pH 6. 0至6. 5的條件下最優。甚至在這種情況下，文獻方 法提供的也是非選擇性的PEG化，包括賴氨酸的PEG化。當然，最佳反應條件取決于所用的 具體反應物，但總體上，使用朝向上述范圍下端點的PH將傾向于提高與組氨酸結合的選擇 性，而使用朝向上述范圍上端點的PH將傾向于提高產率。3-37°C之間的反應溫度通常是合適的如果綴合反應在蛋白質可發生分解或變質 的溫度下進行，則蛋白質的分解或變質會削弱功效。在有機介質(例如THF、乙酸乙酯、丙 酮)中進行的反應通常在最高達環境溫度的溫度下進行。與許多其它試劑不同，通過使用化學計量當量或略微過量的所需試劑，蛋白質可 與所需試劑有效地綴合。然而，由于所述試劑不與用于使蛋白質溶劑化的水性介質發生競 爭性反應，因此可與超過化學計量的試劑進行綴合反應。過量的試劑和產物可容易地在蛋 白質的常規純化過程中通過離子交換色譜分離，或通過使用鎳的分離方法分離。另一類可用于與組氨酸標簽綴合的化合物由以下通式(IV)化合物表示X- [Q-W，- (CH = CH) v_ (CH2) 2_L] v’ (IV)
其中X、Q、v和ν’含義如上，W’代表吸電子基團，L代表離去基團。這種綴合方法 形成的直接產物是式Ib的化合物，其中W為吸電子基團。如果需要，生成的式Ib化合物可 被轉化為任意其它所需產物。特別是，吸電子基團可被還原，如上所述。
一種特別優選的通式IV的試劑具有以下的通式IVa X- [NH-CO-Ar-W' - (CH = CH) v_ (CH2) 2_S02R] v’ (IVa)其中Ar代表未取代或取代的芳基，尤其是苯基，其中任選的取代基選自上述對于 連接基團Q中含有的芳基所提及的那些；R、W’、v和ν’含義如上；以制備以下通式的新綴合 物X- [NH-CO-Ar-ff- (CH = CH) v_ (CH2) 2_Z] v’(Ic)在這些優選的化合物中，優選ν為0，并優選V’代表一個1至4的整數，尤其是1。 優選W’代表CO基團，且W代表CO基團或CH. OH基團。優選R代表C^4烷基-芳基，尤其 是對甲苯基。優選Ar為未取代的苯基。優選X為聚烷撐二醇，尤其是聚乙二醇。當使用通式IV的試劑時，使用的合適的反應條件與關于試劑II和III的上下文 中所討論的反應條件相同。認為使用式IV的試劑的綴合方法通過形成具有以下通式的中間體化合物進行
X- [Q-W，- (CH = CH) V_CH = CH2] v’ (V)其中X、Q、W’、v和ν’含義如上。如果優選在待綴合的分子的存在下原位生成上式 V的化合物，則在整個過程中使用相對較高的pH是合適的。或者，如果優選在一個單獨的步 驟中形成上式V的化合物并隨后加入待綴合的分子，則第一步適于在相對較高的pH(例如 7. 5至8. 0)下進行，而下一步適于在較低的pH (例如6. 0至6. 5)下進行。如上所述，根據存在的組氨酸殘基的數目，可使多于一種的聚合物與合適的蛋白 質綴合，這示意性地在圖3中示出。例如，兩個聚合物可與一個6-殘基多聚組氨酸標簽綴 合。這提供了一種將多個聚合物殘基連接至一個蛋白質上的有用方法。當希望使用一種較 低分子量PEG獲得一種較高分子量產物時，例如使用三個20kD PEG鏈獲得一個60kD分子 量產物時，或當希望將兩種不同聚合物例如一個蛋白質和一個PEG加至另一蛋白質以獲得 多重功效時，或當希望在一個步驟中實現例如糖基化和PEG化時，所述方法可能是需要的。 所述多重綴合通常難以使用常規綴合技術實現。許多蛋白質含有游離半胱氨酸殘基和/或二硫橋鍵，且用于制備本發明的新綴合 物的綴合劑也可與暴露的半胱氨酸殘基和還原的二硫橋鍵反應。根據反應條件和蛋白質結 構，所述綴合劑較之與多聚組氨酸標簽中的組氨酸殘基的反應而言，可優先與這些部分反 應。因此，如果需要綴合一種除含有多聚組氨酸標簽外還含有此類部分的蛋白質，則如果需 要可使用合適的嵌段方法。例如，所述部分可通過與符合上述通式II、III或IV—其中 聚合物為相對低分子量的部分一的試劑進行綴合而嵌入。然后可使用所需試劑進行與組 氨酸殘基的綴合。通式I的化合物具有許多應用。其可以例如直接臨床應用于患者，因此，本發明還 提供了一種含有一種本發明的化合物和一種可藥用載體的藥物組合物。本發明還提供了一 種用于治療的本發明的化合物，以及一種治療患者的方法，所述方法包括對患者施用藥物 有效量的本發明的化合物或藥物組合物。通過適當選用蛋白質可得到任意需要的藥效，例 如創傷治療、酶替代治療、蛋白質替代治療、傷口護理、毒物去除、抗炎、抗感染、免疫調節、 接種疫苗或抗癌。本發明的化合物也可用于非臨床應用。例如，許多生理活性化合物例如酶能夠在 有機溶劑中催化反應，且本發明的化合物可用于此類應用。另外，本發明的化合物可用作診斷工具。本發明的化合物可包括一種顯影劑，例如一種放射性核苷酸(radio nucleotide)，以能夠在活體內跟蹤所述化合物。所述蛋白質可為例如一種肽、多肽、抗體、抗體片段、酶、細胞因子、趨化因子、受 體、血液因子、肽激素、毒素、轉錄蛋白或多聚體蛋白。下面給出一些根據所需應用可用于本發明的具體蛋白質。酶包括糖類專一性酶 (carbohydrate-specific enzyme)、蛋白水解酶等。對于普遍的工業(基于有機物的反應) 和生物應用以及具體的治療應用而言，重要的酶包括氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、 異構酶和連接酶，如US 4，179，337所公開。重要的具體的酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺 甙脫氨酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、膽紅素氧化酶、葡 糖氧化酶、葡萄糖苷酸酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡萄糖苷酸酶、谷氨酰胺酶。