專利名稱：：長效生長激素釋放因子衍生物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生長激素釋放因子(GRF)衍生物。特別的，本發明涉及具有體內半衰期延長的GRF肽衍生物，用于促進人和動物體內源性產生或釋放生長激素。
背景技術：
：生長激素(GH)也叫做促生長素，是一種由腺垂體的促生長激素細胞合成和分泌的大約190個氨基酸的蛋白激素。它是控制生長和代謝的一種主要參與者。它也是用于人和動物的重要藥用產物。GH的產生受多種因素的調節，其中包括應激、營養、睡眠以及GH自身。但是其主要控制者是兩種下丘腦激素-生長激素釋放因子(GRF或GHRH)，其是剌激GH合成和釋放的44個氨基酸的序列，和；-抑生長素(SS)，響應于GRF其抑制GH釋放。GRF(l-44)的生物活性已表明存在于肽的N末端區。采用GRF(1_29)在體內和體外也證實有全部內在的活性和效力。此外，持續給藥GRF誘導從腦下垂體與正常生理條件下相同的陣發式分泌模式。近來，由Merck和其它的制藥公司開發的合成肽，例如生長激素釋放肽(GHRP)和模擬肽(p印tidomimetics)已經闡述了其能夠剌激內源性GH的釋放。由Hoffma皿-LaRoche在80年代中期開發的另一種三取代的GR巳—29類似物，[脫_氨基-Tyr1，D-Ala2，Ala"]-GRFh29，是一種具有長效活性的GRF超級激動劑。已知GH促分泌素(GHS)通過一種孤兒G-蛋白偶聯受體(GHS-R)剌激GH從垂體釋放。近來，用于GHS-R的另一個內源性配體被鑒定為饑餓激素(ghrelin)，它是一種辛酰基化肽(在Ser3位有n-辛酰基的28-殘基肽)。重組GH(rGH)最早在1985年生產，現在市場上醫用和獸醫用的rGH有售。但是還沒有長效安全的rGH。此外，已經報道在人體使用rGH導致的一些副作用，即左心室質量指數、血清脂蛋白的升高以及免疫參數的細微改變。最后，已知頻繁濃注rGH導致受體的漸進性下調，因此隨著時間的流逝使其療效下降。除了這些應用上的缺點，外源性GH是物種特異性的，因此限制了其在不同物種即人和動物中促進生長和其它有利影響的優點。已經發現少量的GRF導致主要垂體釋放GH到處理的動物的血液中。因此，在這些顯示生長激素的情形中GRF具有很好的治療價值。例如，它可用于治療垂體侏儒癥，由于GH產生異常導致的糖尿病，以及老化過程的延遲。受益于GRF內源性產生和釋放的很多其他疾病或癥狀在下面列舉。此外，GRF也可用于農業方面。農業應用的實例包括促進豬、牛或類似的家畜的產肉以盡早進入市場。已知GRF也可剌激奶牛的產奶量。到目前為止，與肽-相關的GH促分泌素的使用相關的一個主要缺點是缺少一種合適的技術，其能夠在延長的時間內，例如幾天到幾星期，提供基本上線性和持續地遞送GH。5GRF(l-29)，就像很多其它具有治療特性的肽一樣，在體內高度不穩定，這就大大限制了其作為藥用產物在促進人和動物釋放GH中的應用。因為GRFl-29的半衰期一般情況下不超過10-13分鐘，因此一天中必須若干次大劑量注射或輸注才能維持可檢測的GH的釋放。在過去的這些年中已開展了大量的研究以試圖開發出長效的GRF類似物。雖然合成了若干具有延長作用時效的新的類似物，但是沒有一種滿足GH釋放藥品所需要的標準。另外，沒有一種制型已知在人或動物體內在一段確定的時間內釋放這些不穩定的肽。US5，846，936公開的GRF類似物據說具有增強的效力，提高的酶穩定性和改進的半哀期穩定性。這個專利提及這些類似物可以用多種類似血清白蛋白的佐劑進行給藥。專利中呈現的唯一半衰期穩定結果是體外的。實際上沒有體內肽穩定性的數據。US4，963，529描述了一種GRF組合物，以液體或固體的形式，其包含GRF以及人血清白蛋白或甘氨酸。組合物中也可以包含緩沖液，據說可以穩定GRF。W09724445公開了將生長激素(hGH)和重組白蛋白分子融合。這樣的融合蛋白據說較未融合的生長激素提高了循環半衰期。任選可切割的連接物可以被插入到白蛋白和生長激素的分子之間以促進hGH和受體的連接。W00069900公開了一種生產肽酶穩定性肽的方法。一系列GRF肽被列舉作為可能的候選物，可通過本申請公開的方法加以穩定，但是沒有一種在說明書中具體舉例。因此迫切需要開發一種能夠促進GH在受試體、人或動物體內釋放的長效化合物。這樣的促進應該優選持續一段延長的時間而沒有rGH不受歡迎的副作用。發明概述根據本發明，提供了一種生長激素釋放因子(GRF)衍生物，其與相應的未修飾的(或天然的)GRF肽序列比較有延長的體內半衰期。更具體而言，該衍生物包括一種GRF肽或其類似物，它含有與其偶聯的反應實體并能夠與一種血液組分上的有效官能團，在體內或體外形成穩定共價鍵。反應實體可被偶聯到肽的N-末端、C-末端或沿著肽鏈的任何其他有效的位置。優選的血液組分含有類似免疫球蛋白的蛋白，包括IgG和IgM、血清白蛋白、鐵蛋白、類固醇結合蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素結合蛋白、a-2-巨球蛋白等，更優選血清白蛋白和IgG，以及血清白蛋白是最優選的。優選的反應實體能夠在體內或體外(或離體)與血液組分上存在的氨基、羥基或巰基反應形成共價鍵。在最優選的實施方案中，蛋白的官能團為巰基，反應實體為Michael受體，如丙稀醛衍生物、a，P_不飽和酮、a，|3-不飽和酰胺、a，|3-不飽和酯、a，|3-不飽和硫酯等，馬來酰亞胺或含馬來酰亞胺的基團如Y-馬來酰亞胺-丁酰酰胺(GMBA)或馬來酰亞胺丙酸(MPA)是最優選的。本發明的另一方面提供了一種藥物組合物，其包含該GRF衍生物和可藥用載體。該組合物用于促進內源性GH在受試者體內的產生和釋放。該組合物也可用于生產藥用或獸藥用組合物以治療或預防由于GH產生異常導致的疾病或癥狀。下面列舉了這樣的疾病或癥狀。在本發明的另一個實施方案中，提供了一種促進GH在受試體、動物或人中內源性產生或釋放的方法。該方法包括對受試體單獨或與藥用載體結合給藥有效劑量的該GRF衍生物。在本發明的另一個實施方案中，提供了一種治療或預防由于GH產生異常導致的疾病或癥狀，該方法包括對受試體單獨或與藥用載體結合給藥有效劑量的該GRF衍生物。本發明的另一方面提供了一種包含共價連接到血液組分的該GRF衍生物的偶聯物。本發明的另一方面提供了一種體內延長GRF肽在受試體內半衰期的方法，該方法包括將該GRF衍生物共價連接到一種血液組分。共價連接可以發生在體內也可發生在體外。優選的GRF是如GRF(1-44)和其類似物的肽，例如GHRP_6、海沙瑞林(Hexarelin)、饑餓激素、GHRP-1、IGF-l、IGF_2、B_HT920、GRF(1_29)和如下列舉的它們的類似物和片段，條件是任何這樣的類似物或片段具有與GRF基本相似的活性。根據本發明，所有在此引用作為參考的US4，411，890;US4，517，181;US4，518，586;US4，528，190;US4，529，595;US4，563，352;US4，585，756;US4，595，676;US4，605，643;US4,610,976;US4，626，523;US4，628，043;US4，689，318;US4，734，399;US4，784，987;US4，843，064;US5，756，458;EP0188214;WO89/07110;WO89/07111和WO93/04081提供了適宜作為衍生物的其它的GRF類似物。如果連接基團存在于反應實體和GRF肽之間，則將其無限制地優選定義為直鏈或支鏈(Vw烷基；部分氟化或過氟化的直鏈或支鏈的C卜w烷基；(Vw烷基或氟烷基，其中一個或多個碳原子被0或S取代以形成醚或硫醚，例如-Z-CH2CH2-、-Z-CF2CH2-、-Z-CH2CF2-或_Z_CF2-CF廠其中Z為O或S;o-、m-或p-二取代苯基，其中取代基相同或不同，并且為CH2、0、S、NH、NR，其中R為H、Q—1Q烷基或1Q酰基；或二取代雜環，如呋喃、噻吩、妣喃、唑或噻唑。圖1顯示用市售GRF(1-29)和實施例1和2的不同濃度的化合物培養4小時后，大鼠前原代細胞的GH分泌。圖2顯示用市售D-Ala-GRF(l-29)和實施例3和4的不同濃度的化合物培養4小時后，大鼠前原代細胞的GH分泌。圖3顯示用實施例5和6的不同濃度的化合物培養4小時后，大鼠前原代細胞的GH分泌。圖4顯示用實施例7和8的不同濃度的化合物培養4小時后，大鼠前原代細胞的GH分泌。圖5顯示單次皮下濃注(bolusinjection)實施例1和2的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。圖6顯示單次皮下濃注實施例3和4的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。圖7顯示單次皮下濃注實施例5和6的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。圖8顯示單次皮下濃注后正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌(曲線下的總面積，AUC)。圖9顯示雄性Sprague-Dawley大鼠中實施例5和6的化合物的藥代動力學圖形。本發明的詳細描述體內生物偶聯是在體內以一定方式將分子，如本發明GRF衍生物，共價結合到靶血液組分，優選蛋白的過程，所述容許基本方式上保留原始未修飾的GRF的生物活性，同時通過給予GRF衍生物靶血液組分的生理參數而提供生物活性持續時間的延長。為了本發明的目的，術語"類似物"是指氨基酸序列所含有的肽與天然GRF序列不同但是有相似或同等的活性。這樣的類似物優選與相同數目氨基酸殘基的GRF或GRF片段的氨基酸序列有至少60%的相似性，更優選至少有80%的相似性，以及最優選至少有95%的相似性。在一個較優選的實施方案中，本發明GRF衍生物含有一個GRF肽，該GRF肽直接或通過一個連接基團偶聯一個反應實體而被修飾，反應實體能與一種血液組分，優選血液蛋白形成共價鍵。