專利名稱：去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫用生物材料，具體涉及用于皮膚創面修復、 組織工程皮膚構建以及組織填充的一種異種真皮網狀層支架，及其制備方 法。
背景技術：
臨床上多種傷、病可導致皮膚缺損，特別是大面積燒傷患 者，早期切痂、用敷料及時封閉創面是目前修復皮膚最有效、最關鍵的措 施。采用患者的自體皮膚移植有引起供皮區的瘢痕增生和色素沉著的可能; 創面愈合后產生不同程度的疤痕增生，嚴重燒傷患者還存在自體皮源嚴重 不足。因此，尋找一種理想的皮膚創面修復材料成為創傷修復的主要課題。 1913年，Loewe證實真皮組織能夠增強移植皮膚的韌性、抑制肉芽組織生 長和瘢痕形成，降低創面攣縮程度，隨后人們就開始關注真皮組織在皮膚 移植中的作用。1985年Heck等報道應用異體真皮作為自體表皮的移植載 體，復合移植到燒傷創面，取得較好治療效果。Wairwright (1995)用人 體皮膚制成脫細胞真皮，隨后又有研究者將自體表皮細胞膜片復合脫細胞 真皮基質移植修復全層皮膚缺損獲得成功。美國LifeCell公司將這-成果 商品化，用新鮮的人尸體制成脫細胞真皮支架，命名為AlloDerm，通過美 國FDA的批準進入了醫用生物材料市場。國內陳壁等人最早開始對異體真 皮脫細胞處理和臨床應用研究，目前己有類似Alloderm的異體真皮脫細胞 真皮在國內上市。由于人異體皮的來源極其有限，遠不能滿足臨床需要， 開發異種脫細胞真皮支架成為解決這一問題的有效途徑。
現有研究證明，皮膚基底膜的主要成分與皮膚免疫密切相關，很多皮 膚疾病(如系統性紅斑狼瘡、大皰性皮膚病等)與基底膜帶的自身抗體有 聯系；異種脫細胞真皮的基底膜和乳頭層免疫反應最強(Srivastava 2001, DeSagun 2001);還有人觀察到，豬真皮不同層次的抗原性也不盡相同，位 于較深部位的真皮網狀層其抗原性明顯低于較淺部位的真皮乳頭層，表明 豬的真皮網狀層具有免疫惰性。因而，基底膜和真皮乳頭層是含基底膜異 種無細胞真皮的免疫原性的主要來源。
異體脫細胞真皮制作的方法已逐漸趨于成熟，主要有平衡鹽溶液法、酶消化一去污劑法和高滲鹽一去污劑法三種，但是它們都保留了基底膜，
且主要來自真皮乳頭層，如Alloderm。這些方法很難將免疫原性物質清除 干凈，移植后仍存在不同程度免疫排斥反應。在現有技術中，有一件2003 年12月10日公開的CN1460527A，它使用戊二醛作化學交聯劑來降低真皮 的免疫原性，但因此卻改變了真皮纖維的天然結構，使真皮較致密，影響 了植入存活率；另有一件于2002年4月10日公開的CN1343523A，它利用 了激光打孔的方式增加支架的孔隙和滲透性，然而這種方式所得孔隙并非 纖維天然結構，而且激光對孔周的膠原纖維有熱變性作用。現有技術的各 種異種脫細胞真皮仍存在著下列缺點(1)細胞洗脫除不徹底，免疫原性 較強，局部長期存在炎癥免疫反應；(2)脫細胞真皮較致密，對營養的滲 透性差，血管化速度慢，導致移植后存活率低。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術異種脫細胞真皮存在的上述缺陷，擬 提供一種去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架及其制備方法，使之材料 來源豐富；細胞洗脫更徹底，免疫原性更低；保留天然纖維結構，孔隙大， 乂無化學及激光損傷，營養滲透性強、血管化速度快、存活率高。
采取以下技術方案來實現本發明的目的。
一種去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架，其特征在于
1) 它取自哺乳動物真皮網狀層，具有真皮網狀層孔隙較大的天然三維 結構；
2) 真皮支架去除基底膜，無細胞；
3) 真皮支架的厚度為0.2 0.8ram。
上述去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架，所說的哺乳動物真皮網狀 層是豚鼠、竹鼠、大鼠、海貍鼠、兔、羊、豬和牛中任選一種動物的真皮 網狀層。
上述去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架的一種制備方法，其特征 是按以下步驟操作
1) 無菌條件下取得哺乳動物的皮膚；
2) 先去除皮膚的皮下組織，再去除皮膚的表皮、基底膜和真皮乳頭層；
