腸激酶可切割的多肽的制作方法

腸激酶可切割的多肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及包含與多肽連接的腸激酶切割位點的腸激酶可切割多肽，及其通過表達制備目標多肽的用途。本發明還涉及用于表達該腸激酶可切割多肽的DNA序列、載體和宿主細胞。
【專利說明】
腸激酶可切割的多肽
技術領域
[0001] 本發明涉及蛋白質表達和蛋白質化學的技術領域，其中將從融合蛋白釋放成熟蛋 白質。
【背景技術】
[0002] 重組蛋白表達技術使得能夠產生大量的由于例如其生物活性而可使用的所需蛋 白質。這樣的蛋白質通常在微生物宿主細胞中表達為重組融合蛋白。感興趣的蛋白質常常 連接至融合伴侶蛋白或較小的氨基酸延伸，以便提高表達水平、促進分泌、增加溶解度、促 進蛋白質折疊，以保護該蛋白質免受非故意的蛋白水解或促進感興趣的蛋白質的純化。融 合伴侶蛋白需要通過蛋白水解從融合蛋白上去除，以獲得感興趣的蛋白質。
[0003] -種用于這樣的加工的蛋白酶是腸激酶(E.C.3.4.21.9)。該蛋白酶的生物學天然 功能是通過在酶原中的DDDDK加工位點（SEQ ID NO: 2,以下稱為D4K)處進行切割而將胰蛋 白酶原轉換成膜蛋白酶(Biochim.Biophys Acta 20(1956)443-434)。
[0004] 類似地，為了能夠實現腸激酶催化的融合伴侶蛋白的去除，在融合伴侶蛋白與感 興趣的蛋白質之間插入D4K加工位點。腸激酶催化的融合蛋白加工的特異性和效率現依賴 于例如D4K位點的相對水解速率和感興趣的蛋白質中的潛在內部降解位點。腸激酶不僅對 D4K位點，而且對相當多的其他序列具有活性，參見例如，Anal. Biochem. 106( 1980) 199-206 〇
[0005] 已經使用了若干種方法來彌補腸激酶具有有限的底物特異性的缺點。
[0006] US6906176描述了相對于D4K位點更為有效地被腸激酶切割的若干種肽序列。
[0007] PNAS 103(2006)7583-7588描述了比D4K位點更快地被腸激酶切割的肽序列。
[0008] Protein Expr.Purif.41(2005)332-340描述了包含肽序列LKGDR(SEQ ID N0:3) 的蛋白質在被腸激酶切割方面比D4K位點更加有效。
[0009] Protein Expr .Purif · 59(2008)314-319描述了通過在尿素的存在下進行切割反 應而增強了腸激酶切割的特異性。
[0010]需要更加特異性的腸激酶切割反應以用于去除融合伴侶蛋白而不切割成熟蛋白 質中的內部位點，并且不在成熟蛋白質上留下任何氨基酸延伸。優選地，該腸激酶切割反應 非常適合于在用于制備成熟蛋白質的工業過程中進行。還需要更加特異性的、可以在溫和 加工條件下用于許多不同的蛋白質的腸激酶切割反應，以使得成熟蛋白質不會發生非故意 的化學和物理改變。
[0011] 發明概述
[0012] 本發明的目標是提供包含腸激酶切割位點的腸激酶可切割融合多肽，該切割位點 比可以在所述腸激酶可切割融合多肽中存在的任何二級切割位點顯著更快地被水解。本發 明的另一目標是提供包含化學穩定的腸激酶切割位點的腸激酶可切割融合多肽。
[0013] 根據本發明的第一方面提供了一種用于制備目標多肽的方法，所述方法包括以下 步驟：
[0014] a)表達包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0015] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0016] 其中
[0017] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0018] X4是e、q、l、d、g、a、s、f、h、y、w、tSm;
[0019] X5選自除了S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0020] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸；
[0021] 辦是任選的多肽或氨基酸殘基；
[0022] 其中所述目標多肽是式(I)中的Z1;
[0023] b)使所述腸激酶可切割多肽與腸激酶在有利于切割的條件下接觸；
[0024] 以及
[0025] c)任選地分離所述目標多肽。
[0026] 根據本發明的第二方面提供了包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0027] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0028] 其中
[0029] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0030] X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM;
[0031] X5選自除了S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0032] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸;并且 [0033]辦是任選的多肽或氨基酸殘基;并且
[0034] 其中^叾:包含功能性多肽，如藥學活性的多肽或酶，或者ii)所述腸激酶可切割融 合多肽由式（I)組成，并且Z2包含40個或更少的氨基酸殘基，如Z 2F存在，辦是氨基酸殘基， 或者Z2是包含2-40個氨基酸殘基的多肽。
[0035] 在一個實施方案中，X4是D。在一個實施方案中，X4是E。在另一個實施方案中，X5-X4 是DE。在另一個實施方案中，X5-X4是DD。
[0036]在另一個實施方案中，21是61^_1肽。
[0037]根據本發明的第三個方面提供了編碼根據式（I)的腸激酶可切割融合多肽的DNA 序列。
[0038] 根據本發明的第四個方面提供了包含編碼根據式(I)的腸激酶可切割融合多肽的 DNA序列的表達載體，該DNA序列與上游啟動子和下游終止子可操作地連接。
[0039] 根據本發明的第五個方面提供了包含表達載體的宿主細胞，該表達載體包含編碼 根據式（I)的腸激酶可切割融合多肽的DNA序列，該DNA序列與上游啟動子和下游終止子可 操作地連接。
[0040] 發明詳述
[0041] 在一個實施方案中，本發明涉及包含式(I)的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0042] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0043] 其中
[0044] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0045] X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM;
[0046] X5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0047] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸;并且
[0048] Z2是任選的多肽或氨基酸殘基。在一個實施方案中，該腸激酶可切割融合多肽由 式（I)組成。
[0049] 如本文所用的術語"腸激酶"意在表示一種胰水解酶，其通過將胰蛋白酶原切割成 胰蛋白酶來催化活化，作為參與消化過程的催化級聯的一部分。"腸激酶"包括從任何來源 分離的天然酶以及通過重組表達產生的酶。腸激酶的一個非限制性實例是天然存在的二聚 體，其包含二硫鍵連接的約115kDa的重鏈和約35kDa的較小輕鏈。腸激酶的另一個非限制性 實例是包含催化結構域的單獨的輕鏈。據描述，單獨的輕鏈及其功能性變體表現得與腸激 酶一樣好，參見 W02013/092855A1。
[0050] 如本文所用的術語"融合多肽"意在表示這樣的多肽，其包含例如為了組成非天然 存在的多肽而融合在一起的兩個或更多個多肽。所融合的多肽的大小可以變化并且取決于 融合多肽的目的。為了提高表達，融合多肽經常地在蛋白質的重組表達過程中使用，以促進 可溶性表達產物的維持、以促進融合多肽或其部分向細胞外介質的排出、以保護多肽免于 被蛋白酶或肽酶非故意地處理，等等。在這樣的融合多肽中，至少兩個組成多肽中的一個通 常被指定為"目標多肽"或"成熟蛋白質"，即，是有待通過重組表達過程制備的多肽。
[0051] 如本文所用的術語"腸激酶可切割融合多肽"意在表示這樣的融合多肽，其包含例 如為了組成非天然存在的多肽而在腸激酶切割位點的每一端融合在一起的兩個多肽，在合 適的條件下，該非天然存在的多肽可以在連接兩個多肽的腸激酶切割位點處被腸激酶切 害J。因此，該腸激酶可切割融合多肽是非天然存在的多肽。應理解，該腸激酶可切割融合多 肽所包含的兩個多肽中的每一個均可含有也被腸激酶識別并切割的二級位點。但是，這樣 的二級切割位點將以一定的速率經歷腸激酶的切割，該速率低于腸激酶切割根據本發明的 預期切割位點的速率。在一個實施方案中，該腸激酶可切割融合多肽中的所有二級腸激酶 切割位點均以比切割相應的D4K位點的速率更低的速率被腸激酶切割。
[0052]在本文中，術語"蛋白質"、"多肽"和"肽"可以可互換地使用，以表示多肽。應理解， 所使用的具體術語對于分子的大小沒有限制(除非在特定的情況下直接規定）。
[0053]根據按照IUPAC命名法的單字母縮寫來指定氨基酸殘基，例如，D表示天冬氨酸 (Asp)而G表示甘氨酸(Gly)。
[0054]如本文所用的"遺傳編碼的氨基酸"意在表示由以下氨基酸組成的組:G、P、A、V、L、 I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S、T以及它們的任何生物學修飾。在一個實施方案中，適合在 本發明中使用的氨基酸包括遺傳編碼的氨基酸的電子等排體。這樣的生物學修飾的非限制 性實例是例如酰胺化、糖基化和二硫鍵形成。
[0055] 如本文所用的"類似物"意在表示這樣的蛋白質，其衍生自另一種蛋白質，通過對 該蛋白質的一個或多個氨基酸殘基的置換、缺失和/或添加而得到。GLP-I (7-37) (SEQ ID N0:4)的類似物的非限制性實例是殘基34已被精氨酸殘基置換的K34R-GLP-1(7-37)(SEQ ID勵:5)和殘基34已被精氨酸殘基置換并且氨基酸殘基7-8已經缺失的1(341?-61^-1(9-37) (SEQ ID N0:6)(采用GLP-I肽的氨基酸殘基的常用編號）。在一個實施方案中，GLP-l(7-37) (SEQ ID N0:4)是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。