反應實體必須在水環境中穩定存在，其優選的實施方案包括羧基、磷酰基、亞胺酸基(imidate)或酰基形成酯或混合酐。共價鍵通常在反應實體與血液組分上的氨基、羥基或巰基之間形成。氨基優選與如羧基、磷酰基或酰基的反應實體形成共價鍵；羥基優選與活化酯的反應實體形成共價鍵；以及巰基優選與如酯或混合酐的反應實體形成共價鍵。優選的血液組分包括移動的血液組分，例如血清白蛋白、免疫球蛋白或二者的混合物，優選的反應實體含有類似馬來酰亞胺基團的酐，在最優選的實施方案中，血液組分為血清白蛋白。血液組分優選是移動的，這就意味著血液組分不必在任何長時間內有固定位置，一般不超過5分鐘，更經常不超過1分鐘。這些血液組分不與膜相關并且在血液中以最低至少0.1i！g/ml的濃度下存在較長時間。優選的移動血液組分包括血清白蛋白、轉鐵蛋白、鐵蛋白和類似IgG和IgM的免疫球蛋白。移動血液組分的半衰期至少約12小時。因為本發明GRF衍生物包括一種肽，在衍生物的合成過程中可能需要保護基團。這些保護基團在肽合成領域是常規的，并且一般被描述為能夠防止肽衍生物與其自身反應的化學部分。多種保護基團都是市售的，其實例可在US5，493，007找到，此處引作參考。適合作為保護基的典型例子包括乙酰基、9-芴甲氧羰基(FMOC)、叔-丁基氧羰基(BOC)、芐氧羰基(CBZ)等。表1提供了氨基酸的三字母和單字母縮寫。表1天然氨基酸及其縮寫名稱三字母縮寫單字母縮寫丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發明GRF衍生物與血液組分連接后形成了一種肽酶穩定的長效化合物。預期在添加反應實體之前可以添加一個或多個其它的氨基酸，以促進肽的偶聯。這樣的添加可以在C-末端、N-末端或二者之間進行。這樣獲得的肽可被施用給受試者、動物或人，從而在體內發生與血液組分的偶聯，或者，首先在體外與受試者、動物或人的血液組分相連，然后將得到的偶聯物或如下描述的長效肽酶穩定的肽衍生物施用給受試者。GRF序列上取代或添加的任何氨基酸可以是D-氨基酸或L_氨基酸或其組合。一般優選L-氨基酸。下列原始GRF肽序列(1-29)或(1-44)中的取代或突變代表本發明優選的實施方案，以獨立或組合方式第2位的D-丙氨酸；第8位的谷氨酰胺；第11位的D_精氨酸；第12位的(N-Me)Lys;第15位的丙氨酸和第27位的亮氨酸。本發明也包括GRF片段，雖然其基本上同源于自然存在的GRF肽，但是可能在氨基端和/或羧基端缺少GRF天然肽自然存在的一個或多個其它的氨基酸。因此本發明涉及的GRF的多肽片段可能缺少GRF天然序列中正常存在的一個或多個其它的氨基酸，條件是，這樣的多肽具有優選至少大體上與GRF等同的生長激素釋放活性。本發明也包括與上述類似物或片段具有明顯或細小區別的變體，其具有不重要的氨基酸取代(因此具有區別于天然序列的氨基酸序列)，條件是，這樣的變體具有與GRF基本相似的生長激素釋放活性。明顯或細小取代的例子包括一個堿性殘基被另一個堿性殘基取代(即Arg取代Lys)，疏水殘基被另一個疏水殘基取代(即Leu取代lie)，或者芳族殘基被另一個芳族殘基取代(即Phe取代Tyr)等。此外，其它微小的變體包括類似物，其中獲得了導致原始序列主要結構類似的保守取代。這樣保守取代的例子包括但不限于谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然；谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；絲氨酸取代蘇氨酸，反之亦然；賴氨酸取代精氨酸，反之亦然；或者任何異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸之間的彼此取代。肽酶穩定的GRF衍生物在體內有肽酶存在的情況下，較相應的非穩定的GRF類似物更穩定。通過將在血清中或血液中天然GRF類似物的半衰期與在血清中或血液中含有活性基團的相應衍生物的半衰期進行比較來確定肽酶穩定性。半衰期的測定方法是在給藥衍生物和非修飾的肽后取血清或全血樣品，以及確定每種化合物的活性。更具體而言，本發明涉及GRF和相關肽的修飾以提高其生物利用率，在基本上不改變其顯著治療特性的情況下通過選擇性偶聯到一種血液組分而延長其體內半衰期和分布。在一個較優選的實施方案中，根據本發明適于衍生的GRF肽序列為下列序列A「A2-Asp-A4-Ile-Phe-A廠A8-A9-Tyr-An-Ai2-Ai3-Leu-Ai5-Gln-Leu-Ai8-Ala-A2o-A^_A22_Leu_A24_A25_A26_A27_A28_A29_A30其中，為Tyr、N_Ac_Tyr、His、3-MeHis、脫氨基His、脫氨基Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys_3_MeHis;A2為Val、Leu、Ile、Ala、D-Ala、N-甲基-D-Ala、(N_甲基)-Ala、Gly、Nle或Nval;A4為Ala或Gly;As為Met或Ile;A7為Asn、Ser或Thr;A8為Asn、Gln、Lys或Ser;A9為Ala或Ser;Au為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys;A12為Lys、(N_Me)Lys或D-Lys;A13為Val或Leu;A15為Ala、Leu或Gly;A18為Ser或Thr;A20為Arg、D_Arg、Lys或D_Lys;A21為Lys、(N_Me)Lys或Asn;A22為Tyr或Leu;A24為Gln或His;A25為Ser或Asp;A26為Leu或Ile;A27為Met、Ile、Leu或Nle;A28為Ser、Asn、Ala或Asp;A29為Lys或Arg;禾口A3。為缺失、X或X-Lys，其中X缺失或者為序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其中的一個片段，其中該片段在C-末端被縮減了1到15個氨基酸；并且來自片段的一個氨基酸殘基可任選被一個lys殘基取代；以及其中的C-末端可以是游離羧酸或相應的酰胺，限制條件是，如果A2為Ala，該片段就不是被縮減了5-8個氨基酸的片段。本發明涉及具有體內半衰期延長的GRF衍生物的治療及相關應用，特別適用于-提高生長激素的水平；-通過給受試者施用本發明GRF衍生物類似物并檢測生長激素反應來診斷生長激素缺陷；-治療垂體侏儒癥；-治療或預防生長延遲；-加速骨折修復或傷口愈合；_加速燒傷患者或進行大手術患者的恢復；-提高肌肉力量，活動性，保持皮膚厚度，代謝平衡或腎平衡；-治療或預防充血性心力衰竭；-治療或預防與老化相關的虛弱；-治療或預防骨質疏松癥；-治療或預防肥胖；-減少大手術后蛋白代射反應；-減少慢性病導致的惡病質和蛋白喪失；-提高蛋白合成代謝(包括節約蛋白作用)；_誘導脂解效應；和/或_提升促生長激素細胞功能。上述所有方法均可用于人或動物。除了促進生長激素的內源性產生或釋放，本發明GRF衍生物可能在GRF肽"主鏈"內的一個或多個位點摻入氨基酸取代，或者為GRF種的變體，其中C-末端和/或N-末端通過添加一個或多個堿性殘基而被改變，或者被修飾以摻入肽化學領域傳統使用的封閉基團類型從而保護肽末端免于體內不需要的生化攻擊和降解。因此，本發明GRF衍生物在任何GRF物種的情況下摻入一個氨基酸取代，包括但不限于人GRF、牛GRF、大鼠GRF、豬GRF等，很多作者都報告了它們的序列。在一個更優選的實施方案中，一個賴氨酸殘基被添加到GRF肽序列的C-末端或N-末端。在一個優選的實施方案中，蛋白上的官能團為巰基，反應實體為馬來酰亞胺或含馬來酰亞胺的基團例如Y-馬來酰亞胺-丁酰胺(GMBA)、馬來酰亞胺丙酸(MPA)、(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)-MPA、乙二胺(EDA)-MPA或[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)-MPA和它們的組合物。組合的例子包括但不限于(AEEA-EDA)-MPA、(AEEA-AEEA)-MPA、(AEA-AEEA)-MPA等。當反應混合物的pH保持在6.5和7.4之間，馬來酰亞胺基團最適合在肽上選擇巰基。在pH7.0，馬來酰亞胺基團和巰基的反應比率較與胺反應快1000倍。馬來酰亞胺基團和巰基之間形成的一個穩定的巰醚鍵在生理條件下不能被切開。本發明的GRF衍生物提供了血液組分的特異性標記。這樣的特異性標記，特別是用馬來酰亞胺基標記的，有很多優點。巰基在體內較氨基少，其結果是馬來酰亞胺衍生物與較少量的蛋白共價結合。例如，在血清白蛋白中，每分子只有一個游離巰基。因此，GRF-馬來酰亞胺-白蛋白結合物往往包括約1:l摩爾比的肽和白蛋白。除了白蛋白，IgG分子(II型)也有游離巰基。因為IgG分子和血清白蛋白組成了血液中可溶蛋白的大部分，它們也組成了適于共價連接到馬來酰亞胺取代的GRF的游離巰基的大部分。此外，即使在含游離巰基的血液蛋白中，馬來酰亞胺的特異標記由于白蛋白本身的唯一特性導致肽-馬來酰亞胺-白蛋白結合物優選形成。在物種內高度保守的白蛋白單個游離巰基位于Cys^氨基酸殘基處。最近發現白蛋白的Cys^相對于其它含游離巰基的蛋白的游離巰基有增強的活性。這部分歸功于白蛋白Cys^的非常低的pK值5.5。這個值大大低于一般Cys殘基的典型pK值，大約為8。由于這個低pK值，在正常生理條件下，白蛋白的Cys34主要為離子化的形式，大大提高了其活性。除了Cys34的低pK值，另外一種加強Cys^活性的因素為其位點，其在接近于白蛋白V區的一個環的表面的裂縫內。這個位點使得Cys34非常接近所有類型的配體，并且是Cys34作為自由基誘捕劑和游離巰基清除劑的一種重要因素。結果反應速率的促進可以比肽-馬來酰亞胺和其他含游離巰基的蛋白反應速率高1000倍。