肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途的制作方法

專利名稱：肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥 物纟且合物的用途，以及涉及一種藥物組合物。
背景技術：
至今，在預防和治療中用于抑制或阻止炎性反應的物質，即所謂 的免疫抑制劑，主要包括兩類不同的物質。第一類是天然存在于體內 的激素衍生物，即可的松，和第二類是外源性免疫抑制劑，如環孢菌 素和其衍生物、硫唑嘌呤、環磷酰胺等。所有這些物質都具有抗炎作 用，但是，在長時間治療中，這些物質表現出很大的副作用。這些副 作用限制了長期治療的作用，這就是為了將副作用降低到可容忍的水 平或者為了能夠實際進行治療交替或聯合應用這些物質的原因。作為 副作用的例子可提及，與可的松有關的病理性骨折，這種骨折是由于 可的松的骨質疏松作用引起的，或者可能由于環孢菌素引起的腎衰 竭。這些副作用對這兩類化合物來說是必然的，因此，問題只是治療 的持續時間和必須停止治療時的總劑量。
本發明的目的是提供新的藥物產品，所述產品適用于阻止或抑制 炎性作用并只具有較小的副作用。另一個目的在于提供長期治療。

發明內容
下面，本發明的肽的氨基酸用常用的縮寫表示，這些氨基酸是a-氨基酸。
"類似物，，是指一種肽，是由血纖蛋白的序列，特別是由優選的 序列，通過衍生化、取代，優選同源取代、缺失和/或插入而衍生的。本發明提供具有通式I (SEQ ID NO 1、 2)肽或蛋白質
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中R!和R2相同或不同，表示氫、具有1 - 3個，特別是至多10個
碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，
Zi表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，
Z2表示精氨酸殘基、包含起始精氨酸殘基的，特別是包含2-30個氨 基酸的肽殘基或者蛋白質殘基，
及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其 它的物質的混合物，其中特別是只存在L-氨基酸，用于在人和/或獸 醫學中治療性和/或預防性地應用。
完全出人意料的是，所定義的氨基酸序列阻止血流中的細胞在血
本發明提供具有通式II (SEQ ID NO 3-IO)肽或者蛋白質
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中R!和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個，特別是至多10個
碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，
Z,表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，
Arg表示精氨酸殘基
Z3表示脯氨酸殘基或纈氨酸殘基，
Z4表示亮氨酸殘基或者纈氨酸殘基，
Zs表示蛋白質殘基或者肽殘基，特別是包含2- 30個氨基酸的肽殘基 或者蛋白質殘基，
或者含有l-3，特別是至多IO個碳原子的醇基團，
或者有機或無才幾堿基團，
及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的物質的混合物，其中特別是只存在L-氨基酸，用于在人和/或獸醫學 中治療性和/或預防性地應用。
完全令人驚奇的是，血纖蛋白原的部分序列、肽或者片段具有抗 炎作用。不受限于與此相關的理論思考，這種作用可能基于血纖蛋白 通過其Bp鏈的neo-N-末端結合到內皮細胞上和通過Aa-鏈的序列與 血流中的細胞結合，由此導致細胞的粘附和向組織中移居。這些化合 物具有副作用并且抑制血纖蛋白形成。但是這種抑制不構成對病人的 潛在危害，因為在不存在血纖蛋白情況下，如果發生輕微的受傷，血 液凝結也是足夠的。只是在外科手術時，可能適合的是停止這種治療。 其它的副作用基本上可以排除，因為這些物質只與天然配體相互作 用。此外，血液中的白細胞不會對天然防御產生相反的影響。這樣， 其組成，例如粒細胞、淋巴細胞和單核細胞保持不受影響，因此，天 然的防御過程保持不變并且血液中對感染的抵御保持不變。
血纖蛋白原在肝臟中形成并且這種形式是生物無活性的，其在血 液中的濃度一般為約3g/1。通過酶原凝血酶原的蛋白水解裂解作用 生成凝血酶，它從血纖蛋白原上裂解掉血纖肽A和B。由此血纖蛋白 原被轉化成其生物活性的形式，生成血纖蛋白和血纖蛋白裂解產物。