[0056] 如本文所用的"功能性變體"意在表示某種蛋白質的化學變體，其保留與原始蛋白 質基本相同的主要功能。因此，功能性變體通常是蛋白質的修飾形式，其中引入使修飾的蛋 白質獲得一些期望的性質、同時保留原始蛋白質的基本相同的主要功能所需的盡可能少的 修飾。功能性變體的非限制性實例是例如延伸的蛋白質、截短的蛋白質、融合蛋白和類似 物。牛腸激酶輕鏈的功能性變體的非限制性實例是例如C112A牛腸激酶輕鏈。GLP-l(7-37) 的功能性變體的一個非限制性實例是K34R-GLP-l(7-37)。
[0057]在一個實施方案中，蛋白質的功能性變體與所述蛋白質相比包含1-2個氨基酸置 換、缺失或添加。在另一實施方案中，功能性變體與所述蛋白質相比包含1-5個氨基酸置換、 缺失或添加。在另一實施方案中，相對于相應的天然存在的蛋白質或天然存在的蛋白質亞 序列，功能性變體包含1-15個氨基酸置換、缺失或添加。
[0058]在一個實施方案中，22包含增溶結構域。如本文所用的"增溶結構域"意在表示這 樣的蛋白質，其為融合蛋白的一部分并且使所述融合蛋白在某些條件下比融合伴侶蛋白本 身更加可溶。可用作式（I)中的Z2的增溶結構域的非限制性實例是DsbC(巰基:二硫鍵互換 蛋白）、如W02008/043847中描述的RL9 (核糖體蛋白L9)、MPB(麥芽糖結合蛋白）、NusA(轉錄 終止/抗終止蛋白）和Trx(硫氧還蛋白）。
[0059] 如本文所用的"非天然存在的多肽"意在表示這樣的多肽，在沒有人為干預的情況 下，不知其存在或者其不存在于自然界中。非天然存在的多肽的非限制性實例是例如融合 多肽，其中兩個來自于不同來源的蛋白質融合在一起成為一個多肽。
[0060] 如本文所用的術語"GLP-1肽"意在表示GLP-I (7-37)、GLP-1 (7-36)酰胺及其類似 物，它們能夠通過常規重組DNA技術以及常規合成方法產生。這樣的GLP-I肽包括但不限于 也可被稱為人GLP-I的天然胰高血糖素樣肽-1，例如，如WO 87/06941中公開的包含GLP-I (7-37)和其功能性變體的這類肽片段;如WO 90/11296中公開的包含GLP-l(7-36)和其功能 性衍生物的這類肽片段;如WO 91/11457中公開的活性GLP-I肽7-34、7-35、7-36和7-37的這 類類似物;如EP 0699686-A2中公開的GLP-I的這類N-末端截短的片段；以及如EP 0708179-A2中公開的包含N-末端咪唑基團的這類GLP-I類似物和衍生物。GLP-I肽的非限制性實例是 GLP-I (7-37)、K34R-GLP-1 (7-37)和毒蜥外泌肽-4(1-39) (SEQ ID NO: 7)。在一個實施方案 中，毒蜥外泌肽-4(1_39)(SEQ ID N0:7)是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。 [0061]如本文所用的"膜尚血糖素妝"意在表不來自如膜尚血糖素原家族的、對膜尚血糖 素受體具有親和性的多肽。胰高血糖素肽的非限制性實例是胰高血糖素（1-29) (SEQ ID N0:8)及其類似物。在一個實施方案中，胰高血糖素（1-29)(SEQ ID N0:8)是 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT。
[0062] 如本文所用的"胰島素前體"意在表示包含胰島素的A鏈和B鏈并任選地包含介于 其間的C肽的多肽。應理解，該胰島素可以是人胰島素或其功能性變體，如類似物或截短的 形式。胰島素前體的一個非限制性實例是例如A(l-21)-AAK-B(l-29)-人胰島素 （SEQID Ν0:9)〇Α(1-21)-ΑΑΚ-Β(1-29) -人胰島素 （SEQ ID N0:9)是 GIVEQCCTSICSLYQLENYCNAAKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK。
[0063] 如本文所用的術語"毒蜥外泌肽（exendin)"意在表示毒蜥外泌肽及其功能性變 體，包括其類似物和片段，例如，毒蜥外泌肽-3和-4。毒蜥外泌肽及其類似物和片段在例如 WO 99/43708中描述，其內容通過引用以其全文并入本文。
[0064] 優選地，腸激酶可切割融合多肽中的腸激酶位點是在化學穩定性方面也穩健的位 點。由于腸激酶位點中的氨基酸殘基的某些亞序列更加傾向于不太化學穩定，因此通常優 選地，腸激酶位點的序列(X6-X5-X4-GDR)是在預期的條件下化學穩定的序列。
[0065]在根據式(I)的腸激酶可切割融合多肽中，在一個實施方案中，X4選自E、Q、L、D、G、 A、S、F、H、Y、W或T。在另一個實施方案中，X4選自E、Q、L、D、G或A13X4可以是E 13X4可以是Q或Lt3X4 可以是D13X4可以是D、G或A。在另一個實施方案中，X5是D或E。在又一個實施方案中，X 5是D。在 一個實施方案中，X5不是S或I。在一個實施方案中，X5-X4選自DD、DE、DL、DQ、EE和EQ。在另一 個實施方案中，Xs-X 4是DE或DD。Χ5-Χ4可以是DL、DQ或DG。Χ5-Χ4可以是DA、DS或EE。Χ 5-Χ4可以是 EQ、EL或ED13X5-X4可以是EG、EA或ES。X5-X4可以是QE、HE、NE或ME。X 6的存在和身份是寬松的。 在一個實施方案中，X6是I、G、L、T、R或S。在另一個實施方案中，X 6不存在。X6可以是I、G、L、T、 1?、3、]\1、!1小、？、￥、￥、1(4、￥或〇。父6可以是1、6、1^、1'、1?、3、]\1、!^、？、￥或1父 6可以是1或6。
[0066]在一個實施方案中，Z2不存在。在另一個實施方案中，Z2是具有0-10個氨基酸殘基 或具有約8個到約200個氨基酸殘基的多肽。當Z2是促進腸激酶可切割融合多肽在宿主細胞 中的表達的多肽時，或者當2 2用來保護所表達的多肽不在N-末端被蛋白水解加工時，常使 用較小的Z2多肽。在一個實施方案中，Z 2選自EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、 EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK和 EELDARLEALK。Z2 可包含序列 EEK、EEAEK或 HK。Z2 可包含序列 EEAHK、E (EA) 2HK或 E (EA) 3HK。Z2 可包含序列EEGHK、EHPK或EEGEPK。Z2可包含序列EEAHELK、EEAHEVK或EEAHEMK。Z 2可包含序列 EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK 或 EELDARLEALK。在另一個實施方案中，Z2 包含選自 DV、 DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE 和 DVKPGQPMY 的序列。在另一個實 施方案中，Z2包含選自 DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、 DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE 和 DVEPGQPLY 的序列。Z2 可包含序列DVKPGQPLY、 DVKPGQELY 或 DVKPGEPLY。Z2 可包含序列DVKPEQPLY、DVKPGQPEY 或 DVKEGQPLY。Z2 可包含序列 DVKPGQPLA、DVKPGQPLE或DVEPGQPLY。在另一個實施方案中，Z2包含選自 QPMYKR、GQPMYK、 PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW 和EAEAWH的序列。Z2可包含序列QPMYKR、GQPMYK或PGQPMY。Z2可包含序列KPGQPM、LKPGQP或 QLKPGQ。Z2 可包含序列LQLKPG、WLQLKP 或HffLQLK。Z2 可包含序列 WHffLQL、AWHffLQ 或 EAWHWL。Z2 可包含序列AEAWHff或EAEAWH13Z:^以是促進所述腸激酶可切割融合多肽在宿主細胞中的表 達的多肽。在一個實施方案中，Z 2是具有2到50個氨基酸殘基，如3到40個、4到30個或5到20 個氨基酸殘基的多肽。辦可以是具有2到8個氨基酸殘基的多肽。2 2可以是具有至少8個氨基 酸殘基的多肽。辦可包含40個或更少的氨基酸殘基，或者由其組成。Z2可以是具有約10個到 約25個氨基酸殘基的多肽。
[0067]在一個實施方案中，本發明涉及包含氨基酸序列Z2-X8-X7的肽，其中Z 2如本文所定 義;X8不存在或者是包含腸激酶切割位點的肽;并且X7是包含至少1個氨基酸的多肽。在一個 實施方案中，Z 2提高Z2-X8-X7的重組表達、有利于可溶性表達產物Z 2-X8-X7的保持、促進Z2-X8-X7或其部分向細胞外介質的排出、保護X7或其部分免于被蛋白酶或肽酶非故意地加工， 和/或針對Z 2-X8-X7的捕獲(例如，通過經由色譜法如HPLC的純化)提供改善的性質。X 8可以 不存在。X8可包含至少2個氨基酸，如至少3個氨基酸、至少4個氨基酸或至少5個氨基酸。X 8可 包含1-30個氨基酸，如3-20個氨基酸、4-15個氨基酸或至少5-10個氨基酸。X7可包含至少5 個氨基酸、至少10個氨基酸或至少15個氨基酸。X7可包含1-100個氨基酸，如10-70個氨基酸 或20-50個氨基酸。X7可以是如本文定義的Z1。例如,Z1可以是GLP-I肽或其功能性變體。在一 個實施方案中，Z2-X8-X7是腸激酶可切割融合多肽。X8可包含氨基酸序列X 6-X5-X4-G-D-R，其 中Χ6、Χ 5和X4如本文所定義。Xs可包含氨基酸序列DDGDR或DE⑶R。