肽-馬來酰亞胺-白蛋白結合物的另一個優點是在Cys^處肽與白蛋白以1:1特異性負載相關的可重復性。傳統的激活技術，例如用戊二醛、DCC、EDC和其它例如游離氨基的化學激活劑，就缺少這種選擇性。例如，白蛋白含有52個Lys殘基，其中25-30個位于白蛋白的表面，易于接近結合。這些Lys殘基的激活，或者通過這些Lys殘基偶聯修飾肽，就會產生大量的異質結合物。即使采用等摩爾比的肽白蛋白(即l:l)，最終的結果也是產生隨機的結合物，有時還出現白蛋白的每個分子連接的無數個肽的情況，并且每個結合物上，肽隨機地在25-30個合適的Lys位點中任一處偶聯。結果，表征準確組成幾乎是不可能的，更不用提缺乏可重復性。此外，雖然看上去通過白蛋白的Lys殘基的結合物至少具有每個白蛋白轉運更多個治療劑的優點，但是研究顯示治療劑和白蛋白的比率為1:l是優選的。在Stehle等，Anti-CancerDrugs，1997,8,677-685的文獻中，其在此處全文引用，報道比率l:l的抗癌氨甲蝶呤和白蛋白通過戊二醛結合獲得最好的結果。這些結合物被腫瘤細胞吸收，雖然結合物攜帶5:1到20:1的氨甲蝶呤分子改變了HPLC圖譜，并且在體內被肝迅速吸收。因此似乎在更高比率處，白蛋白構造的改變減少了其作為治療劑載體的有效性。通過控制性給藥本發明GRF衍生物，特別是給藥含馬來酰亞胺反應實體的GRF，特異性體內標記或結合白蛋白和IgG可被控制。在典型的給藥中，發現所給藥的肽衍生物的80-90X結合到白蛋白上，少于5X結合到IgG上。也出現游離巰基的痕量結合，例如谷胱甘肽。這樣的特異性結合在體內應用是優選的，因為能夠準確計算出所給藥的治療劑的確切半衰期。12除了提供控制的體內特異性結合，馬來酰亞胺取代的GRF肽可以提供離體血清白蛋白和IgG的特異性標記。這樣的離體結合包括添加馬來酰亞胺-肽到含有純化的血液組分例如血清白蛋白和/或IgG的血液，血清或鹽溶液中。在優選的形式下，衍生物任選通過一個連接基團被馬來酰亞胺取代，并且在鹽溶液中與血清白蛋白反應。一旦離體用本發明GRF衍生物進行了修飾，血液、血清或鹽溶液可以被重新給藥到血液用于體內治療。在水溶液和游離氨基的存在下，馬來酰亞胺取代的GRF肽一般非常穩定。因為馬來酰亞胺取代的GRF肽和游離巰基反應，不需要保護基團來阻止它們和自身反應。此外，肽衍生物穩定性的提高允許使用類似HPLC的進一步的純化過程以制備適于體內應用的高度純化的產物。最后，化學穩定性的提高提供了具有更長保存期的產物。GRF衍生物與血液組分的目的結合物可以通過將衍生物體內直接施用給受試者進行制備，受試者可以是動物或人。給藥可以以大丸劑的方式進行，或者采用計量流量輸注的方式隨時間慢慢導入等。或者，結合物的制備也可體外通過將血液或商業上可用的純化血液組分與本發明GRF衍生物結合進行，使得GRF衍生物與血液組分的官能團的共價結合，并且將共價結合的血液或共價結合的純化的血液組分返回或施用給宿主。此外，上述過程的完成可以首先純化單個血液組分或限制數量的血液組分，例如紅細胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等，然后離體將一種或多種組分與本發明化合物衍生物結合。標記的血液或血液組分可被返回給受試者以體內提供治療有效的結合物。血液也可被處理以預防在離體操作過程中的凝固。肽合成GRF肽的合成可以通過本領域任何普通技術人員公知的固相肽化學的常規方法進行。比如，肽的合成可以通過固相化學技術遵循Steward等在SolidPhaseP印tideSynthesis,第二片反，PierceChemicalCompany,Rockford，111.，(1984)描述的過禾呈，使用AppliedBiosystem合成儀進行。類似地，肽片段合成被結合或連在一起形成較大的肽。這些合成的肽片段也可以在特定位點進行氨基酸取代來制備。對于固相肽合成，可以在Stewart等〃SolidPhaseP印tideSynthesis〃，W.H.FreemanCo.(SanFrancisco)，1963禾口Meienhofer，HormonalProteinsandP印tides，1973，246中找到很多技術的綜述。對于經典的溶液合成，參見例如Schroder等"TheP印tides"，第1巻，AcacemicPress(NewYork)。一般情況下，這樣的方法包括后續添加一個或多個氨基酸或合適保護的氨基酸到一個正在生成的肽鏈。正常情況下，第一個氨基酸的氨基或羧基通過合適的保護基團加以保護。被保護或衍生的氨基酸在適于形成酰胺鍵的條件下通過在具有恰當保護的互補基團(氨基或羧基)的序列上添加下一個氨基酸或被吸著到惰性固相支持物或在溶液中被利用。然后保護基團被從這個新加入的氨基酸殘基上移走，加入另一個氨基酸(經適當保護的)，反復進行。所有目的氨基酸被連接到正確的序列后，任何剩下的保護基團(和任何固相支持物)隨后或者同時被移走以提供最終的多肽。通過這個一般過程的簡單修飾，可以每次加入一個以上的氨基酸到生成的鏈上，比如，在去保護后通過用一個被正確保護的二肽偶聯(在不使手性中心外消旋的條件下)一個被正確保護的三肽而形成五肽。制備本發明GRF衍生物的一個特別優選的方法包括固相肽合成，其中氨基酸a-N-末端被一個酸性或堿性敏感的基團保護。這樣的保護基團應該具有的特征是，雖然在沒有破壞生成的肽鏈或使得任何其中包含的手性中心消旋的情況下很容易移走，但是對于肽鍵形成的條件是穩定的。N-保護基團和C-保護基團的例子公開于Greene,〃ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis,〃(JohnWiley&Sons,NewYork第152-186頁(1981))，將其在此引作參考。N_保護基團的例子包括但不限于，低級烷酰基，例如，甲酰基、乙酰基("Ac")、丙酰基、特戊酰基、叔-丁基乙酰基等；其它酰基包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、鄰苯二甲酰基、鄰硝基苯氧乙酰基、氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基例如苯磺酰基、對甲苯磺酰基、鄰硝基苯磺酰基、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(pmc)等；氨基甲酸酯形成基團，例如叔-戊氧羰基、苯甲基氧羰基、對氯苯甲基氧羰基、對甲氧基苯甲基氧羰基、對硝基苯甲基氧羰基、2_硝基苯甲基氧羰基、對溴苯甲基氧羰基、3，4-二甲氧基苯甲基氧羰基、3，5-二甲氧基苯甲基氧羰基、2，4-二甲氧基苯甲基氧羰基、4-乙氧基苯甲基氧羰基、2-硝基_4，5-二甲氧基苯甲氧羰基、3，4，5-三甲氧基苯甲氧羰基、1-(對聯苯基)-l-甲基乙氧羰基、a，a-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧羰基、二苯甲基氧羰基、叔丁氧羰基(boc)、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧基羰基、異冰片基氧羰基、環戊氧羰基、金剛烷氧羰基、環己基氧羰基、苯基硫羰基等；芳烷基例如苯甲基、二苯基異丙基氧羰基、三苯基甲基、苯甲基氧甲基、9-荷甲基氧羰基(Fmoc)等和甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基等。優選的a-N-保護基是鄰硝基苯氧硫基；9-芴甲基氧羰基叔丁基氧羰基(boc);異冰片基氧羰基；3，5-二甲氧苯甲氧羰基；叔戊基氧羰基；2-氰基-叔丁基氧羰基等，其中9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)是更優選的，而優選的側鏈N-保護基包含2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃_6-磺酰基(pmc)、硝基、對甲苯磺酰基、4-甲氧苯-磺酰基、Cbz、Boc和金剛烷氧羰基用作側鏈氨基如同賴氨酸和精氨酸；芐基、鄰溴芐基氧羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環己基、環戊基和乙酰基(Ac)用于酪氨酸；叔丁基、節基和四氫吡喃基用于絲氨酸；三苯甲基、芐基、Cbz、對甲苯磺酰和2，4-二硝基苯基用于組氨酸；甲酰基用于色氨酸；芐基和叔丁基用于天冬氨酸和谷氨酸；以及三苯甲基(trityl)用于半胱氨酸。傳統的羧基保護基是指羧酸保護酯或酰胺基。這樣的保護基團對于本領域的技術人員是公知的，已經廣泛用于青霉素和頭孢菌素領域羧基的保護，如US3，840，556和3，719，667中所述，其公開物在此引作參考。代表性的羧基保護基包括但不限于C「Cs低級烷基；芳烷基例如苯乙基或芐基及其取代的衍生物，例如烷氧苯甲基或硝基芐基；芳烯基例如苯乙烯基；芳基及其取代的衍生物例如5-茚基；二烷基氨基烷基例如二甲基氨基乙基；烷酰基氧烷基例如乙酰氧甲基、丁酰氧甲基、戊酰氧甲基、異丁酰氧甲基、異戊酰氧甲基、l-(丙酰氧)-l-乙基、l-(新戊酰氧基)-l-乙基、1_甲基丙酰氧基)-l-乙基，新戊酰氧甲基、丙酰氧甲基；環烷酰基氧烷基例如環丙基羰基氧甲基、環丁基羰基氧甲基、環戊基羰基氧甲基、環己基羰基氧甲基；芳酰基氧烷基例如苯甲酰基氧甲基、苯甲酰基氧乙基；芳烷基羰基氧烷基例如芐基羰基氧甲基、2-芐基羰基氧乙基；烷氧基羰基烷基或環烷氧基羰基烷基例如甲氧基羰基甲基、環己氧基羰基甲基、1_甲氧基羰基-l-乙基；烷氧基羰基氧烷基或環烷基氧羰基氧烷基例如甲氧基羰基氧甲基、叔丁氧基羰基氧甲基、1-乙氧基羰基氧-1-乙基、1_環己基氧羰基氧-1-乙基；芳氧基羰基氧烷基例如2_(二氮雜菲氧羰基氧)-乙基、2-(5_茚基氧羰基氧)-乙基；烷氧基烷基羰基氧烷基例如2-(1_甲14氧基-2-甲基丙烷-2-酰基氧)_乙基；芳烷基氧羰基氧烷基例如2-(芐氧基羰基氧)乙基；芳烯基氧羰基氧烷基例如2_(3-苯基丙烯_2-基氧羰基氧)乙基；烷氧基羰基氨基烷基例如叔丁氧基羰基氨甲基；烷基氨基羰基氨基烷基例如甲基氨基羰基氨甲基；烷酰基氨基烷基例如乙酰基氨甲基；雜環羰基氧烷基例如4_甲基哌嗪基羰基氧甲基；二烷基氨基羰基烷基例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基；(5-(低級烷基)_2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)烷基例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)甲基；和(5-苯基-2-氧-l，3-dioxolen-4-yl)烷基例如(5-苯基_2_氧_1，3-dioxolen-4-yl)甲基。