本發明的化合物中使用的蛋白質包括例如因子VII、VIII或IX和其它血液因子， 胰島素、ACTH、高血糖素、生長激素抑制素、生長激素、胸腺素、甲狀旁腺激素、色素激素、生 長調節素、紅細胞生成素、黃體化激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、催乳激素、白細胞介 素、干擾素、集落刺激因子、血紅素、細胞因子、抗體、絨毛膜促性腺激素、促卵泡成熟激素、 垂體甲狀腺刺激素和組織纖維蛋白溶酶原激活劑。某些上述蛋白質如白細胞介素、干擾素和集落刺激因子也以非糖基化的形式存 在，并且通常通過重組蛋白質技術制備。所述非糖基化的變體也可用于本發明。其它重要的蛋白質有變應原蛋白質，Dreborg等的Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990)6315365中公開了，當與一種聚合物如聚(環氧烷)綴合時，變應原蛋 白質具有降低的變應原性，并因而適于用作耐受誘發劑。在所公開的變應原中有豚草抗原 E、蜂毒、塵螨變應原等。糖聚肽如免疫球蛋白、卵清蛋白、脂肪酶、葡糖腦苷脂酶、外源凝集素、組織纖維蛋 白溶酶原激活劑和糖基化的白細胞介素、干擾素和集落刺激因子是重要的，免疫球蛋白有 例如 IgG、IgE、IgM、IgA、IgD 及其片段。特別重要的有用于診斷和治療目的的臨床藥物中的受體和配體結合蛋白質以及 抗體和抗體片段。所述抗體可單獨使用或可與另一種原子或分子如一種放射性同位素或一 種細胞毒素/抗感染藥共價綴合(“加載”)。抗原決定基可用于接種以產生一種免疫性的 聚合物-蛋白質綴合物。下列實施例示例說明本發明。實施例的結果示于附圖4至20中。在實施例中， 使用含有一種具有6個組氨酸殘基的多聚組氨酸標簽的蛋白質proBNP和含有一種具有8 個組氨酸殘基的多聚組氨酸標簽的β突觸核蛋白。在心臟組織中，腦促尿鈉排泄肽(BNP) 作為一種134氨基酸前體(BNP前體)被合成，用蛋白酶使其裂解以形成一種108氨基酸 proBNP。β突觸核蛋白是一種主要在腦組織中存在的小的可溶性蛋白質，具有類伴侶蛋白 活性。使用的其它蛋白質有干擾素α-2b、內皮他丁(endostatin)和一種抗TNFa域抗體 片段。實施例1 Hi s6-proBNP 的 12kDa PEG 化PEG試劑結構<formula>formula see original document page 16</formula>將PEG雙砜(結構(1))在pH 7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液(10mg/mL)中培養5小時， 以制備12kDa PEG單砜(結構(2))。將兩等份的溶于pH7. 8的50mM磷酸鈉中的C端6X組 氨酸標簽proBNP (Abcam，ab51402,13kDa) (10 μ L，0. 5mg/mL)用冰冷卻，然后加入1摩爾當 量(相對于蛋白質的濃度)或3摩爾當量的12kDa PEG單砜(分別為1. 6 μ L或4. 8 μ L)。 然后將所述反應混合物置于冰箱中放置16小時。使用SDS-PAGE分析所形成的反應混合物以根據大小分離其成分，用Instant Blue(Novexin)著色后形成的凝膠示于圖4中。在圖4中，標記M的泳道(lane)示出Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。泳道1中標記B的帶(band)是提供的His6-proBNP試 樣(Abcam，lmg/mL)。帶A為雜質。泳道2由1當量的12kDa PEG反應混合物獲得，并示出 標記C、D和E的帶，其分別對應于單PEG化產物、二 PEG化產物和三PEG化產物。標記A 和B的較低帶分別對應于所提供的試樣中的未反應的His6-ProBNP和雜質。泳道3由3當 量的12kDa PEG反應混合物獲得，并示出標記C、D和E的帶，其分別對應于單PEG化產物、 二 PEG化產物和三PEG化產物。標記B和A的較低帶分別對應于提供的試樣中的未反應的 His6-proBNP 和雜質。然后也使用碘化鋇對所述凝膠著色以使PEG可視化，結果示于圖5中。泳道1中 的帶對應于未反應的PEG試劑，標記為C，標記D、E和F的帶分別對應于單PEG化產物、二 PEG化產物和三PEG化產物。標記B和A的較低帶分別對應于所提供的試樣中的未反應的 His6-ProBNP和雜質。泳道3由3當量的12kDa PEG反應混合物獲得，其示出標記C的帶， 其對應于未反應PEG試劑；標記D、E和F的帶，其分別對應于單PEG化產物、二 PEG化產物 和三PEG化產物。標記B和A的較低帶分別對應于所提供的試樣中的未反應的His6-ProBNP 前體和雜質。實施例2 Hi S6-ProBNP 的 30kDa PEG 化將PEG雙砜(實施例1中的結構(1))在pH為7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液(IOmg/ mL)中培養5小時，以制備30kDa PEG單砜(實施例1中的結構⑵)。將兩等份的溶于pH 7. 8 的 50mM 磷酸鈉中的 C 端 6X 組氨酸標簽 proBNP (Abcam, ab51402) (10 μ L，0. 5mg/mL) 用冰冷卻，然后加入1摩爾當量(相對于蛋白質的濃度)或3摩爾當量的30kDa PEG單砜 (分別為2. O μ L或6. O μ L)。然后將所述反應物置于冰箱中放置16小時。所得反應混合物使用SDS-PAGE進行分析，以根據大小分離其成分，使用Instant Blue(Novexin)著色后形成的凝膠示于圖6中。