[0068]在根據式（I)的腸激酶可切割融合多肽中，Z1常常是有待通過重組表達制備的目 標多肽。在一個實施方案中，Z1是藥學活性的多肽，或藥學活性多肽的前體。在一個實施方 案中，具有約15個到約100個氨基酸殘基的多肽。在又一個實施方案中，具有約15個 到約50個氨基酸殘基的多肽。在另一個實施方案中，2 1是61^-1肽或其功能性片段，如K34R-GLP-I (7-37)或K34R-GLP-1 (9-37)。在一個實施方案中，K34R-GLP-1 (7-37)是 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。在一個實施方案中，K34R-GLP-1 (9-37)是 EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。Zl可包含N-末端序列HAEGT或EGTFT。Zl可包含N-末端序 列HAEGTFTSDVSSYLE、EGTFTSDVSSYLE或其包含至少5個氨基酸的片段。在另一個實施方案 中，Z 1是胰高血糖素肽或其功能性變體。2:可以是胰高血糖素肽或其包含N-末端序列HGTFT 的功能性變體C=Z1可以是選自下組的GLP-l(7-37)類似物：（(^7-8,31!1，340,371〇 ;((1687-8,34R，37K，38E);(des7-8,34R，37K);(des7-8,9G，34R，37K);(des7-8,23R，34R，37K); (31H，34Q，37K) ;(9Q，34R，37K);(30E，34R，37K);(34R，37K，38G) ;(34R，36G，37K)jP(34R， 37K，38E) Ji可以是選自下組的GLP-I (7-37)類似物：（i)des7-8，18K，34R;(ii)des7-8， 18K,34Q；(iii)des7-8,18K,22E,34R；(iv)des7-8,18K,22E,34Q；(v)des7-8,12L,18K,34Q； (vi)des7,18K,22E,34Q；(vii)18K,34R；(iix)18K,34Q；(ix)18K,22E,34R；(x)18K,22E, 34Q；(xi)18K,26R,31K,34R；(xii)18K,26H,31K,34R；(xiii)18K,26H,27K,34Q；(xiv)18K, 22K,26R,34Q；(xv)18K,25V,26R,31K,34R；(xvi)18K,22E,26R,31K,34R；(xvii)18K,22E, 26H,27K,34R；(iixx)18K,22E,26H,27K,34Q；(ixx)18K,22E,26H,27K,31H,34R；(xx)18K, 22E,26H,27K,31H,34Q；(xxi)18K,22E,25V,26R,31K,34R；(xxii)18K,22E,25V,26R,31K, 34Q； (xxiii)18K,22E,25V,26R,31K,34G；(xxiv)18K,22E,25V,26R,27K,34R；(xxv)18K, 22E,25V,26R,27K,34Q；(xxvi)18K,22E,25V,26R,27K,31H,34R；(xxvii)18K,22E,25V,26R, 27K,31H,34Q；(iixxx)18K,22E,23E,25V,26R,27K,34R；(ixxx)18K,22E,23E,25V,26R,27K, 34Q；(xxx)18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxi)18K,22E,25V,26R,31H,des35-37； (xxxi i)18K,22E,25V,26R,30K,34G,des35-37；(xxxi i i)18K,22E,25V,26R,30K,3IH,34G, des35-37；(xxxiv)18K,22E,25V,26R,27L,30K,34G,des35-37)；(xxxv)18K,22E,26R,31K, 34G,des35-37；(xxxvi)18K,22E,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xxxvii)des7,18K,22E, 26R,34R,37K；(iixxxx)des7,18K,22E,26R,27K,31H,34G,des35-37；(ixxxx)7Imp,18K, 22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxx)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37； (xxxxi)8S,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxii)des7-8,18K,26V,27K,34R； (xxxxiii)des7-8,18K,26H,30K,34R,des36-37；(xxxxiv)des7-8,18K,25V,26R,31K,34R； (xxxxv)des7-8,18K,22E,34R,des36-37；(xxxxvi)des7-8,18K,22E,26R,34R,37K； (xxxxvii)des7-8,18K,22E,26R,31K,34R；(iixxxxx)des7-8,18K,22E,26R,31K,34G, des35_37;(ixxxxx)des7_8,I8K，22E,26R，30K，34R，des36_37;(xxxxx)des7_8,18K，22E, 26R,30K,34R；(xxxxxi)des7-8,18K,22E,26R,27K,31H,34R,des36-37；(xxxxxii)des7-8, 18K,22E,25V,26R,31K,des34-37；(xxxxxiii)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,34R； (xxxxxiv)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxxv)des7-8,18K,22E,25V, 26R,30E,31K,34G,des35-37；(xxxxxvi)des7-8,18K,22E,25V,26R,27L,des35-37； (xxxxxvii)des7-8,18K,22E,25V,26R,27K,34Q；(iixxxxxx)des7-8,18K,22E,25V,26R, 27K,31H,34G,des35-37；(ixxxxxx)des7-8,18K,22E,25V,26R,27H,31K,34G,des35-37； (xxxxxx)des7-8,18K,22E,25V,26H,31K,34G,des35-37；(xxxxxxi)des7-8,18K,22E,23R, 25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxxxii)18K,22E,25V,26R,27L,30K,34G,des35-37； (xxxxxxiii)des7，18K，22E，26R,27K，34Q;(xxxxxxiv)34H;和（xxxxxxv)des7_8，18K,34H。 Zi可以是選自下組的GLP-I(7-37)類似物：（i)22E，26R，27K，34R，37K;(ii)22E，26R，27K， 30E,34R,36K,38E,39G；(iii)22E,26R,27K,34R,36K,des37；(iv)22E,25V,26R,27K,34R, 37K；(v)des7-8,20K,22E,26R,27K,30E,34G,des35-37；(vi)26R,27K,30E,34R,36K,38E； (vii)des7-8,22K,25V,26R,27K,31H,34R；(iix)des7-8,22K,25V,26R,27K,34R,des35-37； (ix)des7-8,22K,25V,26R,27K,34R,des36-37；(x)26H,27K,30E,34R,36K,38E；(xi)22K, 25V,26R,27K,30E,34Q；(xii)25V,26R,27K,30E,34R,36K,38Q；(xiii)25V,26R,27K,30E, 34Q,36K,38E；(xiv)22K,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xv)des7-8,25V,26R,27K,31H,34Q, 37K；(xvi)25V,26R,27K,31H,34Q,37K；(xvii)22E,23E,25V,26R,27K,31H,34Q,37K；(iixx) des7-8,12K,22E,26R,27K,31H,34Q；(ixx)des7-8,22K,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xx) 22E,26H,27K,30E,34R,36K,38E；(xxi)22E,24K,26R,27K,3IH,34G,des35-37；(xxi i)25V, 26R,27K,34Q,36K；(xxiii)22E,24K,25V,26R,27K,31H,34R；(xxiv)22E,24K,25V,26R,27K, 34G,des35-37；(xxv)22E,24K,25V,26R,27K,34R；(xxvi)des7-8,22E,24K,25V,26R,27K, 31H, 34Q;和（xxvii)des7-8,22E ,26R,27K, 30E,34R, 36K, SSEjgGc3Zi 可以是 GLP-I (7-37)或 是選自（iii)(22E)和（iv)22E，30E的GLP-l(9-37)類似物。Z1可以是選自下組的GLP-l(9-37)類似物 ：i)(22E，26R，27K，34R，38G，39G，40G，41S，42K);ii)(22E，26R，31K，34R，38G， 39G，40G，41S，42K);iii)(22E，26R，34R，38K，39G，40G，41S，42K);iv(22E，23K，26R，34R， 38G，39G，40G，41S，42K);v)(22E，26R，34R，36K，38G，39G，40G，41S，42K);和vi)(18K，22E， 26R，34R，38G，39G，40G，41S，42K)。在又一個實施方案中，Z 1是胰島素前體或其功能性變體， 如Α(1-21)-ΑΑΚ-Β(1-29)_人胰島素。在另一個實施方案中，Z 1選自毒蜥外泌肽、PYY、瘦素及 其功能性變體。
[0069]在一個實施方案中，ZjPZ2衍生自不同的來源，即來自不同的物種和/或合成來源。 [0070] 融合蛋白的制備