代表性的酰胺羧基保護基包含但不限于甲酰胺基和低級烷基氨基羰基。在以上所述的羧基保護基中，低級烷基，環烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、仲丁酯、異丁酯、戊酯、異戊酯、辛酯、環己酯、苯乙酯等或烷酰基氧烷基、環烷酰基氧烷基、芳酰基氧烷基或芳烷基羰基氧烷基酯是優選的。優選的酰胺羧基保護基是低級烷基氨基羰基。在固相肽合成方法中，a-C-末端氨基酸被附著到一個合適的固相支持物或樹脂上。用于上述合成的合適的固相支持物對于化學試劑和逐步縮合-去保護反應是惰性的，也不能溶于使用的介質。合成a-C-末端羧基肽的優選固相支持物為羥甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯_1%二乙烯基苯)。用于a-C-末端酰胺肽優選的固相支持物是4-(2'，4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂，可以從AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)獲得。該a-C-末端氨基酸，通過N，N'-二環己基碳二亞胺(DCC)、N，N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-l-基-N，N，N'，N'-四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)，有或者沒有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、l-羥基苯并三唑(H0BT)、苯并三氮唑-1-基氧_三(二甲基氨基)磷鎗_六氟磷酸鹽(B0P)或二(2-氧-3-唑烷基)膦氯化物(B0PC1)被偶聯到樹脂上，偶聯反應在例如二氯甲烷或匿F的溶劑中l(TC-5(TC溫度下進行約1-約24小時。當固相支持物是4-(2'，4'-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂時，在如上所述與a-(:末端氨基酸偶聯之前，將？!110(3基團用仲胺，優選呱啶切割。用于結合到去保護的4-(2'，4'-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂的優選方法為在DMF中的O-苯并三唑-l-基-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，1當量)、二異丙基乙胺(DIEA，1當量)，和任選1-羥基苯并三唑(H0BT，1當量)。保護氨基酸的連續偶聯可以本領域眾所周知的常規方式在全自動多肽合成儀上進行。從正在生成的a-N-末端移走Fmoc保護基團傳統上是通過，例如仲胺，優選呱啶處理來完成的。導入約三倍摩爾過量的每種被保護的氨基酸，偶聯優選在DMF中進行。偶聯劑通常是0-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，1當量)、二異丙基乙胺(DIEA，1當量)和任選1-羥基苯并三唑(H0BT，1當量)。在固相合成結束后，將肽從樹脂上移走然后去保護，連續性操作或單獨操作皆可。多肽的移去和去保護可用傳統的單獨操作完成，即用含苯硫基甲烷、三異丙基硅烷、苯酚和三氟乙酸的切割試劑處理樹脂結合的多肽。在多肽的a-C-末端為烷基酰胺時，樹脂用烷基胺進行氨解切割。或者，肽可以例如用甲醇，通過酯交換作用被移走，接著通過氨解或者直接轉酰氨基作用進行。被保護的肽可以在這點上被純化或者直接進入下一個步驟。側鏈保護基團的移去通過上述的切割混合物來完成。完全去保護的肽的純化通過色譜步驟順序采用任何或者所有下列類型進行在弱堿性樹脂上的離子交換(醋酸鹽的形式)；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如AmberliteXAD)上的疏水吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上的離子交換色譜；例如在S印hadexG_25TM，LH-20上的分配色譜，或反流分布法；高效液相色譜法(HPLC)，特別是在辛基_或十八烷基甲硅烷基_二氧化硅鍵合相柱填充物上的反相HPLC。任何本領域的普通技術人員將能容易地確定什么是獲得可接受的提純GRF肽所要求的優選色譜步驟和順序。用四極電噴霧(QuadrupoleElectroSpray)質譜確定這些肽的分子量。用于生產本發明GRF衍生物的合成過程變化很廣泛，依賴于各種因素的性質，即GRF衍生物中所含的GRF序列、連接基團和反應實體。為了確保簡化、高產和可重復性以及保證高純度的產物，對合成程序加以選擇。正常情況下，在合成的最后階段，使化學反應基團偶聯。用于生產本發明GRF衍生物的特別方法在下面描述。必須將化學反應實體放在一個位點上，以使肽結合到血液組分上，同時保持原始GRF肽的主要部分，如果不是全部的話，活性和/或有益效果。在一個更優選的實施方案中，每種GRF衍生物的合成將根據下列標準進行如果末端羧基對于肽是合適的，而且對于保持藥理活性是不重要的，以及在肽上沒有其它的敏感官能團，那么羧酸就被選作連接位點用于連接基團_反應實體修飾。如果末端羧基參與藥理活性，或者沒有合適的羧酸，那么，任何其它的對于保持藥理活性不重要的敏感官能團將被選擇作為連接位點用于連接基團_反應實體的修飾。如果肽上有若干敏感官能團是合適的，將使用保護基團的組合，其使用方式是在加入連接基團/反應實體并對所有被保護的敏感官能團去保護后，依然能夠保留藥理活性。如果肽上沒有合適的敏感官能團，應該試圖進行合成以對原始肽進行修飾，采用的方式是保留生物活性和保留受體或靶的特異性。在這種情況下，修飾應優選發生在肽的相對末端。本發明GRF衍生物可以單獨使用也可以與其它的藥物或藥用產品結合使用以使得它們的治療效果最優化。它們可以生理條件下可接受的介質給藥，例如，去離子水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、鹽水、含水乙醇或其它醇類、血漿、擬蛋白質(proteinaceous)溶液、甘露醇、含水葡萄糖、醇、植物油等。其它可能含有的添加劑包括緩沖液，其中介質緩沖液的pH范圍通常大約為5到IO，緩沖液濃度一般是約50到250mM;鹽，其中鹽的濃度范圍一般是約5到500mM，生理上可接受的穩定劑等。為了方便儲存和運輸，組合物可以被凍干。本發明肽衍生物可以通過口服、腸胃外給藥，例如血管內(IV)、動脈內(IA)、肌內(IM)、皮下(SC)等方式給藥。在合適的情況下，可以通過輸液的方式給藥。一些情況下，官能團的反應相對較慢，給藥可以通過口服、鼻、直腸、經皮、氣霧劑進行，其中結合物的特性容許轉運到血管系統。雖然如果需要可以使用多于一次注射，但一般采用單次注射。可以用任何傳統的方式給藥肽衍生物，包括注射、套針、導管等。給藥的特殊方式可以根據給藥量是單次推注給藥還是連續給藥等而變化。優選的給藥方式為血管內，導入的位點對于本發明不重要，優選的位點是該位點血流速度快，例如靜脈內、外圍或中央靜脈。也發現了其它的途徑，給藥與緩釋技術或者保護性基質結合。為了能夠與血液組分反應，目的是肽可被有效地分配到血液中。結合物的濃度變化很大，一般范圍是從大約lpg/ml到50mg/ml。血管內的總給藥量一般范圍是從大約0.lmg/ml到大約10mg/ml，更普遍的是從大約lmg/ml到大約5mg/ml。通過結合到血液中的長壽成分，例如免疫球蛋白、血清白蛋白、紅細胞和血小板，結果產生很多優點。本發明肽衍生物的活性持續數天，有可能持續長達幾星期。在這段時間內只需要一次給藥。能夠得到更大的特異性，因為活性化合物主要結合在大分子上，不大可能被細胞內吸收來參與其它的生理過程。可對哺乳動物宿主的血液中肽的活性和/或肽衍生物的存在進行監測。通過在不同的時間采集宿主血液的部分或樣品，人們可以確定肽是否已經以治療活性的足夠量結合到長壽的血液成分上，以及其后血液中肽的水平。如果需要，人們也可以確定肽共價結合到哪一種血液組分。對于特異性馬來酰亞胺取代的肽，僅僅需要簡單計算血清白蛋白和IgG的半衰期。也可利用檢測肽的活性，HPLC-MS或針對肽的抗體進行監測。本發明的另一方面涉及利用特異于本發明肽的抗體確定在生物樣品(如血液)中GRF肽或其結合物的濃度的方法，和涉及以這樣的抗體作為一種治療方法用于治療與這樣的肽或結合物可能有關的毒性。這是有利的，因為在病人體內GRF衍生物延長的存在和壽命可能導致在治療中新的問題出現，包括毒性有可能增加。通過利用對特殊衍生物具有特異性的單克隆或多克隆的"抗衍生物"抗體可以幫助調節任何這樣的問題。該抗體可能產生或來源于一宿主，該宿主被特殊修飾的肽，或藥物的免疫原性片段，或對應于藥物的抗原決定簇的合成的免疫原免疫。優選的抗體應該對該肽衍生物的天然、衍生和結合形式具有高的特異性和親合性。這樣的抗體還可以被酶、熒光染料或放射性標記標記。特異于GRF衍生物的抗體可以通過使用純化的肽誘導衍生的肽特異抗體來產生。