標記M的泳道示出Novex Sharp蛋白質標 記(Invitrogen)作為校準物。泳道1中標記B的帶是所提供的His6-proBNP試樣(Abcam，lmg/mL)。帶A為雜質。標記2的泳道由1當量的30kDa PEG反應混合物獲得，并示出標記 C的帶，其對應于單PEG化的產物；以及標記A和B的較低帶，其分別對應于所提供的試樣 中未反應的His6-ProBNP和雜質。標記3的泳道由3當量的30kDa PEG反應混合物獲得， 其示出標記C和D的帶，其分別對應于單PEG化產物和二 PEG化產物；以及標記B和A的較 低帶，其分別對應于所提供的試樣中未反應的His6-ProBNP和雜質。然后將所述凝膠使用碘化鋇著色以使PEG可視化，結果示于圖7中。標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。泳道1中標記B的帶是所提 供的His6-proBNP試樣(Abcam，lmg/mL)。帶A為雜質。標記2的泳道由1當量的30kDaPEG 反應混合物獲得，且示出標記C的帶，其對應于單PEG化的產物；標記F的帶，其對應于PEG 雜質；標記D、E和F的帶，其分別對應于單PEG化產物和二 PEG化產物，以及標記B和A的 較低帶，其分別對應于所提供的試樣中未反應的His6-ProBNP和雜質。標記3的泳道由3 當量的30kDa PEG反應混合物獲得，并示出標記C的帶，其對應于未反應的PEG試劑；標記 F的帶，其對應于PEG雜質；標記D和E的帶，其分別對應于單PEG化產物和二 PEG化產物； 以及標記B和A的帶，其分別對應于所提供的試樣中未反應的His6-ProBNP和雜質。實施例3 =His8-β突觸核蛋白的12kDa PEG化和與不帶組氨酸標簽的β突觸核 蛋白的對比反應將PEG雙砜(實施例1中的結構(1))在PH 7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液(10mg/mL) 中培養5小時，以制備12kDa PEG單砜(實施例1中的結構⑵)。將兩等份的溶于pH 7.8 的50mM磷酸鈉中的N端8X組氨酸標簽β突觸核蛋白(Abeam cat.no. ab40545,15kDa) (10uL,0. 39mg/mL)用冰冷卻，然后加入1摩爾當量(相對于蛋白質濃度)或者3摩爾當量 的12kDa PEG單砜(分別為1. 6 μ L或4. 7 μ L)。然后將所述反應物置于冰箱中放置16小 時。使用SDS-PAGE分析形成的反應混合物以根據大小分離其成分，用Instant Blue(Novexin)著色后生成的凝膠示于圖8中。標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp 蛋白質標記(Invitrogen)。泳道1中標記B的帶是由Abcam提供的His8- β突觸核蛋白試樣(0. 8mg/mL)。帶 A為雜質。標記2的泳道由1當量的12kDa PEG反應混合物獲得，并示出標記C和D的帶， 其分別對應于單PEG化產物和二 PEG化產物；以及標記A和B的較低帶，其分別對應于提供 的試樣中的未反應的His8-i3突觸核蛋白和雜質。標記3的泳道由3當量的12kDa PEG反 應混合物獲得，并示出標記C、D、E和F的帶，其分別相應于單PEG化產物、二 PEG化產物、三 PEG化產物和四PEG化產物；以及標記B和A的較低帶，其分別對應于提供的試樣中的未反 應的His8-i3突觸核蛋白和雜質。然后再將所述凝膠用碘化鋇著色以使PEG可視化，形成的凝膠示于圖9中。在圖9 中，標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1的泳 道由Abcam提供的His8-β突觸核蛋白獲得。標記2的泳道由1當量的12kDa PEG反應混 合物獲得，并示出標記C、D和E的帶，其分別對應于單PEG化產物、二 PEG化產物和三PEG 化產物；以及標記B和A的較低帶，其分別對應于提供的試樣中的未反應的His8-β突觸核 蛋白和雜質。標記3的泳道由3當量的12kDa PEG反應混合物獲得，并示出標記D、E和F 的帶，其分別對應于單PEG化產物、二 PEG化產物、三PEG化產物和四PEG化產物；以及標記B和A的較低帶，其分別對應于提供的試樣中的未反應的His8-i3突觸核蛋白和雜質。帶C 為PEG雜質。在pH 7.0時使用1當量的PEG試劑⑵對His8_i3突觸核蛋白和不帶組氨酸標 簽的β突觸核蛋白(Abeam, cat no. ab48853)進行對比12kDa PEG化研究，SDS-PAGE結果 示于圖10中。標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。 His8-β突觸核蛋白結果示于標記1的泳道中。在泳道1中，標記B的帶是未反應的His8-β 突觸核蛋白，標記C的帶是單PEG化的His8-β突觸核蛋白。標記2的泳道示出不帶組氨 酸標簽的β突觸核蛋白反應，唯一可見的帶為標記A且其為不帶組氨酸標簽的β突觸核 蛋白。泳道2中沒有PEG化的蛋白質帶。實施例4 =His8-β突觸核蛋白的30kDa PEG化將PEG雙砜(實施例1中的結構(1))在pH 7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液(10mg/mL) 中培養5小時，以制備30kDa PEG單砜(實施例1中的結構(2))。將一份溶于pH 7. 8的50mM 磷酸鈉中的N端8X組氨酸標簽β突觸核蛋白(Abcam，ab40545,15kDa) (10 μ L,0. 39mg/ mL)用冰冷卻，然后加入1摩爾當量(對于蛋白質濃度)的30kDa PEG單砜(1.6yL)。