[0071]腸激酶可切割融合多肽可以借助于重組核酸技術來產生。通常，編碼Ζ2、Χ6-Χ 5_Χ4-GDI^PZ1的核酸序列以合成方式獲得(對于較小的多肽），或者作為經修飾以編碼所需多肽 的克隆DNA而獲得。編碼辦的核酸序列通常可以通過克隆野生型DNA而獲得，但當辦是有限大 小的多肽時，其也可以合成獲得。編碼腸激酶位點一為僅5-6個氨基酸殘基的多肽的X 6-X5-X4-GDR-的核酸序列將通常合成獲得。其甚至可以由編碼辦的相同核酸序列來編碼，特別是 在2 2是相當小的多肽的情況下。例如為了構建一個至少編碼式（I)的腸激酶可切割融合多 肽的核酸序列，編碼z2、x 6-x5-x4-gdr和不同部分的核酸序列符合讀碼框架地融合。這樣 的融合多肽可以是腸激酶可切割融合多肽，其具有或不具有N-或C-末端延伸(作為ZjPZ 2, 或在ZjPZ2之內）如標簽等，例如，His-標簽或增溶結構域(如DsbC、RL9、MBP、NusASTrx)<4^ 后將該修飾的核酸序列插入到表達載體中，該表達載體轉而轉化或轉染到表達宿主細胞 中。
[0072]編碼腸激酶可切割融合多肽的核酸構建體可以適當地為基因組、cDNA或合成來源 的。經常地，它將包含具有不同來源的核酸序列。通過公知的技術經由遺傳密碼的修飾來完 成氨基酸序列的改變。
[0073]在進一步的方面，本發明提供了編碼本發明的腸激酶可切割融合多肽的DNA序列。 [0074]編碼腸激酶可切割融合多肽的DNA序列通常插入到可以是任何載體的重組載體 中，該載體可以方便地經歷重組DNA程序，并且載體的選擇通常將取決于其將被引入到的宿 主細胞。因此，該載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外的實體存在、其復制與染色體 復制無關的載體，例如，質粒。或者，該載體可以是這樣的載體，當其引入到宿主細胞中時， 其被整合到宿主細胞基因組中并與其所整合至的染色體一起復制。
[0075]該載體優選地是表達載體，其中編碼腸激酶可切割融合多肽的DNA序列與DNA轉錄 所需的其他區段可操作地連接。術語"可操作地連接"表示這些區段排列成使得它們一致地 發揮作用以用于它們的預期目的，例如，轉錄在啟動子中開始并通過編碼該多肽的DNA序列 繼續進行，直至其在終止子內終止。
[0076] 因此，用于表達腸激酶可切割融合多肽的表達載體將包含能夠啟動和引導經克隆 的基因或cDNA的轉錄的啟動子。該啟動子可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細胞中顯 示出轉錄活性并且可以衍生自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。
[0077] 此外，用于表達腸激酶可切割融合多肽的表達載體還將包含終止子序列，即被宿 主細胞識別而終止轉錄的序列。該終止子序列與編碼該多肽的核酸序列的3'末端可操作地 連接。在所選擇的宿主細胞中有功能的任何終止子均可在本發明中使用。
[0078] 腸激酶可切割融合多肽的表達可以以在宿主細胞的胞質溶膠中的細胞內表達為 目標，或者被引導至用于細胞外表達至生長培養基中的分泌途徑。或者，腸激酶可切割融合 多肽的表達可以針對于細胞器。
[0079]細胞內表達是默認的途徑并且需要具有DNA序列的表達載體，該DNA序列包含啟動 子及隨后的編碼腸激酶可切割融合多肽的DNA序列以及隨后的終止子。
[0080] 為了將腸激酶可切割融合多肽引導至宿主細胞的分泌途徑中，需要分泌信號序列 (也被稱為信號肽或前序列）作為腸激酶可切割融合多肽的N-末端延伸。將編碼信號肽的 DNA序列與編碼腸激酶可切割融合多肽的DNA序列的5'端在正確的讀框中連接。該信號肽可 以為通常與該蛋白質相關的信號肽或者可以來自編碼另一種分泌蛋白的基因。
[0081] 分別用于連接編碼腸激酶可切割融合多肽的DNA序列、啟動子、終止子和/或分泌 信號序列，以及用于將它們插入到含有復制所需信息的適當載體中的程序是本領域技術人 員公知的（參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor,New York,1989)〇
[0082] 引入了編碼腸激酶可切割融合多肽的DNA序列的宿主細胞可以是能夠在細胞內或 細胞外表達該腸激酶可切割融合多肽的任何細胞。如果需要翻譯后修飾，合適的宿主細胞 包括酵母、真菌、昆蟲和高等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0083] 細菌表達:對于在大腸桿菌中表達，用于引導核酸構建體在細菌宿主細胞中轉錄 的適當啟動子的實例是從Iac操縱子、trp操縱子及其雜合體trc和tac獲得的啟動子，它們 全部來自大腸桿菌（DeBoer等人，1983 ,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。用于在大腸桿菌中使用的其他更強的啟動子是來自T7和T5噬菌 體的噬菌體啟動子。T7啟動子需要在大腸桿菌宿主中存在T7聚合酶（Studier和Moffatt， J.Mol.Biol._，113,（1986))。所有這些啟動子均通過用IPTG、乳糖或色氨酸誘導來調控， 以在細菌生長期中的控制關鍵點引發轉錄。大腸桿菌也具有用于連續表達的強啟動子，例 如，D:alb:0.ge_等人，1987,Biotechnology互，161-164中的用于表達hGH的合成啟動子。
[0084]對于在芽孢桿菌中表達，來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖鹿糖酶 基因（sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)a-淀粉酶基因（amyL)、嗜熱脂肪芽 孢桿菌（Bacil Ius stearothermophi Ius)麥芽糖淀粉酶基因（amyM)、解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyIoliquefaciens)a-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因 (penp)、枯草芽孢桿菌 xy IA和xy IB基因的啟動子均是合適的實例。其他啟動子在 Scientific American，1980，242 : 74-94 中的"Useful proteins from recombinant bacteria";和5&111131'〇〇1<:等人，1989(同上）中描述。
[0085]對于大腸桿菌，細菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區是從基因 DegP、0mpA、0mpF、 OmpT、PhoA和腸毒素 STII獲得的信號肽，它們全部來自大腸桿菌。對于芽孢桿菌，信號肽區 從芽孢桿菌NCIB 11837麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿 菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和 枯草芽抱桿菌prsA獲得。其他信號肽由Simonen和PaIva，1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。對于大腸桿菌和芽孢桿菌兩者，信號肽可以根據算法SignalP(Nielsen等 人，1997 ,Protein Eng. 10，1-6 ,Emanuelsen等人，2007 ,Nature Protocols 名，953_971)中 概括的規則從頭創建。使信號序列適應于給定的情況并檢查SignalP得分。
[0086]用于轉錄的強終止子的實例是如在Thiofusion表達系統中的天冬氨酸酶aspA、在 PET載體中的T7基因10終止子(Stud i er等人）以及核糖體RNA基因 rrnA、rrnD的終止子。
[0087] 在一個實施方案中，本發明涉及包含表達載體的宿主細胞，該表達載體包含編碼 根據式（I)的腸激酶可切割融合多肽的DNA序列。在一個實施方案中，包含該表達載體的宿 主細胞是酵母、細菌或真菌。在另一個實施方案中，該宿主細胞選自酵母屬的種 (Saccharomyces spp ·)、畢赤酵母屬的種（Pichia spp ·)、漢遜酵母屬的種（Hansenula spp .)和克魯維酵母屬的種（Kluyveromyces spp .)。該宿主細胞可以是釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。在進一步的實施方案中，該宿主細胞選自大腸桿菌和芽孢 桿菌屬的種(Bacillus spp·)。
[0088] 優選的表達宿主的實例是通過用噬菌體溶源化而攜帶T7聚合酶的大腸桿菌 K12W3110,具有B蹤跡(a trace of Β)的大腸桿菌K12MC1061和大腸桿菌B BL21DE3。在用表 達質粒轉化時，這些宿主是可用抗生素選擇的。對于抗生素自由選擇，優選的宿主是大腸桿 菌B BL21DE3 3xK0,其中例如2個D，L-丙氨酸消旋酶基因 alr、dadX缺失，以及對大腸桿菌B 具有特異性并且通常與致病行為有關的Π 組莢膜基因簇(kpsM-kpsF)缺失。II組基因簇的 缺失使大腸桿菌B BL21DE3 3xK0進入與大腸桿菌K12相同的安全性類別。選擇基于不需要 由插入到表達質粒中的air基因所提供的D-丙氨酸，而不是AmpR基因。
[0089] 一旦腸激酶可切割融合多肽已在宿主生物體中表達，其可通過常規技術回收并純 化至需要的純度。這樣的常規回收和純化技術的非限制性實例是離心、溶解、過濾、沉淀、離 子交換色譜法、固定化金屬親和色譜法(IMC)、RP-HPLC、凝膠過濾和冷凍干燥。
[0090] HRV14 3C的重組表達和純化的實例可見于例如Cordingley等人，J.Virol. 1989， 63，pp5037-5045，Birch等人，Protein Expr Purif · ,1995,6，pp609-618,以及W02008/ 043847。
[0091 ] 來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的XaaProDAP的微生物表達和純化的實例 可見于例如 Chich 等人，Anal.Biochem, 1995,224，pp 245-249 和 Xin 等人，Protein Expr.Purif.2002,24,pp53〇-538 〇
[0092] 在進一步的方面，本發明提供了用于切割腸激酶可切割融合多肽的方法，所述方 法包括以下步驟：
[0093] a)表達包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0094] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0095] 其中