通過誘導抗體，其目的不僅是通過注射動物剌激免疫反應，而且是類似的步驟生產合成抗體或其他特異性結合分子，例如篩選重組免疫球蛋白文庫。單克隆和多克隆的抗體可以通過本領域公知的程序來生產。該抗體也可以用來監控衍生物在血流中的存在。血液和/或血清樣品可以通過SDS-PAGE和western印跡進行分析。這些技術可以用來分析血液或血清以便確定該GRF衍生物和血液組分的結合。該抗治療劑抗體也可以用來治療由該GRF衍生物給藥誘導的毒性，并可能被用在離體或體內。離體方法包括使用被固定到固相支持物上的抗治療劑抗體免疫透析治療毒性。體內方法包括給藥抗治療劑抗體，其量足以有效地誘導抗體藥物復合物的清除。通過在無菌的條件下將血液與抗體接觸，該抗體可用來在離體從病人的血液除去GRF衍生物及其結合物。例如抗體可以被固定在一柱基質上，然后從病人身上移出血液，并通過該基質。該GRF衍生物將與該抗體結合，然后含低濃度該GRF衍生物的血液可以被返回到該病人的循環系統。除去的GRF衍生物的量可以通過調節壓力和流速而得到控制。從一病人血液的血漿組分優選移去該GRF衍生物可以實現，例如，通過利用半透膜，或者另外在將血漿組分通過含抗治療抗體的基質之前首先以本領域公知的方法從細胞組分分離血漿組分。或者，優選移出衍生物結合的包括紅血球的血細胞可以實現，即通過收集和濃縮病人血液中的血細胞并將這些細胞與固定的抗肽抗體接觸以排除病人血液的血清組分。該抗肽抗體可以體內腸胃外被給藥到一接受了GRF衍生物或結合物治療的病人。抗體將結合GRF衍生物和結合物。一旦結合，如果不是完全封閉，該GRF衍生物活性將被阻礙，從而減少GRF衍生物在該病人血流中的生物有效濃度，并將有害的副作用降至最小。另外，該結合抗體_肽復合體將促進GRF衍生物和結合物從該病人血流中清除。提供下列實施例以闡明本發明的優選實施方案，并決不被看作是限制其范圍。除非另外指出，采用L-構型光學活性保護的氨基酸。合成在產生GRF衍生物過程中，GRF衍生物的合成是在Symphony肽合成儀上利用全自動固相程序并在人工介入下進行的。合成是利用Fmoc-保護的氨基酸在Fmoc保護的RamageTM酰胺接頭樹脂上進行。偶聯的完成采用N，N-二甲基甲酰胺(匿F)溶液中的O-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)作為激活劑混合物。Fmoc保護基利用20X的哌啶/DMF除去。必要時，Boc-保護的氨基酸被用在N末端，為了在肽從樹脂上切割后產生游離的Na-末端。在合成中所用的全部氨基酸具有L-立體化學構型，除非另有說明。合成中使用Sigmacoted玻璃反應罐。實施例1Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg—COM^步驟1:固相肽的合成以100mol量級進行。下列保護的氨基酸按添加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Met_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc-Asn(Trt)_0H、Fmoc-Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Ala-0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。它們溶解到N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，并且根據順序，利用0-苯并三唑-l-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)激活。Fmoc保護基團的移去利用20%(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘(步驟1)來完成。最終的氨基酸的氨基利用0-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)激活的乙酸而乙酰化。步驟2:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚從樹脂上切割肽，然后用干冰冷的(0-4tOE^0進行沉降。粗肽收集在聚丙烯燒結的漏斗內，干燥，并重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，然后冷凍干燥產生相應粗提物，用于純化過程中。實施例2實施例1的GRF肽的長效衍生物Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)_C0NH2步驟1:實施這個步驟如同上述實施例1，除了加到樹脂上的第一個氨基酸為Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步驟2:Lys(Aloc)基團的選擇性去保護人工進行，并且通過用溶解在5mLc6h6:chci3(i:i):2.5%nmm(v:v):5%Ac0H(v:v)中的3當量Pd(pph3)4溶液處理樹脂2小時完成。然后樹脂用CHCl3(6x5mL)、20%Ac0H的DCM(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗滌。步驟3:該合成加入3-馬來酰亞胺丙酸(MPA)而重新自動進行。每次偶聯之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和異丙醇分別洗滌三次。18步驟4:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚將衍生物從使用的樹脂上切割，然后通過干冰冷的(0-4tOE^0進行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯燒結的漏斗中，干燥，重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，冷凍干燥產生相應的粗GRF衍生物，用于純化過程中。實施例3Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg—CONI^步驟1:固相肽的合成以100i！mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1中所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-MetOH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-Tyr(tBu)~0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例4實施例3的GRF肽的長效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Arg_Lys(MPA)_C0NH2步驟1:這個步驟的操作如同實施例3，除了加到樹脂上的第一個氨基酸為Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例2的步驟2-4相同。實施例5Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Ser(tBu)-0H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例6實施例5的GRF肽的長效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_Lys(MPA)_C0NH2《鍋奪篤+—第胡T都樹瞎呢丄魏'6歸軀籠留fl^^翁胡凝4+pT凝率"8U)]2腦3_(VdW)s斗3JV-J:9s-ri9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-J9S-n9i—ui3-BIV_n9i_iBA_(sXi(9諷—N))—3jv—JX丄一J9s—ui3—Jq丄一9qd—9II—Biv—dsv—BlB(a)[Oslo]蹄帀級膽4胡難邏3胡6歸軀籠[e丄m]0T歸軀籠[8"0]°留繼z凝率胡T歸軀籠封￥《軀籠胡凝4資z凝率["lo]°H0-(順)^丄—3og、H0-可V(CI)-測d、H0-(順)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、H0_(順)Jq丄-測d、H0—(lJ丄)ui9—3ouij、H0(ngi)J3S—3ouij、ho_(ngi)JX丄—3ouij、H0—(jqd)3JV—3ouij、H0-(3og)s人i一3ouy、H0_I13A_3ouy、朋_朋1_測3、H0-可V-測d、H0-(W)ui9-測d、H0-朋l-測d、H0-(順H3S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3JV-測d、H0-(，)s人i—測j、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(順)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0_(ng"j9S_30uy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都樹瞎呢謝雖胡彩巡T凝4胡T歸軀籠ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮rtootra掛導胡難繼留t凝率[g"o]3腦3-S牛J9S-n9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-T3iv-J^s-ri9i—ui3-BIV_n9i_iBA_(sXi(9諷—N))—3jv—JA丄一J9S—ui3—Jq丄一9qd—9II—Biv—dsv—BiB(a)-JX丄l0]6歸軀籠°留繼卜z凝率胡z歸軀籠封￥《軀籠胡凝4短班卜z凝4[s"o]°H0-(30IV)sAi-。