3) 用蒸餾水浸泡0. 2小時 3小時；4) 用重量濃度為0. 18% 0. 3%的胰蛋白酶和0. 01% 0. 035%的 EDTA Na2消化液，在37。C下持續振蕩2小時 8小時，再用磷酸鹽緩沖 液至少洗三遍；
5) 將上步消化好的真皮支架置于重量濃度0.3% 0.8%的Triton X-100溶液中浸泡并持續振蕩24小時 48小時，用磷酸鹽緩沖液至少洗三 遍.；
6) 將獲取的去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架浸泡于75%重量乙 醇中保存，或凍干密封后鈷60照射消毒保存，或凍干后用環氧乙烷消毒保 存。
保存的去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架，用生理鹽水浸泡后至少 清洗三遍再使用。
按照本發明方法所獲得的去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架，由于 取自真皮網狀層，不含有基底膜，具有孔隙較大的天然三維結構，結構疏 松，孔隙率大(見圖2)。這極為有利于營養滲透及血管長入，能在短時間 內與創面基底建立有效的血液循環，加快創面修復。
在制備方法上，完全地去除了真皮中主要免疫原性物質的來源(基底 膜和真皮乳頭層)，降低了免疫原性；又在常規的酶消化和去垢劑處理的基 礎上改善了操作工藝，更增加了聯合蒸餾水浸泡的低滲處理，使洗脫細胞 更加徹底，完全達到無細胞的效果，更進一步降低了免疫原性(見圖2、圖 3、圖4)。
在本發明的去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架表面上接種人角質形 成細胞，培養1天，可見多個細胞粘附于真皮支架表面，細胞隆起，尚未 完全鋪展(見圖5);培養5天，細胞在支架表面完全鋪平且逐漸融合成片 (見圖6);培養15天后，將其移植到裸鼠背部，術后20天已形成比較完 整的皮膚結構，支架內散在分布有成纖維細胞和新生血管(見圖7)。
以豬皮膚為材料來源制備的去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架，將 其與自體微粒皮復合移植到大鼠背部的皮膚缺損創面，可支持微粒皮(擴 張比2: l)存活及上皮化，2周創面愈合；6周時的創面收縮率僅35% 40%， 而無支架對照組高達70% 75%; 13周未見創面起水皰或潰爛發生，且未
5見瘢痕增生，大體觀察與周圍皮膚相似，觸摸與周圍皮膚無明顯界限(見 圖8)。
本發明去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架，皮源豐富，制備工藝 簡單，制作周期短，價格低廉。
圖1為脫細胞處理前的真皮網狀層(H. E. 100X )
注未見基底膜，成纖維細胞呈散在分布，纖維結構較致密；可見毛 囊和較多的皮脂腺
圖2為采用本發明方法制備的無基底膜無細胞異種真皮網狀層支架
(H.E. 100 X)
注本發明方法可完全去除真皮網狀層內的細胞成分，且膠原束完整、 孔隙增大。
圖3為缺低滲法制備的無基底膜無細胞異種真皮網狀層支架
(H.E, 100 X)
注缺低滲處理的方法所制備的真皮網狀層支架可見一定細胞碎屑殘 留
圖4為接種細胞前的本發明無基底膜無細胞異種真皮網狀層支架
(掃描電鏡.300X)
注表面呈不規則的凹凸不平結構，膠原纖維呈現條索狀或"方便面 樣"結構，有許多大小不等的網孔，特別是未見細胞的殘留成分。
圖5為本發明無基底膜無細胞異種真皮網狀層支架接種人角質形成細
胞后l天(掃描電鏡.3000X)
注多個細胞粘附于真皮支架表面，細胞隆起，尚未完全鋪展。
圖6為本發明無基底膜無細胞異種真皮網狀層支架接種人角質形成細
胞后5天(掃描電鏡.1500X)
注培養五天后，細胞在支架表面完全完全鋪平且逐漸融合成片。
圖7為裸鼠移植人角質形成細胞復合無基底膜無細胞異種真皮網狀層
術后20天(H.E. 40X)
注創面組織切片顯示實已形成比較完整的皮膚結構，支架內散在分布有成纖維 細胞和新生血管。圖8為豬無基底膜無細胞真皮網狀層支架復合移植大鼠自體微粒皮創 面術后6周
具體實施例方式
下面用具體制備實例進一步說明本發明去基底膜無細胞的異種真皮網 狀層支架制備方法。 實施例1:
以大鼠作為材料來源，具體制備過程步驟如下
1、 無菌切取大鼠背部皮膚和皮下組織；
2、 置于0. 1%新潔爾滅溶液浸泡20分鐘；
3、 用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗三遍；
4、 用無菌取皮機去除皮下組織，獲得厚度0.5,的全層皮膚；