[0096] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0097] X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM;
[0098] X5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0099] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸；
[0100] 辦是任選的多肽或氨基酸殘基；
[0101] 其中所述目標多肽是式(I)中的Z1;
[0102] b)使所述腸激酶可切割融合多肽與腸激酶在有利于切割的條件下接觸。
[0103] 在進一步的方面，本發明提供了用于制備目標多肽的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0104] a)表達根據本發明的腸激酶可切割融合多肽，其中所述目標多肽是式(I)中的Z1,
[0105] b)使所述腸激酶可切割融合多肽與腸激酶在有利于切割的條件下接觸；以及
[0106] c)分離所述目標多肽。
[0107] 對此方法有用的腸激酶是任何哺乳動物腸激酶，如牛腸激酶、人腸激酶或其功能 性變體。腸激酶也可以被稱為腸肽酶。由于腸激酶的輕鏈包含催化結構域，并且在不存在重 鏈的情況下具有活性，因此其他有用的腸激酶是牛輕鏈或其功能性變體。這樣的牛輕鏈變 體在例如W02013/092855A1中公開，例如（C112A)變體和(<：112六丄1341(，11351〇變體。
[0108] 根據上述方法的腸激酶切割可以在許多切割條件下進行。在一個實施方案中，實 施該方法，其中在步驟b)中的接觸在包含有機溶劑的水溶液中進行。例如，該有機溶劑可選 自甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、丙酮、甘油或其混合物。在一個實施方案中，所述有機溶劑是 濃度為約10%w/w到約25%w/w的乙醇。在一個實施方案中，所述有機溶劑是濃度為約10% w/w到約25 % w/w的甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、丙酮、甘油或其混合物。
[0109] 本發明的實施方案
[0110]通過以下非限制性實施方案進一步描述了本發明：
[0111] 1.包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0112] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0113] 其中
[0114] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0115] X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM;
[0116] X5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0117] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸；
[0118] Z2是任選的多肽或氨基酸殘基。
[0119] 2.包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0120] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0121] 其中
[0122] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0123] X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM;
[0124] X5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0125] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸；
[0126] 辦是任選的多肽或氨基酸殘基;并且
[0127] 其中^叾:包含功能性多肽，如藥學活性的多肽或酶，ii)所述腸激酶可切割融合多 肽由式（I)組成，并且Z2包含40個或更少的氨基酸殘基，或者iii)Z 2包含增溶結構域。
[0128] 3.根據實施方案1或2所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5是G、P、A、V、L、M、C、F、 Y、W、H、K、R、Q、N、E、D和T。
[0129] 4.根據實施方案1-3中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是E、Q、L、 D、G、A、S、F、H、Y、^T〇
[0130] 5.根據實施方案1-4中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是E、Q、L、 D、G或 A0
[0131] 6.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是E。
[0132] 7.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是Q。
[0133] 8.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是L。
[0134] 9.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是D。
[0135] 10.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是G。
[0136] 11.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X4是A。
[0137] 12.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5是D或E。
[0138] 13.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5是D。
[0139] 14.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5是E。
[0140] 15.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是DE。
[0141] 16.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是DD。
[0142 ] 17.根據實施方案1 -5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DL。
[0143] 18.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是DQ。
[0144] 19.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是DG。
[0145] 20.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是DA。
[0146] 21.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是DS。
[0147] 22.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是EE。
[0148] 23.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是EQ。
[0149] 24.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是EL。
[0150] 25.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是ED。
[0151] 26.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是EG。
[0152] 27.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是EA。
[0153] 28.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是ES。
[0154] 29.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是QE。
[0155] 30.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是HE。
[0156] 31.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是NE。
[0157] 32.根據實施方案1-5中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X5-X 4是ME。
[0158] 33.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、 l、t、r、s、m、h、f、p、v、w、k、e、ySq。
[0159] 34.根據實施方案33所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R、S、M、H、 F、P、V或W〇
[0160] 35.根據實施方案34所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R或S。
[0161] 36.根據實施方案35所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X6是I。
[0162] 37.根據實施方案35所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X6是G。
[0163] 38.根據實施方案1-32中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中X6不存在。