ouy《鍋奪篤m]小一第胡T^樹瞎呢丄魏'丄歸軀籠留頃#翁胡凝4+班T凝4""o]2腦3_(VdW)s斗3"iV-J:9s-ri9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-J9S-n91—ui3-可V-朋l-IT3A-"l-3JV(a)-^丄-i9S-ui3-Jq丄-3iH-3II-可V-dsV-T3IV(a)-^丄[OdO]蹄帀級膽4胡難邏3胡z歸軀籠[egm]8歸軀籠[89m]°留繼z凝率胡T歸軀籠封￥《軀籠胡凝4資z凝率[am]°H0-(順)^丄—3og、H0-可V(a)-測d、H0-(順)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、H0_(順)Jq丄-測d、H0—(^j丄)ui9—3ouy、H0_(ngi)J3S_3ouy、H0_(ngi)JX丄—oouy、ho_(jqd)3』v(a)_3ouy、H0-(3og)"l-測d、H0-IT3A-測d、H0-nai-測d、H0』IV-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0-朋l-測d、H0-(順H3S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3JV-測d、H0-(，)s人i—測j、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(順)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0_(ng"j9S_30uy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都樹瞎呢謝雖胡彩巡T凝4胡T歸軀籠ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮9iorartootra掛導胡難繼留t凝率[ggm]加03』牛"S-朋i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-"S-n91—ui3-T3IV-n31-IT3A-sXl-SJV(a)-JXi-Jss-uig-Jqi-sqd-^II-T3IV-dsV—13113(d)-"丄[S9m]丄歸軀籠°留繼卜Z凝率胡Z歸軀籠封￥《軀籠胡凝4短班卜Z凝率[S9U)]。H0-(3。IV)"l-測d《鍋奪篤+—第胡T都樹瞎呢丄魏'S歸軀籠留fl^^翁胡凝4+PT凝率["l0]樂的說V0W969而N3Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例2的步驟2-4相同。實施例11實施例9的GRF肽的第二種長效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys(MPA)_Val_Leu_Ala_Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Leu—Ser—Arg—C0NH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc_Ile_OH、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Lys(Boc)_OH、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_OH、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Aloe)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)Ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例2的步驟2-4相同。實施例12(牛GRF)Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Asn_Arg_CONH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-0H、Fmoc-Met-OH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例13實施例12的GRF肽的長效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Asn_Lys(MPA)_C0NH2步驟1:這個步驟的操作如同實施例12，除了加到樹脂上的第一個氨基酸為Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例2的步驟2-4相同。實施例14(牛GRF)Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-0H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例14實施例13的GRF肽的長效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_Lys(AEEA_MPA)_C0NH2步驟1:這個步驟的操作如同實施例13，除了加到樹脂上的第一個氨基酸為Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步驟2:Lys(Aloc)基團的選擇性去保護人工進行，并且通過用溶解在5mLc6h6:chci3(i:i):2.5%nmm(v:v):5%Ac0H(v:v)的3當量Pd(pph》4溶液處理樹脂2小時(步驟2)完成。然后樹脂用CHCl3(6x5mL)、20%Ac0H的DCM(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗滌。步驟3:該合成然后加入Fmoc-AEEA-OH(Fmoc-氨基乙氧基乙氧基醋酸)而重新自動進行。每次偶聯之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和異丙醇分別洗滌三次。在正確去保護后，MPA(3-馬來酰亞胺丙酸)被固定在AEEA間隔區，然后樹脂再用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和異丙醇分別洗滌三次。步驟4:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚將衍生物從使用的樹脂上切割，然后通過干冰冷的(0-4tOE^0進行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯燒結的漏斗，干燥，重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，冷凍干燥產生相應的粗GRF衍生物，用于純化過程中。實施例15(牛GRF)Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_(D)arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2步驟1:固相肽的合成以100i！mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_(D)arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例16實施例15的GRF肽的長效衍生物s丫H(dffi)専顆)OZ歸軀籠[l"o]°留繼，-z凝率胡z歸軀籠封￥《軀籠胡凝4短班卜z凝4[o"o]°H0-(順)^丄—3og、H0-平(a)-測d、H0-(順)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、HO_(順)Jq丄-測d、H0—(lJ丄)ui9—3ouij、H0—(ngi)J3S—3ouij、H0_(ngi)JX丄—3ouij、H0—(jqd)3JV—3ouij、H0-(3oiv)"l-測d、H0-IT3A-扁d、H0-nai-扁d、H0』IV-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0-n3i-測d、H0-(順)"S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3牛30叫、H0-(308)"l-測d、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(順)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0—(w丄)usy—3ouy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都樹瞎呢謝雖胡彩巡T凝4胡T歸軀籠ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮rtootra掛導胡難繼留t凝率[e^o]加03』牛usv-ri9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-"S-n9i—ui"IV-^l-H(VdW)sXi—Sjv-^—jss-uig-m-siH-^II-BIV-dsV-BI13(d)-"丄[8"0]蹄審級狻4扭二第胡難邏3胡丄T歸軀籠["z0]6T歸軀籠[9w0]°留繼，-z凝率胡z歸軀籠封￥《軀籠胡凝4短班卜z凝4[swo]。