然 后將所述反應物置于冰箱中放置16小時。使用SDS-PAGE分析形成的反應混合物以根據大小分離其成分，用Instant Blue(Novexin)著色后形成的凝膠示于圖11中。在圖11中，標記M的泳道示出作為校準 物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1的泳道由Abcam提供的His8-β突觸 核蛋白試樣(0.8mg/mL)獲得，標記B的帶是帶有多聚組氨酸標簽的蛋白質，并且標記A的 帶為雜質。標記2的泳道由1當量的30kDa PEG反應混合物獲得，并示出標記C的帶，其 對應于單PEG化產物；以及標記A和B的較低帶，其分別對應于提供的試樣中的未反應的 His8-β突觸核蛋白和雜質。然后再用碘化鋇對所述凝膠著色以使PEG可視化，形成的凝膠示于圖12中。在圖 12中，標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1的 泳道由Abcam提供的His8-β突觸核蛋白獲得。標記2的泳道由1當量的30kDa PEG反應 混合物獲得，并示出標記C的帶，其對應于未反應的PEG試劑；標記E和G的帶，其對應于 PEG雜質；標記D和F的帶，其分別對應于單PEG化產物和二 PEG化產物；以及標記B和A 的較低帶，其分別對應于提供的試樣中的未反應的His8-P突觸核蛋白和雜質。實施例5 用IOkDa和20kDa PEG試劑2對C端8組氨酸序列的IFN α -2b中的組 氨酸的PEG化<formula>formula see original document page 18</formula>步驟1，對羧基-3-呱啶基苯丙酮鹽酸鹽3 (2)的合成<formula>formula see original document page 19</formula>向250ml的圓底燒瓶中加入對乙酰基苯甲酸(15. Og，3 (1))、11. Ilg哌啶鹽酸鹽和 8.23g多聚甲醛。然后加入無水乙醇(90ml)和濃鹽酸(Iml)，所得懸浮液在氬氣下加熱回 流10h，同時進行攪拌。停止回流后，加入丙酮(150ml)并將反應混合物冷卻至室溫。生成 的白色沉淀通過玻璃濾器(G3)分離，并用冷丙酮洗滌兩次。然后將固體在真空下干燥，得 到一種白色晶體粉末(3(2)，9. 72g)。1H 匪 R(400MHz，DMS0-d6) δ 1. 79,2. 96,3. 45 (br m，哌 啶部分的 CH2)，3. 36 (t, 2H, COCH2)，3. 74 (t, 2H, NCH2)，8. 09 (m, 4H, ArH)。步驟2 :4-(3_(對甲苯基硫)丙酰基)苯甲酸3(5)的合成將對羧基-3-呱啶基苯丙酮鹽酸鹽3 (2) (l.Og)和4_甲基苯硫酚(417mg，3(3)) 懸浮于無水乙醇(7. 5ml)和甲醇(5ml)的混合物中。然后加入哌啶(501)，并將懸浮液在氬 氣環境中在攪拌下加熱回流6h。冷卻至室溫后，得到的白色沉淀用玻璃濾器(G3)濾出，用 冷丙酮小心洗滌并真空干燥，得到3 (3) (614mg)。1H NMR (400MHz, DMS0-d6) δ2. 27(s，3H，苯 基-CH3)，3. 24，3. 39(t，2x 2H, CH2)，7. 14，7. 26 (d，2x 2H，甲苯基部分的 ArH)，8. 03 (m，4H， 羧酸部分的ArH)。步驟3 4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸3(4)的合成將4-(3_(對甲苯基硫)丙酰基)苯甲酸3(4) (160mg)懸浮于水(IOml)和甲醇 (IOml)的混合物中。在冰浴中冷卻后，加入過硫酸氫鉀(720mg，Aldrich)，并將反應混合 物升溫至室溫并攪拌過夜(15h)。所得懸浮液用另外的水(40ml)稀釋以變得接近均勻，然 后將混合物用氯仿(總計IOOml)萃取三次。合并的氯仿萃取物用鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥。在30°C于真空下使揮發物蒸發，得到一種白色固體3(4) (149mg)。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 2. 41 (s, 3H,苯基-CH3)，3. 42 (t, 2H, CO-CH2)，3. 64 (t, 2H, SO2-CH2) ,7. 46, 7. 82 (d, 2x 2H，甲苯基部分的ArH)，8. 03 (m, 4H，羧酸部分的ArH)。步驟4 =PEG化的4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸，PEG試劑3的合成將4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸3(4) (133mg)和0_ (2_氨基乙基)-甲 基-PEG (MW IOkDa, 502mg, BioVectra)溶于干燥的甲苯(5ml)中。在真空且不加熱的條件 下除去溶劑，然后在氬氣下將干燥固體殘渣再溶于干燥的二氯甲烷中(15ml)。在氬氣下向 在冰浴中冷卻后的溶液中緩慢加入二異丙基碳二亞胺(DIPC，60mg)。然后將反應混合物室 溫攪拌過夜(15h)。然后在真空下(30°C，水浴)除去揮發物，得到一種固體殘渣，將所述 固體殘渣微熱(35°C )溶于丙酮(20ml)中。所述溶液在非吸水脫脂棉上過濾以除去不溶 物。然后將溶液在干冰浴中冷卻，得到一種白色沉淀，將所述白色沉淀離心分離(4600rpm， 30min)。傾出液體相，并將所述沉淀步驟重復三次。隨后減壓干燥所得灰白色固體，得到 PEG試劑 3(437mg) ZH NMR(400MHz, CDCl3) δ 2. 