5、 再用無菌取皮機將表皮、基底膜和真皮乳頭層一并去除，獲得厚度
0.3腿的真皮網狀層(見圖1);
6、 用低滲的蒸餾水浸泡所獲的真皮網狀層并持續振蕩130次/分鐘1 小時；
7、 用重量濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA'Na2的消化液， 在37"下持續振蕩3小時；
8、 更換消化液為磷酸鹽緩沖液，持續振蕩10分鐘，反復洗三遍；
9、 將消化好的真皮支架置于重量濃度0.5% TritonX-lOO溶液中浸 泡，并持續振蕩130次/分鐘48小時，同步驟8洗三遍；
10、 再將真皮支架于凍干機內在一69'C下凍干；
11、 密封后鈷60照射消毒保存。
實施例2:
以兔作為材料來源，具體制備過程步驟如下
1、 無菌切取兔背部皮膚和皮下組織；
2、 置于0. 1 %新潔爾滅溶液浸泡20分鐘；
3、 用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗三遍；
4、 用無菌取皮機去除皮下組織，獲得厚度0. 4cm的全層皮膚；
75、 再用無菌取皮機將表皮、基底膜和真皮乳頭層一并去除，獲得厚度
0.2mm的真皮網狀層；
6、 用低滲的蒸餾水浸泡所獲的真皮網狀層并持續振蕩130次/分鐘1. 5 小時；
7、 用重量濃度為0. 2 。/o的胰蛋白酶和0. 015%的EDTA Na2的消化液在 37'C下，持續振蕩3小時；
8、 更換消化液為磷酸鹽緩沖液，持續振蕩10分鐘，反復洗三遍；
9、 將消化好的真皮支架置于重量濃度0.3% TritonX-lOO溶液中浸 泡，并持續振蕩130次/分鐘24小時。同步驟8洗三遍；
10、 再將真皮支架于凍干機內在—69。C下凍干；
11、 密封后鈷60照射消毒保存。
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權利要求
1、一種去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架，其特征在于1)它取自哺乳動物真皮網狀層，具有真皮網狀層孔隙較大的天然三維結構；2)真皮支架去除基底膜，無細胞；3)真皮支架的厚度為0.2～0.8mm。
2、 按照權利要求l所述去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架，其特 征在于所說的哺乳動物真皮網狀層是豚鼠、竹鼠、大鼠、海貍鼠、兔、羊、 豬和牛中任選一種動物的真皮網狀層。
3、 如權利要求1去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架的一種制備方法，其特征是按以下步驟操作1) 無菌條件下取得哺乳動物的皮膚；2) 先去除皮膚的皮下組織，再去除皮膚的表皮、基底膜和真皮乳頭層；3) 用蒸餾水浸泡0. 2小時 3小時；4) 用重量濃度為0. 18% 0. 3%的胰蛋白酶和0. 01% 0.035%的 EDTA Na2消化液，在37。C下持續振蕩2小時 8小時，再用磷酸鹽緩沖 液至少洗三遍；5) 將上步消化好的真皮支架置于重量濃度為0. 3% 0. 8%的Triton X-100溶液中浸泡并持續振蕩24小時 48小時，用磷酸鹽緩沖液至少洗三 遍；6) 將獲取的去基底膜無細胞異種真皮網狀層支架浸泡于75%重量乙 醇中保存，或凍干密封后鈷60照射消毒保存，或凍干后用環氧乙烷消毒保 存。
全文摘要
一種去基底膜無細胞的異種真皮網狀層支架，它取自哺乳動物真皮網狀層，具有真皮網狀層孔隙較大的天然三維結構；真皮支架去除基底膜，無細胞；真皮支架的厚度為0.2～0.8mm。它是無菌取皮，再去除皮下組織、表皮、基底膜和真皮乳頭層；再依次用蒸餾水浸泡、用胰蛋白酶和EDTA·Na2消化液消化，并持續振蕩后用磷酸鹽緩沖液洗；再置于Triton X-100溶液中浸泡并持續振蕩，再用磷酸鹽緩沖液洗而得以制備。它完全地去除了真皮中主要免疫原性物質的來源，降低了免疫原性；將它用于皮膚創面修復、組織工程皮膚構建以及組織填充，營養滲透性強、血管化速度快、存活率高，效果好；它的皮源豐富，制備工藝簡單，制作周期短，價格低廉。
文檔編號A61L27/36GK101496915SQ20091010306
公開日2009年8月5日 申請日期2009年1月16日 優先權日2009年1月16日
發明者斌 何, 彭代智, 朱崇濤, 楊燕妮, 鄭必祥 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院