H0-(3。IV)"l-測d《鍋奪篤+—第胡T都樹瞎呢丄魏'丄T歸軀籠留賄#翁胡凝率+班T凝率[^瀏蹄帀級膽4胡難邏3胡丄T歸軀籠[zwo]8T歸軀籠[lwo]°留繼Z凝率胡T歸軀籠封￥《軀籠胡凝4資Z凝率°H0-(順)^丄—3og、H0-平(a)-測d、H0-(順)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、H0_(順)Jq丄-測d、H0—(lJ丄)ui9—3ouij、H0(ngi)J3S—3ouij、ho_(ngi)JX丄—3ouij、H0—(jqd)3JV—3ouij、H0-(3og)s人i一3ouy、H0_I13A_3ouy、朋_朋1_測3、H0-可V-測d、H0-(W)ui9-測d、H0-朋l-測d、H0-(順H3S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3JV-測d、H0-(，)s人i—測j、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(順)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0—(w丄)usy—3ouy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都樹瞎呢謝雖胡彩巡T凝4胡T歸軀籠ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮rtootra掛導胡難繼留t凝率[e^o]3腦3』牛usV-n31-3II-dsV-ui9-n31-n31-s斗^V-可V-"S-n91-1119-13IV_n9i_iBA_(sXi(9諷—N))—3jv—JX丄一J9s—ui3—Jq丄一9qd—9II—Biv—dsv—BiB(a)-JX丄[8^0](邏3+ut歸軀籠[abo]°留繼卜z凝率胡w歸軀籠封￥《軀籠胡凝4短班卜z凝4[9^0]。H0-(3。IV)"l-測d《鍋奪篤+—第胡T都樹瞎呢丄魏'ST歸軀籠留fl^^翁胡凝率+PT凝率[sbo]2腦3_(VdW_V33V)sXl_Sj:v_usv_ri3i_3ii_dsv_ui3_n3i_ri3i_sXi_Sj:v_T3iv_J^s_ri3i_ui3-T3IV-n31-IT3A-sXl-SjB(a)-jXi-jss-uig-Jqi-sqd-^II-BIV-dsV-BI13(d)-"丄[wzo]u-Ser-Al3-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-C0NH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)0H、Fmoc_Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Met_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例21實施例20的GRF肽的長效衍生物His-(D)ala_Asp_Gly_Met_Phe_Asn_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Ala_Leu_Gly_Gln_Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)_C0NH2步驟1:該步驟的實施如同實施例20。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例14的步驟2-4相同。實施例22(鮭魚GRF)實施例20的GRF肽的第二種長效衍生物His-(D)ala_Asp_Gly_Met_Phe_Asn_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys(MPA)_Ala_Leu_Gly_Gln-Leu-Ser-Al3-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Al3-Lys-C0NH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Aloe)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Met_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例2的步驟2-4相同。實施例23(雞GRF)His-(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Leu_Leu_Gly_Gln_Leu—Ser—Ala—Arg—Asn—Tyr—Leu—His—Ser—Leu—Met—Ala—Lys—CONI^步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc—Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步驟2:該步驟的實施方式與實施例1的步驟2相同。實施例24實施例23的GRF肽的長效衍生物His_(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Leu_Leu_Gly_Gln_Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)_C0NH2步驟1:該步驟的實施如同實施例23。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例14的步驟2-4相同。實施例25實施例23的GRF肽的第二種長效衍生物His-(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys(MPA)_Leu_Leu_Gly_Gln-Leu-Ser-Al3-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Al3-Lys-C0NH2步驟1:固相肽的合成以100mole量級進行。下列被保護的氨基酸按序以實施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Aloe)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步驟2-4:這些步驟的實施方式與實施例2的步驟2-4相同。實施例26實施例1的GRF肽的第二種長效衍生物(N-MPA)_Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg—C0NH2步驟1:該步驟的實施如同上述實施例1，除了在合成結束時，將最后的組分(MPA)加入到樹脂中。步驟2:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚將衍生物從使用的樹脂上切割，然后通過干冰冷的(0-4tOE^0進行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯燒結的漏斗，干燥，重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，冷凍干燥產生相應的粗GRF衍生物，用于純化過程中。實施例27實施例1的GRF肽的第三種長效衍生物(N-AEEA_MPA)_Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Arg_CONH2步驟1:這個步驟的操作如同上述實施例1，除了加到樹脂上的倒數第二個組分為Fmoc-AEEA，以及最后的組分為(MPA)。步驟2:該步驟以及與實施例26的步驟2相同。純化程序利用Varian(Dynamax)制備性二元HPLC系統，通過制備性反相HPLC純化每個化合物。用PhenomenexLuna10ii苯基-己基，50mmx250mm柱(顆粒10ii)進行純化，柱用水/TFA混合物(0.1%TFA的水(溶劑A)和乙腈/TFA(0.1%TFA的CH3CN(溶劑B)平衡。以50mL/min運行28-38%B梯度180分鐘完成洗脫。通過在214和254mm處的UV吸光度(VarianDynamaxUVDII)檢測含有肽的組分。以25mL等分收集組分。那些含有目的產物的組分在直接注射到LC/MS后通過質量檢測進行鑒定。選擇的組分隨后通過HPLC(20-60%B運行20分鐘；PhenomenexLuna5y苯基-己基，10mmx250mm柱，0.5mL/min)分析鑒定，并把^90%純度的組分合并。用液氮對合并物凍干，然后凍干至少2天以產生白色粉末。體外結果—些本發明GRF衍生物經評估具有顯著促進GH在大鼠初級前腦垂體細胞培養物中分泌的能力。將新鮮的大鼠前腦垂體細胞與不同濃度的化合物接觸4小時，然后用市售的LincoResearch(MO)的RIA試劑盒檢測培養基中的GH水平。方法從麻醉的正常Sprague-Dawley大鼠移去全部腦垂體，直接收集到含兩性霉素和慶大霉素硫酸鹽的新鮮培養基中。腦垂體收集后l小時內的細胞用于制備初級細胞。把單個腦垂體切碎，組織碎片在持續溫和攪拌下用胰蛋白酶進行降解。組織碎片經巴斯德移液管機械破碎后再溫育15分鐘。研磨細胞，洗滌兩次，然后接種到含新鮮培養基的24孔板中。培養72小時后，細胞用不含血清的培養基洗滌兩次，然后用含或不含GRF類似物或衍生物溫育4小時。溫育后收集上清，并用放射免疫測定法定量檢測大鼠生長激素(試劑盒購自LincoResearch,MO)。