46 (s，3Η，苯基-CH3)，3· 38 (s, 3Η, PEG-OCH3)， 3.44-3. 82 (br m, PEG)，7. 38，7. 83 (d，2x 2H，甲苯基部分的 ArH)，7. 95 (m，4H，羧酸部分的 ArH)。步驟5 對C端his8_標簽的IFN α -2b的組氨酸的PEG化向 20μ 1 的 IFNa -2b 溶液(1. 13mg/ml，溶于含有 2mM EDTA 禾口 150mM NaCl 的 IOmM 磷酸鈉緩沖液中，PH 7. 5)中加入1摩爾當量的IOkDa PEG試劑3 (1. 8 μ 1的6mg/ml的去離 子水溶液)，所得溶液室溫培養過夜。使用還是通過與上述所給的類似的方法制備的1摩爾 當量的20kDa PEG試劑重復進行一次(3.3μ1的6.6mg/ml的去離子水溶液。然后兩種試 樣均通過SDS-PAGE分析(NuPAGE Novex4-12% Bis-Tris凝膠、MES電泳緩沖液——
其均從 Invitrogen 獲得-以及 Instant Blue 著色(Expedeon cat. No. ISBlL)) 結果示
于圖13中。在標記1的泳道中的是蛋白質標記。泳道2只有起始IFN。泳道3示出IOkDa PEG試劑反應的結果。在對應于用1至5PEG鏈綴合的IFN的30和160KDa蛋白質標記之 間存在5條不同的帶。泳道4示出20kDa PEG試劑反應的結果。在對應于1至3PEG鏈綴 合的IFN的60和IlOKDa蛋白質標記之間存在3條不同的帶。標記5的泳道是沒有著色的 20kDa PEG試劑，所以所述帶不可見。標記6的泳道是沒有著色的IOkDa PEG試劑，所述所 述帶不可見。實施例6 =His8- β -突觸核蛋白的5kDa PEG化
廠OH
O ^3=X O ι~SO2-^
PEG—N-U-H^ V-U-/廠 OH
^~‘^~SO2-^
(4)2
O t-, O
PH 7.8H IlU
(5)
將PEG雙砜(結構(4))在ρΗ 7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液(5mg/mL)中培養3小時， 以制備5kDa PEG單砜(結構(5))。將兩等份的溶于ρΗ 7. 4的50mM磷酸鈉中的N端8 X 組氨酸標簽 β 突觸核蛋白(Abeam cat. no. ab40545,15. 4kDa) (10 μ L，0. 38mg/mL)用冰冷 卻，然后加入1摩爾當量(相對于蛋白質濃度)或者3摩爾當量的5kDa PEG單砜(5)(分別 是0. 25yL或0. 74yL)。作為對照，將兩等份的β突觸核蛋白(Abeam cat.no. ab48853, 14. 3kDa)用相同的方式處理，并提供1摩爾當量(0. 18 μ L)或者3當量(0. 52 μ L)的 5kDaPEG單砜。然后將反應物在室溫培養6h。所得反應溶液使用SDS-PAGE進行分析，并 用Instant Blue(Expedeon)著色，如圖14所示。標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1和2的泳道分別由1當量的5kDa PEG反應混合 物和3當量的PEG反應混合物獲得。標記A的帶是His8-P突觸核蛋白。其下微弱的帶是 由Abcam提供的蛋白質中的雜質。標記B、C、D和E的帶分別對應于單PEG化、二 PEG化、三 PEG化和四PEG化的蛋白質產物。實施例7 在不同ρΗ時的His6-抗TNF- α域抗體片段的IOkDaPEG化將PEG雙砜(實施例1中的結構(1)，10mg/mL)在ρΗ 7.8的50mM磷酸鈉緩沖 液(5mg/mL)中培養3小時，以制備IOkDa PEG單砜(實施例1中的結構(2))。在4個不 同pH(pH 6. 2、ρΗ 6. 7、ρΗ 7.0和ρΗ 7. 4)制備C端6X組氨酸標簽抗TNF α域抗體片段 (12. 7kDa)于50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉和2mM EDTA中的溶液(0. 6mg/mL)。向處于四個 不同PH中每一個的His6-域溶液(10μ L，0. 6mg/mL)中加入三摩爾當量的IOkDa PEG單砜 ((2)，1. 41 μ L)。然后將反應物在室溫培養3h。使用SDS-PAGE分析形成的反應溶液，并用Instant Blue(Expedeon)著色，如圖15 所示。標記M的泳道示出Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1至4的泳道分別 在ρΗ 6. 2、pH 6. 7、pH 7. O和ρΗ 7. 41由使用3摩爾當量的IOkDa PEG的反應混合物獲得。 標記A的帶是未反應的His6-抗TNF α域抗體片段。標記B的帶是單PEG化的域產物。標 記C和D的帶分別對應于二 PEG化和三PEG化的域片段。在四個ρΗ中每一個時均觀察到 PEG化，且PEG化的程度隨ρΗ的增加而增加。實施例8 使用 10kDa、20kDa、30kDa 和 40kDa PEG 的 His6-抗 TNF- α 域抗體片段 的PEG化10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG雙砜(實施例1的結構(1))在室溫下分別于ρΗ 7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液中培養3小時，以得到相應的PEG單砜(實施例1的結構⑵)。 對于 10kDa、20kDa、30kDa 和 40kDa PEG 而言，PEG 的濃度分別為 10mg/mL、20mg/mL、30mg/ mL和40mg/mL。