[0164] 39.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是促進 所述腸激酶可切割融合多肽在宿主細胞中的表達的多肽。
[0165] 40.根據實施方案39所述的腸激酶可切割融合多肽，其中所述宿主細胞是大腸桿 菌。
[0166] 41.根據實施方案39所述的腸激酶可切割融合多肽，其中所述宿主細胞是酵母。
[0167] 42.根據實施方案39-40所述的腸激酶可切割融合多肽，其中所述宿主細胞是釀酒 酵母。
[0168] 43.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中辦不存在。
[0169] 44.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有0 到10個氨基酸殘基的多肽。
[0170] 45.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有2 到8個氨基酸殘基的多肽。
[0171] 46.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有 至少8個氨基酸殘基的多肽。
[0172] 47.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2包含40 個或更少的氨基酸殘基。
[0173] 48.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是氨基 酸殘基或者Z 2是包含2-40個氨基酸殘基的多肽。
[0174] 49.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有 約8個至約200個氨基酸殘基的多肽。
[0175] 50.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有 約10個至約25個氨基酸殘基的多肽。
[0176] 51.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2選自 EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、 EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHE^WKEEGNTTPK 和 EELDARLEALK。
[0177] 52.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2選自DV、 DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE和DVKPGQPMY。
[0178] 53.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2選自 DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、 DVKPGQPLE和DVEPGQPLY。
[0179] 54.根據實施方案1-42中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2包含選 自 QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、 AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHff 和 EAEAWH 的序列。
[0180] 55.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z2包含增 溶結構域。
[0181] 56.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1包含功 能性多肽，如藥學活性的多肽或酶。
[0182] 57.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1是藥學 活性的多肽、酶或其前體。
[0183] 58.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中21是61^_1 肽或其功能性變體。
[0184] 59.根據實施方案58所述的腸激酶可切割融合多肽，其中2!是1(341?-61^-1 (7-37) 或K34R-GLP-l(9-37)。
[0185] 60.根據實施方案1-57中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1是胰高 血糖素肽或其功能性變體。
[0186] 61.根據實施方案1-57中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1是胰島 素前體或其功能性變體。
[0187] 62.根據實施方案1-57中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1選自毒 蜥外泌肽、PYY、瘦素及其功能性變體。
[0188] 63.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1是具有 約15個至約100個氨基酸殘基的多肽。
[0189] 64.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中Z1是具有 約15個至約50個氨基酸殘基的多肽。
[0190] 65.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其為非天然存 在的多肽。
[0191] 66.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中ZjPZ2衍生 自不同的來源，即不同的物種或合成的。
[0192] 67.根據前述實施方案中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中所述腸激 酶可切割融合多肽由式（I)組成。
[0193] 68.編碼根據實施方案1-67中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽的DNA序列。
[0194] 69.包含與上游啟動子和下游終止子可操作地連接的根據實施方案68所述的DNA 序列的表達載體。
[0195] 70.包含根據實施方案69所述的表達載體的宿主細胞。
[0196] 71.根據實施方案70所述的宿主細胞，其為酵母、細菌或真菌。
[0197] 72.根據實施方案70-71中的任一項所述的宿主細胞，其選自酵母屬的種、畢赤酵 母屬的種、漢遜酵母屬的種和克魯維酵母屬的種。
[0198] 73.根據實施方案70-72中的任一項所述的宿主細胞，其為釀酒酵母。
[0199] 74.根據實施方案70-71中的任一項所述的宿主細胞，其選自大腸桿菌和芽孢桿菌 屬的種。
[0200] 75.用于切割腸激酶可切割融合多肽的方法，所述方法包括以下步驟：
[0201] a)表達包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽：
[0202] Z2-Xe-X5-X4-G-D-R-Zi(I)SEQ ID N0:1
[0203] 其中
[0204] Z1是包含至少2個氨基酸殘基的多肽；
[0205] X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM;
[0206] X5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸；
[0207] X6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸；
[0208]辦是任選的多肽或氨基酸殘基；
[0209]其中所述目標多肽是式(I)中的Z1;
[0210] b)使所述腸激酶可切割融合多肽與腸激酶在有利于切割的條件下接觸。
[0211] 76.用于制備目標多肽的方法，所述方法包括以下步驟：
[0212] a)表達根據實施方案1-67中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽，其中所述目 標多肽是式(I)中的Z1,
[0213] b)使所述腸激酶可切割融合多肽與腸激酶在有利于切割的條件下接觸；以及 [0214] c)分離所述目標多肽。
[0215] 77.根據實施方案75或76所述的方法，其中步驟b)中使用的所述腸激酶選自牛腸 激酶、牛腸激酶輕鏈或其功能性變體。
[0216] 78.根據實施方案75-78中的任一項所述的方法，其中所述腸激酶是牛腸激酶輕鏈 變體(C112A)、（C112A，L134K，I135K)或其功能性變體。
[0217] 79.根據實施方案75-77中的任一項所述的方法，其中在步驟b)中的所述接觸在包 含有機溶劑的水溶液中進行。
[0218] 80.根據實施方案78所述的方法，其中所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、正丙 醇、丙酮、甘油或其混合物。
[0219] 81.根據實施方案79所述的方法，其中所述有機溶劑是濃度為約10 % w/w到約25 % w/w的乙醇。
[0220] 82.根據實施方案76-80中的任一項所述的方案，其中所述步驟c)是任選的。
[0221] 83.-種包含氨基酸序列Z2-X8-X7的肽，其中Z2如前述實施方案中的任一項所定 義;X8不存在或者是包含腸激酶切割位點的肽;并且X7是包含至少1個氨基酸的多肽。
[0222] 84.根據實施方案83所述的肽，其中X8不存在。
[0223] 85.根據實施方案83所述的肽，其中X8包含至少2個氨基酸，如至少3個氨基酸、至 少4個氨基酸或至少5個氨基酸。
[0224] 86.根據實施方案83所述的肽，其中X8包含1-30個氨基酸，如3-20個氨基酸、4-15 個氨基酸或至少5-10個氨基酸。
[0225] 87.根據實施方案83-86中的任一項所述的肽，其中X7包含至少5個氨基酸、至少10 個氨基酸或至少15個氨基酸。
[0226] 88.根據實施方案83-86中的任一項所述的肽，其中X7包含1-100個氨基酸，如10-70個氨基酸或20-50個氨基酸。