如圖中所示，結果顯示所有本發明GRF衍生物都能刺激GH分泌，濃度范圍是10_6到10—,之間。刺激指數等同于市售的GRF(l-29)和D-Ala-GRF(l-29)(兩者皆來自PolypeptideLaboratories,California)。體內結果本發明GRF衍生物的體內活力經評估具有顯著促進自由活動的動物GH分泌的能力。化合物通過皮下濃注(liimol/kg)到插有導管的標準Sprague-Dawley大鼠進行給藥。收集連續的血液樣品來測定給藥化合物后的急性GH釋放。方法插入導管的7-8周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠在實驗前至少5天安裝鼠具以避免應激。實驗只在上午9-ll之間開始。每個處理組由8只大鼠組成。化合物通過皮下注射到腰背區的方式給藥1次。在注射后5、10、15、20、30和60分鐘時以前劑量采集系列血液樣品。收集血漿，然后將樣品直接送到LincoResearch(MO)，通過放射免疫測定GH。用MicrosoftExcel軟件進行統計分析(t_檢驗)。如圖中所示，結果顯示所有本發明GRF衍生物都能誘導標準大鼠模型分泌GH。藥代動力學研究對于實施例5和6的化合物進行藥代動力學研究。每種化合物皮下(1ymol/kg)或靜脈內(100nmol/kg)注射到雄性Sprague-Dawley大鼠體內。在藥物注射后5、30和60分鐘以及2、4、8、24、48、72和96小時以前劑量采集系列血液樣品。收集血漿并冷凍直至放26射免疫測定(RIA)進行分析。市售的抗原始GRF(l-29)的多克隆抗體被用來檢測化合物。檢測靈敏度為300到10000pM。所以，一些樣品必須稀釋后分析。藥代動力學圖譜的結果顯示于圖9。正如所見，實施例5的化合物即原始肽，消失得非常快。實際上，實施例5的化合物無論是皮下還是靜脈內給藥在給藥后60分鐘都不能檢測到。這與文獻中報告的有關GRF(l-29)及其它類似物在Sprague-Dawley大鼠中的半衰期和生物可利用率百分比(SC/IV)的結果吻合(參見例如P印tides，9:207-209，和J.Endocr.，107:R5-R8。另外，實施例6的化合物，根據本發明它是實施例5原始肽的衍生物，在96小時后仍可檢測到。附加的數據顯示在下列表2中。表2實施例6化合物的藥代動力學參數<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>盡管本發明結合特定的實施方案得已描述，但是可以理解其能被進一步的修飾，并且本申請意欲覆蓋遵循本發明一般原理，包括偏離本發明說明書但屬于本發明所屬
技術領域：
內已知或慣用的做法，和可應用于上文所述的必要特征以及落入所附權利要求的范圍之中的任意變化、使用或改編。權利要求1.一種生長激素釋放因子衍生物，其含有-如下GRF序列A「A2-Asp-A4-A5-Phe-A廠A8-A9-Tyr-An-Ai2-Ai3-leu-Ai5-Gln-Leu-Ai8-Ala-A2o-A2「A22-Le^_八24_八25_八26_八27_八28_八29_八30其中，Ai為Tyr、N_Ac_Tyr、His、3-MeHis、脫氨基His、脫氨基Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys_3_MeHis;A2為Val、Leu、Ile、D_Ala、N-甲基—D—Ala、(N_甲基)Ala、Gly、Nle或Nval;A4為Ala或Gly;A5為Met或lie;A7為Asn、Ser或Thr;A8為Asn、Gln、Lys或Ser;A9為Ala或Ser;An為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys;A12為Lys、(N-Me)Lys、Lys或D-Lys;A13為Val或Leu;A15為Ala、Leu或Gly;A18為Ser或Thr;A20為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys;A21為Lys、(N_Me)Lys或Asn;A22為Tyr或Leu;A24為Gin或His;A25為Ser或Asp;A26為Leu或lie;A27為Met、Ile、Leu或Nle;A28為Ser、Asn、Ala或Asp;A29為Lys或Arg;以及A30為缺失、X或X-Lys，其中X缺失或者是序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從C末端減少1到15個氨基酸；以及其中片段的一個氨基酸殘基可被賴氨酸殘基任選取代；并且其中C末端可以是游離的羧酸或相應的酰胺，其中GRF衍生物能夠促進生長激素產生和/或釋放活性；以及-任選經連接基偶聯到GRF肽上的反應實體，其中的反應實體是含馬來酰亞胺的基團，所述反應實體能夠在體內或體外與血液組分上的官能團共價結合。2.—種結合物，其包括與血液組分共價結合的如權利要求1所述的衍生物。3.如權利要求1或2所述的衍生物或結合物，其中血液組分包括白蛋白。4.如權利要求1至3任一項所述的衍生物或結合物，其中血液組分為人白蛋白。5.如權利要求4所述的衍生物，其中衍生物的反應基團能夠共價結合白蛋白的位于氨基酸殘基Cys34上的巰基。6.如權利要求4所述的結合物，其中衍生物的反應基團能夠共價結合白蛋白的位于氨基酸殘基Cys34上的巰基。7.如權利要求1至6任一項所述的衍生物或結合物，其中含馬來酰亞胺的基團的馬來酰亞胺是Y-馬來酰亞胺-丁酰酰胺(GMBA)或馬來酰亞胺丙酸(MPA)。8.如權利要求7所述的衍生物或結合物，其中反應實體直接或經連接基連接到肽上。9.如權利要求8所述的衍生物或結合物，其中含馬來酰亞胺的基團以及連接基選自與AEA，EDA或AEEA的兩個或者多個的組合連接的(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)-MPA、乙二胺(EDA)-MPA、[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)-MPA和MPA。10.如權利要求8所述的衍生物或結合物，其中的連接基選自直鏈或支鏈C卜w烷基；部分氟化或過氟化的直鏈或支鏈(V1Q烷基；C卜1Q烷基或氟烷基，其中一個或多個碳原子被0或S取代以形成醚或硫醚；o-、m-或p-二取代苯基，其中取代基相同或不同，并且為CH20、S、NH、NR，其中R為H、(V1Q烷基或C卜w酰基；或二取代雜環，如呋喃、噻吩、吡喃、唑或噻唑。11.如權利要求1至10任一項所述的衍生物或結合物，其中GRF序列選自Tyr_(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_(D)Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2;Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N_Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Asn_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2;Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N_Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Leu—Ser—Arg—Lys—CONI^;His-(D)ala_Asp_Gly_Met_Phe_Asn_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Ala_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Tyr_Leu_His_Ser_Leu_Met_Ala_Lys_CONH2;禾口His-(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Leu_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-AlEi-Lys-COM^;每個GRF序列在N末端或C末端任選含有賴氨酸殘基并且其中的反應實體是含馬來酰亞胺的基團。12.如權利要求11所述的衍生物或結合物，其中的GRF序列在C末端含有添加的賴氨酸殘基。13.如權利要求12所述的衍生物或結合物，其中的衍生物選自Tyr_(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_Lys(MPA)_C0NH2;禾口Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(AEEA-MPA)_C0NH2。14.含有權利要求l，3-5或7-13任一項所述的衍生物連同可藥用載體的藥物組合物。15.含有權利要求2-4或6-13任一項所述的結合物連同可藥用載體的藥物組合物。16.權利要求14或15所述的組合物在制備用于促進受試者內源性產生或釋放GH的藥物中的應用。17.如權利要求14或15所述的組合物在制備用于治療或預防由GH產生異常導致的疾病或癥狀的藥物中的應用。18.用于延長具有生長激素釋放活性的肽的體內半衰期的離體方法，該方法包括將權利要求l，3-5或7-13任一項所述的衍生物與人白蛋白共價結合。全文摘要文檔編號A61K38/00GK101696240SQ20091016348公開日2010年4月21日申請日期2002年2月1日優先權日2001年2月2日發明者多米尼克·P·布賴頓,尼賽布·布杰拉布,科琳·邦蓋,羅杰·萊杰,露西·熱泰,馬丁·羅比塔耶申請人:康久化學生物技術公司;