然后向四等份的C端6組氨酸標簽抗TNF域抗體(12. 7kDa)于50mM磷酸 鈉、150mM 氯化鈉和 2mM EDTA 中的溶液(1. 25mg/mL, 5 μ L)中加入 10kDa、20kDa、30kDa 禾口 40kDa PEG單砜溶液(0. 74 μ L，1. 5摩爾當量)。然后將該反應物在4°C培養8小時。然后 使用SDS-PAGE分析所述反應溶液，如圖16所示。標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1的泳道是作為參照示出的His6-抗TNF域抗體片 段。標記2至5的泳道分別由10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG的反應獲得。標記A的帶 是未反應的His6-抗TNF域。標記B的帶_、B20、B30和B40)分別對應于10、20、30禾口 40kDa PEG的單PEG化的域片段。標記ClO的帶對應于IOkDa PEG反應的二 PEG化產物， C20帶對應于20kDa PEG反應的二 PEG化產物。
實施例9 =His6-內皮他丁的2kDa PEG化以及與不帶多聚組氨酸標簽的內皮他丁 的對比反應將PEG雙砜(實施例1中的結構(1))在pH 7. 8的50mM磷酸鈉緩沖液中(lmg/mL)培養4小時，以制備2kDa PEG單砜(實施例1中的結構⑵)。將兩等份的溶于pH 6. 2 的50mM磷酸鈉中的C端6X組氨酸標簽內皮他丁(Calbiochem cat.no. 324743) (30 μ L, 0. 5mg/mL)用冰冷卻，然后加入1摩爾當量(相對于蛋白質濃度)或者3摩爾當量的2kDa PEG單砜(分別是1. 4 μ L或4. 2 μ L)。然后將反應混合物置于冰箱中放置16小時。將兩等份的溶于pH 6. 2的50mM磷酸鈉中的不帶標簽的內皮他丁(Calbiochem cat. no. 324769) (10 μ L，0. 2mg/mL)也用冰冷卻，然后加入1摩爾當量(相對于蛋白質濃 度)或者3摩爾當量的2kDaPEG單砜(0. lmg/mL)(分別是2. O μ L或6. O μ L)。然后將反應 物置于冰箱中放置16小時。使用SDS-PAGE分析形成的反應溶液以根據大小分離其成分，用Instant Blue(Expedeon)著色后形成的凝膠示于圖17中。在圖17中，標記M的點的左側柱 (left-hand column)示出Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1的泳道由1當 量的2kDa PEG與His6-內皮他丁反應的試樣獲得，并示出標記B和C的分別對應于未反應 的蛋白質和單PEG化產物的帶。標記2的泳道由3當量的2kDa PEG與His6-內皮他丁反應 的試樣獲得，并示出標記B和C的分別對應于未反應的蛋白質和單PEG化的產物的帶。標 記3和4的泳道分別由1當量的2kDa PEG與內皮他丁反應和3當量的2kDa PEG與內皮他 丁反應獲得。對兩個反應而言，僅存在一個分別標記為A和B的對應于未反應的蛋白質的 帶，表明2kDa PEG僅與His6-內皮他丁反應。實施例10 =His8-干擾素α的20kDa和30kDa PEG化及與不帶組氨酸標簽的干擾 素α的對比反應在含有150mM氯化鈉的pH 7. 4的50mM磷酸鈉緩沖液(PBS)中制備N端8X組氨 酸標簽干擾素α "2b溶液(2. 63mL, 1. 14mg/mL)，然后加入1. 7摩爾當量的(相對于蛋白質 濃度)的2OkDa PEG雙砜(實施例1的結構(1)) (420 μ L的11. 5mg/mL 2OkDa PEG雙砜的 去離子水溶液)。將反應物置于冰箱中18小時。通過SDS-PAGE分析所述形成的反應混合 物，結果示于圖18中。在圖18中，標記M的泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標 記(Invitrogen)。標記1的泳道示出所述反應溶液，其中標記A的帶對應于未反應的IFN， 標記B的帶對應于單PEG化的IFN，標記C的帶對應于二 PEG化的IFN，及標記D的帶對應 于三PEG化的IFN。第二個反應使用1當量的0. 5mg/ml的30kDa PEG與pH 7. 5的N端8 X組氨酸標 簽干擾素α -2b溶液(3. 2mL，0. 793mg/mL)。結果與20kDa反應類似，在60和80kDa蛋白質 標記間可見一個單PEG化的IFN帶，一個在110和160kDa間的對應于二 PEG化的IFN的帶 和在160和260kDa蛋白質標記間的對應于三PEG化的IFN的第三個帶。使用不帶組氨酸 標簽的INF α-2b的對比反應顯示，在相同條件下，18h后，與1當量的PEG試劑(1)不發生 反應，結果示于圖18的泳道2。實施例11 使用聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP雙砜)綴合至N端8X組氨酸標簽干擾 素α制備帶末端氨基的PVP 將半胱胺(0. 042g)、二氧雜環已烷(8ml)和一個磁力攪拌棒裝入一個壓力管中。微熱形成溶液后，在室溫下用氬氣吹掃該溶液5min。然后仍在 吹掃下加入1-乙烯基-2-吡咯烷酮(2.(^)，再過5!^11后，加入2，2’-偶氮二(2-甲基丙 腈)(0.089g)。再經過2min后，在氬氣下用螺帽將壓力管密封，并在攪拌下置于60°C的油 浴23h。將所述管及其中所含物質冷卻至室溫后，加入乙醚(15ml)以使聚合產物沉淀。傾 倒掉液相并將固體殘渣再溶于丙酮(3ml)中。然后將形成的丙酮溶液滴加至快速攪拌的乙 醚(25ml)中，沉淀在具有微弱真空脈沖的2號燒結玻璃漏斗上分離。所述固體用新鮮乙醚 (IOml)洗滌，然后在室溫真空下干燥(質量=1.248，白色固體)。