[0227] 89.根據實施方案83-86中的任一項所述的肽，其中X7是如前述實施方案中的任一 項所定義的Zi。
[0228] 90.根據實施方案89所述的肽，其中Z^GLP-I肽或其功能性變體。
[0229] 91.根據實施方案83-90中的任一項所述的肽，其中Z2-X8-X 7是腸激酶可切割融合 多肽。
[0230] 92.根據實施方案83-91中的任一項所述的肽，其中X8包含氨基酸序列X 6-X5-X4-G- D-R，其中X6、X5和X4如前述實施方案中的任一項所定義。
[0231] 93 .根據實施方案83-91中的任一項所述的肽，其中X8包含氨基酸序列DDGDR或 DE⑶ R。
[0232] 本文中引用的所有參考文獻，包括出版物、專利申請和專利，均在此通過引用以其 全文并入本文，并且其程度如同單獨地且特別地指出每篇參考文獻均通過引用而并入且在 本文中以其全文進行闡述(在法律允許的最大程度上）。本文中使用的所有標題和小標題僅 僅是為了方便起見，而不應解釋為以任何方式限制本發明。除非另有聲明，否則任何和全部 實例或本文提供的示例性措辭(例如，"如"）的使用僅旨在更好地闡明本發明，并不造成對 本發明的范圍的限制。說明書中的任何措辭均不應被解釋為表示任何未請求保護的要素對 本發明的實踐是必不可少的。本文中專利文件的引用和并入僅僅是為了方便而做出的，并 沒有反映關于這些專利文件的有效性、可專利性和/或可執行性的任何觀點。如由適用的法 律所允許的，本發明包括所附權利要求書中列舉的主題的所有修改和等同物。 實施例
[0233] 縮寫列表
[0234] EK:腸激酶或腸激酶輕鏈
[0235] D4K：DDDDK
[0236] NMP: N-甲基-2-吡咯烷酮
[0237] Abz :2_氨基苯甲酰基
[0238] Dnp :2,4_ 二硝基苯基
[0239] 材料與方法 [0240] 通用制備方法
[0241]方法:SPPS_I(固相肽合成）
[0242]通過固相肽合成法合成了含有C-末端Lys(Abz)酰胺焚光體和N-末端Lys(Dnp)猝 滅劑的分子內猝滅焚光肽底物。
[0243]這些肽底物具有以下的一般結構：
[0244] Z2*-X6-X5-X4-GDR-Zi*式（II)
[0245] 其中
[0246] X6-X5-X4具有與式(I)中相同的含義(均為氨基酸，但X 6是任選的），
[0247] Z2*是Lys(Dnp)，并且
[0248] Z1IZ1-Lys (Abz)酰胺，其中Z1如式(I)中所定義。
[0249] 采用相對于樹脂負載例如虹111^111丨(16-〇161]^1：1^1(0.51111]1〇1/^)2.5倍過量的？1]1〇(3-氨基酸（300mM，在具有300mM Oxyma Pure? 的匪P中），在來自 Intavis Bioanalytical Instruments AG(KoeIn ,Germany)的Multipep RSi合成儀上以3μηιο1 的規模平行地進行 SPPS_I。采用在NMP中的20%哌啶進行Fmoc-去保護。采用在NMP中的1: 1: 1:1氨基酸/Oxyma Pure?/DIC/可力丁(collidine)進行偶聯。所有氨基酸均是"雙重或三重偶聯的"，這意味 著在第一次偶聯后(6〇min)，將樹脂排出并添加更多的試劑(氨基酸、Oxyma Pure?、DIC 和可力丁），并使反應物再次反應(60min)。
[0250] 方法:EK純化
[0251] 純化的腸激酶的制備根據W02013/092855A1中描述的程序進行。
[0252] 通用檢測和表征方法
[0253] 方法:EK-動力學_1
[0254] 通過測量根據式（II)的分子內猝滅熒光肽Lys(Dnp)-肽-Lys(Abz)酰胺的初始水 解速率來進行EK-動力學j。在通常在1到50μΜ范圍內的底物濃度下測量肽的背景熒光后， 通過添加純化的腸激酶測量初始水解速率，該腸激酶的濃度為使得能夠讀取初始水解速 率，即在30min內少于5 %水解的濃度。通常可以使用1到IOnM的酶濃度。在至多一小時的水 解后，添加額外的酶以使得能夠在完全水解下測量熒光水平。通常使用Perkin Elmer Enspire熒光讀板儀，采用320nm激發和420nm發射，在25°C下在50mM MOPS緩沖液，ImM EDTA，pH 7.5中測量水解速率。
[0255] 方法:EK-動力學_2
[0256] 通過計算具有N-末端延伸的全長GLP-I的初始水解速率來進行EK-動力學_2。底物 濃度在150-300μΜ的范圍內。通過添加一定量的腸激酶使得最終濃度為9.5nM來開始水解反 應。在6 · 2min、18 · 7min、43 · 7min、86 · 3min、151 · 3min和243 · 8min后取樣，并通過 1+9稀釋到 5%乙酸中來猝滅。在Waters iClass UPLC上使用合適的方法來分離并在分析反相柱上通 過積分峰面積單獨地定量剩余的底物和形成的產物。用原始數據擬合以下形式的等式：
[0257] 其中t是時間，CSQ是初始底物濃度，Ce是酶濃度，cpt是在時間t時的廣物濃度，cst是 在時間t時的底物濃度，UPK m是水解參數，并且Ki是產物抑制常數。所有反應均采用Ο.ΙμΜ 的常數Ki。對于所有的肽均基于對初始底物濃度lmg/ml確定的參數來計算初始水解速率。 所有的反應均在50mMTris緩沖液，lmMEDTA，pH8.5中進行。
[0258] 腸激酶
[0259] 用于本文中實施例的腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A， L134K,I135K)〇
[0260] 實施例1-39
[0261 ]包含GLP-l(7-37)的N末端的腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0262] 對于全部的實施例1-39,底物均是ZZ-X6-X5-XrGDR-Z1'其中Z^HAEGT(SEQ ID NO: 10 )，即來自GLP-I (7-37)的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表1中所指定。底物通過 SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實施例1-39的腸 激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0263] 將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0264] 例如，對于實施例1，底物具有以下結構Lys (Dnp)-AEGDR-HAEGT-Lys (Abz)酰胺 (SEQ ID NO: 11)，該結構是包含腸激酶切割位點AE⑶R(SEQ ID NO: 12)的腸激酶可切割融 合多肽的模型底物。
[0265] 表1.具有肽HAEGT作為叾:的底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。

[0268] 實施例40-59
[0269] 包含GLP-I (9-37)變體的N末端的腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0270] 對于全部的實施例40-59,底物均是Ζ2*-Χ6-Χ5-Χ4_⑶R-ΖΛ其中Z^EGTFT(SEQ ID NO:13)，即來自GLP-I (9-37)的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表2中所指定。底物通過 SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實施例40-59的 腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0271]將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0272]表2.具有肽EGTFT作為底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。
[0275] 實施例60-79
[0276] 包含毒蜥外泌肽-4的N末端的腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0277] 對于全部的實施例60-79,底物均是Z2*-X6-X5-X 4-⑶R-ΖΛ其中Z^HGEGT(SEQ ID NO: 14)，即來自毒蜥外泌肽-4的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表3中所指定。底物通過 SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實施例60-79的 腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0278]將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0279]表3.具有肽HGEGT作為底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。
[0282]實施例80-83
[0283] 包含胰高血糖素類似物的N末端的腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0284] 對于全部的實施例80-83,底物均是Ζ2*-Χ6-Χ 5-Χ4_⑶R-ΖΛ其中Z^HGTFT(SEQ ID NO: 15)，即來自胰高血糖素類似物的N-末端五肽，并且X5-X4如表4中所指定。底物通過SPPS-I法合成，通過EK純化來純化，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實 施例80-83的腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0285] 將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0286] 表4.具有肽HGTFT作為底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。
[0288] 實施例84-87