將蛋白質反應件末端基團綴合至PVP-胺在氬氣下將PVP-胺(500mg)、4_[2， 2_ 二 [(對甲苯基磺酰基)甲基]乙酰基]-苯甲酸(125mg)和4-二甲基氨基吡啶(6mg) 與無水二氯甲烷(IOml)混合，然后在攪拌下加入1，3-二異丙基碳二亞胺(80 μ 1)。所得混 合物室溫攪拌20h，然后通過非吸水脫脂棉過濾。然后向濾液中加入乙醚(20ml)并通過離 心法(2000rpm，2min，2°C )分離形成的沉淀。傾倒掉液相，并用乙酸乙酯(5ml)使剩余的殘 渣渦動(vortexed)幾分鐘。傾倒掉乙酸乙酯相后，將固體殘渣再溶于二氯甲烷(5ml)中， 接著加入乙酸乙酯(15ml)。將所述溶液在干冰中放置15min以使固體沉淀，然后將所述固 體通過離心法(2000rpm，2min，2°C )分離。用新鮮乙酸乙酯(5ml)使得到的粘性殘渣渦動， 然后在室溫真空下干燥(質量=0. 118g)。
PVP雙砜的分餾將從上沭步驟獲得的固體物質與20mM乙酸鈉、150mM NaCl的pH 4. 0水緩沖液混合，然后在13000rpm下離心直至得到透明溶液。從固體殘渣中除去溶液相， 然后在以 lml/min 流動的 20mM 乙酸鈉緩沖液，150mM, pH 4. 0 的 HiLoad 16/60Superdex 200pg凝膠過濾柱上(GE Healthcare)通過在峰洗脫期間收集每一分鐘的餾分而使所述溶 液相分餾。在72至SOmin洗脫的餾分用于蛋白質綴合。PVP與N端8 X組氨酸標簽IFN α的綴合在含有150mM氯化鈉的7. 5的50mM磷 酸鈉緩沖液(PBS)中制備 IFN (0. 025mg，0. 5mg/ml)。向 50 μ 1 的 IFN (25 μ g，0. 5mg/ml)中 加入50 μ 1分餾的PVP雙砜溶液(72min、74min、76min、78min和80min時的餾分)。將形成 的溶液緩和地混合并在4°C放置過夜。通過SDS-PAGE分析形成的反應溶液，結果示于圖19 中。在圖19中，標記M的泳道示出作為校準物的NovexSharp蛋白質標記(Invitrogen)。 標記2至5的泳道示出使用不同尺寸的PVP試劑餾分(從2至5分別是72min至SOmin時 的PVP餾分)的反應溶液。標記B的帶示出獲得的單PVP化及多PVP化的IFN。實施例12 使用N端8X組氨酸標簽干擾素α進行的干擾素α與干擾素α的
多聚體綴合
(β)、^\Jr在含有150mM氯化鈉的pH 7. 5的50mM磷酸鈉緩沖液(PBS)中制備N端8X組氨 酸標簽干擾素a_2b溶液(50yL，l. 14mg/mL)，然后加入0. 125摩爾當量(相對于蛋白質濃 度)的IOkDa PEG雙官能PEG試劑(6) (0. 47 μ L的8mg/mL(6)的水溶液)。將反應物在室 溫放置18小時。通過SDS-PAGE分析形成的反應混合物。使用Instant Blue(Expedeon)著色之后，所得凝膠示出50kDa和60kDa Novex sharp蛋白質標記(Invitrogen)之間的帶，其對應于IFN-PEG-IFN融合綴合物。實施例13 :N端8X組氨酸標簽干擾素α與含有游離半胱氨酸的人血漿白蛋白 (HAS)的多聚體綴合向在含有150mM氯化鈉的pH 7. 5的50mM磷酸鈉緩沖液(PBS)中制備的N端8X 組氨酸標簽干擾素α "2b溶液(lmL，1. 14mg/mL)中加入人血漿白蛋白(相對于IFN為3摩 爾當量，10. 77mg)并使其溶解。向該溶液中加入IOkDa PEG 二(雙砜)(實施例12中的結 構(6))(相對于IFN為1摩爾當量，75 μ L的8mg/mL IOkDa PEG 二(雙砜)(6)水溶液)。 將該反應混合物在室溫放置18小時。將所得反應混合物通過離子交換色譜，接著通過金 屬離子親和色譜純化，然后通過SDS-PAGE分析，結果示于圖20中。在圖20中，標記M的 泳道示出作為校準物的Novex Sharp蛋白質標記(Invitrogen)。標記1的泳道示出純化 的反應溶液，其中標記A的帶是未反應的IFN，標記B的帶是單PEG化的IFN，標記C的帶是 IFN-PEG-IFN，及標記D的帶是IFN-PEG-白蛋白。
權利要求
一種化合物，其包含一種綴合至蛋白質或肽上的聚合物，所述綴合經由一種多聚組氨酸標簽進行。
2.權利要求1的化合物，其中所述多聚組氨酸標簽含有2至12個組氨酸殘基。
3.權利要求2的化合物，其中所述多聚組氨酸標簽含有4至10個組氨酸殘基。
4.前述權利要求中任一項的化合物，其中所述聚合物是一種聚烷撐二醇，一種聚乙烯 吡咯烷酮，一種聚丙烯酸酯，一種聚甲基丙烯酸酯，一種聚噁唑啉，一種聚乙烯醇，一種聚丙 烯酰胺，一種聚甲基丙烯酰胺，一種HPMA共聚物，一種聚酯、聚縮醛、聚(原酸酯)、聚碳酸 酯、聚(碳酸亞胺酯)、聚酰胺，一種環氧烷與一種聚酯、聚縮醛、聚(原酸酯)或聚(氨基 酸)的共聚物，一種多糖，一種蛋白質、多聚谷氨酸，一種糖或一種氨基酸與一種合成單體 的共聚物，或者二乙烯基醚_馬來酸酐與苯乙烯_馬來酸酐的共聚物。
5.權利要求4的化合物，其中所述聚合物是一種聚烷撐二醇。
6.權利要求5的化合物，其中所述聚合物是一種含有C2和/或C3單元的聚烷撐二醇。
7.權利要求6的化合物，其中所述聚合物是一種聚乙二醇。
8.權利要求6的化合物，其中所述聚合物是一種蛋白質。
9.前述權利要求中任一項的化合物，其中所述綴合的蛋白質或肽是一種肽、多肽、抗 體、抗體片段、酶、細胞因子、趨化因子、受體、血液因子、肽激素、毒素、轉錄蛋白或多聚體蛋 白。
10.權利要求9的化合物，其中所述綴合的蛋白質或肽是一種抗體或一種抗體片段。
11.前述權利要求中任一項的化合物，其中所述綴合的蛋白質或肽為一種已與一種或 多種嵌段基團反應以保護其上的敏感基團的天然蛋白質；或為一種還綴合有一種或多種聚 合物、作為治療劑或診斷劑的小分子、唾液酸、糖和/或淀粉的蛋白質。
12.前述權利要求中任一項的化合物，其為一種以下通式的化合物<formula>formula see original document page 2</formula>其中X和V中的一個代表一種聚合物，另一個代表氫原子；每個Q獨立地代表一種連接基團；W代表一種吸電子基團或可通過還原一種吸電子基團而得到的基團；或者，如果X’代 表一種聚合物，則X-Q-W- —起可代表一種吸電子基團；另外，如果X代表一種聚合物，則X’ 和吸電子基團W可與其間的原子一起形成環；Z代表經由一種多聚組氨酸標簽連接至A和B的一種蛋白質或一種肽；A是一種Cp5亞烷基或亞烯基鏈；并且B是一個鍵或一種Cy亞烷基或亞烯基鏈。
13.權利要求12的化合物，其中每個Q獨立地代表一個直接的鍵、一種C1,亞烷基或 一種任選被取代的芳基或雜芳基，其中任一基團可被一個或多個氧原子、硫原子、-NR基團、 酮基、-O-CO-基團和/或-C0-0-基團封端或間隔，其中R代表氫原子或烷基或芳基。
14.權利要求13的化合物，其中Q是一種亞烷基或一個直接的鍵。
15.權利要求13或14的化合物，其中W代表酮基或醛基CO、酯基-O-CO-或砜基-SO2-, 或一種通過還原此類基團獲得的基團；或其中X-Q-W- —起代表一種吸電子基團。
16.權利要求13至15中任一項的化合物，其中X是一種聚合物，且X’-Q-為H-。
17.權利要求1至11中任一項的化合物，其為一種以下通式的化合物 X-[Q-ff-(CH = CH) v-(CH2)2-ZJv, (Ib)其中X代表一種聚合物；Q代表一種連接基團；W代表一種吸電子基團或可通過還原一 種吸電子基團而得到的基團；ν代表0或一個從1至4的整數；ν’代表一個從1至8的整 數；并且Z代表經由一種多聚組氨酸標簽連接的一種蛋白質或一種肽。
18.權利要求17的化合物，其中ν為0。
19.一種用于制備前述權利要求中任一項的化合物的方法，其包括使一種聚合的綴合 試劑與一種含有多聚組氨酸標簽的蛋白質或肽在能夠使綴合經由所述多聚組氨酸標簽進 行的條件下反應。
20.一種以下通式的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>(I)其中X和V中的一個代表一種聚合物，另一個代表氫原子； 每個Q獨立地代表一種連接基團；W代表一種吸電子基團或可通過還原一種吸電子基團而得到的基團；或者，如果X’代 表一種聚合物，X-Q-W-—起可代表一種吸電子基團；另外，如果X代表一種聚合物，X’和吸 電子基團W可與其間的原子一起形成環；Z代表經由各組氨酸殘基連接至A和B的一種蛋白質或一種肽； A是一種Cp5亞烷基或亞烯基鏈；和 B是一個鍵或一種Cy亞烷基或亞烯基鏈。
21.權利要求20的化合物，其中所述各組氨酸殘基存在于天然蛋白質或肽中。
22.一種用于制備權利要求12至16、20和21中任一項的化合物的方法，其包括使(i) 一種以下通式的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>(II)其中X和X’中的一個代表一種聚合物，另一個代表氫原子； Q代表一種連接基團；W’代表一種吸電子基團；或者，如果X’代表一種聚合物，X-Q-W’ 一起可代表一種吸電子基團；A代表一種Cp5亞烷基或亞烯基鏈；B代表一個鍵或一種Cy亞烷基或亞烯基鏈；且 每個L獨立地代表一種離去基團； 或者(ii) 一種以下通式的化合物<image>image see original document page 4</image>其中Χ、Χ’、Q、W’、Α和L具有對于通式II所給出的含義，此外，如果X代表一種聚合物， 則V和吸電子基團W’可與其間的原子一起形成環，且m代表一個1至4的整數；與一種含有至少兩個組氨酸殘基的蛋白質或肽反應；以及如果需要，還原所述吸電子 基團W’。
23.權利要求22的方法，所述方法在約6.8至約8. 5的pH值范圍內進行。
24.權利要求23的方法，所述方法在約7.O至約8. O的pH值范圍內進行。
25.權利要求24的方法，所述方法在約7.5至約8. O的pH值范圍內進行。
26.—種藥物組合物，其含有權利要求1至18、20和21中任一項的化合物，以及一種可 藥用的載體。
27.權利要求1至18、20和21中任一項的化合物或權利要求26的藥物組合物用于治 療的用途。
28.—種對患者進行治療的方法，所述方法包括將藥學上有效量的權利要求1至18、20 和21中任一項的化合物或權利要求26的藥物組合物給藥于患者。
全文摘要
本發明提供了一種將一種聚合物、尤其是PEG綴合至一種蛋白質或肽上的新方法，所述方法包括使一種聚合的綴合試劑與一種含有多聚組氨酸標簽的蛋白質或肽在能夠使綴合經由所述多聚組氨酸標簽進行的條件下反應。形成的綴合物是新的。本發明還涉及新的通式(I)的綴合物，其中X和X’中的一個代表一種聚合物，另一個代表氫原子；每個Q獨立地代表一種連接基團；W代表一種吸電子基團或可通過還原一種吸電子基團而得到的基團；或者，如果X’代表一種聚合物，則X-Q-W-一起可代表一種吸電子基團；另外，如果X代表一種聚合物，則X’和吸電子基團W可與其間的原子一起形成環；Z代表經由各組氨酸殘基連接至A和B的一種蛋白質或一種肽；A為一種C1-5亞烷基或亞烯基鏈；并且B為一個鍵或一種C1-4亞烷基或亞烯基鏈。
文檔編號A61K47/48GK101820920SQ200880110579
公開日2010年9月1日 申請日期2008年10月8日 優先權日2007年10月9日
發明者A·戈德溫, K·鮑威爾, P·布賴恩特, S·布羅基尼, 叢越華, 崔志元 申請人:寶力泰銳克斯有限公司