[0289] 包含胰高血糖素類似物的N末端的腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0290] 對于全部的實施例84-87,底物均是Ζ2*-Χ6-Χ 5-Χ4_⑶R-ΖΛ其中Z^QGTFT(SEQ ID NO: 16)，即來自胰高血糖素類似物的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表5中所指定。底物 通過SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實施例84-87的腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0291] 將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0292] 表5.具有肽QGTFT作為底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。
[0294] 實施例88-91
[0295] 包含人胰高血糖素的N末端的腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0296] 對于全部的實施例88-91，底物均是Z2*-X6-X5-X4-⑶R-ΖΛ其中Z^HSQGT(SEQ ID NO: 17)，即來自人胰高血糖素的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表6中所指定。底物通過 SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實施例88-91的 腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0297] 將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0298] 表6.具有肽HSQGT作為底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。
[0300] 實施例92-110
[0301] 包含GLP-l(7-37)的N末端和不同X6的參考腸激酶可切割融合多肽的相對切割速 率。
[0302]對于全部的實施例92-110,底物均是ZZ-X6-X5-X4-GDR-Z 1'其中Z^HAEGT(SEQ ID NO: 10 )，即來自GLP-I (7-37)的N-末端五肽，X5-X4是DE，并且X6如表7中所指定。底物通過 SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1法確定。用于實施例92-110的 腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0303] 將腸激酶切割的初始速率對具有X6-X5-X4=ADE的底物(100% )進行歸一化。
[0304] 表7.具有作為肽HAEGT、如表中指定的X6和X5-X4 = DE的底物的相對腸激酶切 割速率(X6-X5-X4=ADE為 100% )。

[0307] 實施例111-117
[0308] 包含GLP-I (7-37)的N末端的參考腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0309] 對于全部的實施例 111-117，底物均是 ZZ-X6-X5-XfGDR-Z1' 其中 Z^HAEGT( SEQ ID NO: 10 )，即來自GLP-I (7-37)的N-末端五肽，X6不存在，并且對應于X5-XfGDR的腸激酶位 點如表8中所指定。底物通過SPPS-I法合成，并且其初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_1 法確定。
[0310]如表8中指定的EK位點指明了對應于X5-X4-GDR序列的五肽。因此，在實施例111中， 底物具有結構Lys (Dnp)-頂GDRHAEGT-Lys (Abz)酰胺(SEQ ID NO: 18 )，而在實施例112中，底 物具有結構Lys(Dnp)-INDDRHAEGT-Lys(Abz)酰胺（SEQ ID NO: 19)。因此，在實施例112中， 腸激酶位點不包含GDR序列而包含DDR序列。用于實施例111-117的腸激酶是如W02013/ 092855A1 中描述的牛輕鏈變體(C112A，L134K，I135K)。
[0311]將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0312]表8.具有肽HAEGT作為Z1的參考底物的相對腸激酶切割速率(D4K位點為100% )。
[0314]實施例118-137
[0315] 包含整個[Arg34]GLP-l(9-37)序列和N-末端延伸的腸激酶可切割融合多肽以及 包含DDDDK的參考腸激酶可切割融合多肽的相對切割速率。
[0316] 對于所有的實施例118-135，底物均是ZZ-X6-X5-X 4-GDR-Z1'其中ZdPZ1如表9中所 定義，即，Z2是腸激酶可切割融合多肽的N-末端延伸，而2:是[Arg34]GLP-l (9-37)，X6不存 在，并且對應于Xs-X4-GDR的腸激酶位點如表9中所指定;除了在參考實施例中，并且如表9中 所指定的（例如實施例118)之外，底物是ZZ-X 6-DDDDK-Z1'底物通過SPPS-I法合成，并且其 初始腸激酶切割速率通過EK-動力學_2法確定。
[0317] 如表9中指定的EK位點指明了對應于X5-X4-GDR序列的五肽。因此，在實施例119中， 底物具有結構 DVKPGQPLYDEGDR-[Arg34]GLP-l (9-37)。
[0318] 用于實施例118-135的腸激酶是如W02013/092855A1中描述的牛輕鏈變體(C112A， L134K,I135K)〇
[0319]將腸激酶切割的初始速率對具有D4K位點（替代式(I I)中的X5-X4-GDR)的底物進行 歸一化。
[0320]表9.包含整個[Arg34]GLP-l(9-37)序列作為Z1W及如下定義的N-末端延伸作為Z 2 的參考底物的相對腸激酶切割速率(在該組中最慢的D4K位點為100% )。
[0322]雖然本發明的某些特征已在本文中說明和描述，但本領域普通技術人員現在將會 想到許多修改、替換、變化和等同物。因此，應當理解，所附的權利要求書旨在涵蓋落在本發 明的真正精神內的所有這些修改和變化。
【主權項】
1. 用于制備目標多肽的方法，所述方法包括以下步驟： a) 表達包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽： Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID N0:1 其中 Zi是包含至少2個氨基酸殘基的多肽； X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM; χ5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸； Χ6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸； Ζ2是任選的多肽或氨基酸殘基； 其中所述目標多肽是式(I)中的Zi; b) 使所述腸激酶可切割融合多肽與腸激酶在有利于切割的條件下接觸；以及 c) 任選地分離所述目標多肽。2. 根據權利要求1所述的方法，其中Χ4是E、Q、L、D、G或A。3. 根據權利要求1 _2中的任一項所述的方法，其中X5-X4選自DD、DE、DL、DQ、EE和EQ。4. 根據權利要求1-2中的任一項所述的方法，其中Χ5-Χ4是DD或DE。5. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中Ζ2是促進所述腸激酶可切割融合多 肽在宿主細胞中的表達的多肽。6. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中Ζ2是具有2至50個氨基酸殘基的多 肽，Ζ2是氨基酸殘基，或者辦不存在。7. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中2:包含功能性多肽，如藥學活性的多 肽或酶。8. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中21是61^-1肽或其功能性變體，如Zi 是K34R-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(9-37)。9. 根據權利要求1-7中的任一項所述的方法，其中Zi是胰高血糖素肽或其功能性變體。10. 根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中在步驟b)中的所述接觸在包含有 機溶劑的水溶液中進行。11. 包含下式的多肽的腸激酶可切割融合多肽： Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID ΝΟ:1 其中 Zi是包含至少2個氨基酸殘基的多肽； X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、TSM; χ5選自除了 S和I之外的遺傳編碼的氨基酸； Χ6不存在或選自遺傳編碼的氨基酸； Ζ2是任選的多肽或氨基酸殘基;并且 其中。叾:包含功能性多肽，如藥學活性的多肽或酶，或者ii)所述腸激酶可切割融合多 肽由式（I)組成，并且Z2包含40個或更少的氨基酸殘基，如Z2不存在，Z2是氨基酸殘基，或者 z2是包含2-40個氨基酸殘基的多肽。12. 根據權利要求11所述的腸激酶可切割融合多肽，其中所述腸激酶可切割融合多肽 如權利要求2-9中的任一項所定義。13. 編碼根據權利要求11-12中的任一項所述的腸激酶可切割融合多肽的DNA序列。14. 包含與上游啟動子和下游終止子可操作地連接的根據權利要求13所述的DNA序列 的表達載體。15. 包含根據權利要求14所述的表達載體的宿主細胞，其中所述宿主細胞可以選自酵 母屬的種、畢赤酵母屬的種、漢遜酵母屬的種和克魯維酵母屬的種。
【文檔編號】C07K4/00GK105829350SQ201480069335
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月17日
【發明人】K.奧勒森, J.布蘭德特
【申請人】諾和諾德股份有限公司