在每一次的血液凝結活化過程中，即每次組織受傷、發生炎癥、 夕卜傷或者變性發生(degenerativer Genese)時生成凝血酶，通過血纖 蛋白的調節生成凝血酶是一個主要的保護過程，目的是盡快愈合任何 血管系統的缺損。但是，血纖蛋白的生成也是一個致病過程。血纖蛋 白血栓的形成作為要解決的引起心肌梗塞的起因是人類醫學的最重 要的問題之一。
至今還沒有或者還沒有充分研究血纖蛋白在炎性細胞從血流到 組織的外滲過程中起的作用，這一方面是抵御致病性微生物或存在于 組織中的腫瘤細胞的希望的過程，但是，另一方面，其本身是一個引 起自身組織損傷或者繼續損傷的過程。血纖蛋白借助于序列Bf3，通 過其BP的neo-N-末端結合內皮細胞并且借助于序列Aa結合血流中的 細胞，因此導致細胞的粘附和向組織中移居。
本發明的肽或者蛋白質可以抑制血流中的細胞與血管壁的內皮 細胞的粘附和/或抑制隨后細胞從血液向組織中的移居。
通式II的本發明的肽或者或者蛋白質，其中Zs表示具有下述氨基酸序列(SEQ ID NO 11)的肽殘基:
Asp Lys Ly's Arg GIu'' 'Glu Ala Pro Ser Leu Arg' Pro'-'Ala Pro Pro Pro lie Ser Gly Gly Gly Tyr Arg
和
z,表示組氨酸殘基，
Arg表示精氨酸殘基，
Z3表示脯氨酸殘基，
Z4表示亮氨酸殘基，
抑制血纖蛋白片段在血管壁上的沉積和粘附。因此，它使炎性細胞不 能牢固地停留在動脈和靜脈血管壁的內皮細胞上，并且阻止了這類細 胞停留在血管壁上，因此阻止了向組織中的進一步滲透。
通式II的肽或者蛋白質，其中Zs表示具有下述氨基酸序列(SEQ ID NO 12)的肽殘基
Glu Arg His Gin S.er Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp .Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys
并且Zi表示脯氨酸殘基， Arg表示精氨酸殘基， Z3表示纈氨酸殘基， Z4表示纈氨酸殘基，
具有抑制周圍血液的細胞與血纖蛋白或者血纖蛋白片段的粘附的作 用，因此抑制其向組織中的遷移。
所述裂解產物在文獻中已知為肽Bp和肽Aa。上述提及的預粘附 和預遷移途徑對于控制細胞從血液向組織中遷移的體系完全是新的。 血纖蛋白的這一功能既可以被肽Bp，也可以被肽Aa阻斷。
因此，本發明的肽適合用作治療劑用于人類或動物，以阻斷細胞 從血液向組織中的遷移。由于血纖蛋白或者通過蛋白水解裂解產生的 血纖蛋白原的其它產物，例如被尿激酶-血纖蛋白溶酶原-激活劑裂解 的血纖蛋白原，僅特異性和區域性地有限產生，即在炎性、凝結失調、 動脈硬化、血栓形成和/或肺瘤生長位點，對此的所述治療劑的作用是區域性受限的，即希望不在其它區域發生病理性副作用或者僅在有 限的程度上發生。
于制備在身體發生感染的情況下治療或預防局部和/或全身性炎癥的 藥物組合物，所述感染基于自主免疫反應、基于風濕性疾病、基于免 疫系統紊亂、基于遺傳疾病，用于預防和/或治療器官移植之后發生 的排異反應、動脈硬化、輸注損傷、基于動脈硬化和/或血栓疾病和
血纖蛋白沉積增加。這類肽，特別是Bp，也特別適合用于制備將其 它藥物遞送到人或動物內皮細胞的藥物組合物。對此，將要遞送的藥 物偶聯到所述肽的一端，然后通過VE-鉤粘著蛋白沉積到血管壁的游 離位點上，即內皮細胞上。
具體實施例方式
下面通過實施例進一步說明本發明。 實施例1:血纖蛋白原裂解產物的制備
血纖蛋白原的非聚合的降解產物是按照Blomback等人(Nature 1968， 218; 130-134)通過用溴化氰分解得到的。如此裂解得到的血 纖蛋白原主要由63 kD的片段，即N-末端二石克橋連接，NDSK組成， 并且包含Aa鏈1-51、B(3鏈1-118和y鏈1-78。為了得到NDSK-II (NDSK 減去血纖肽A和B)，在室溫下3小時用凝血酶(20單位/1 pg NDSK) 將Aa和Bp鏈的N-末端的氨基酸裂解掉，然后用氟磷酸二異丙酯處 理以阻斷凝血酶的活性。如此得到的NDSK-II由Aa鏈17-51、 Bp鏈 15-118和y鏈1-78組成。
為了4尋到NDSK—uPA，在37。C下用Technoclone/>司，奧;也矛J維 也納，的200單位尿激酶-血纖蛋白溶酶原-激活劑(uPA)處理500 pg NDSK 1小時。該反應用5 mM苯基曱基磺酰氟終止。如此得到的 NDSK-uPA是一種NDSK并且不具有血纖肽B。
作為陰性對照，從用溴化氰處理生成的血纖蛋白原裂解產物得到 的第二級分，按照Nie畫nhuizen等 (Biochem Biophys Acta 1983， 755;531-533)稱為FCB-2。 FCB-2是43 kD大小的蛋白質并且由Aa 鏈148-208、 Bp鏈191-305和"/鏈95-265組成。為了對照，向這種 蛋白質中加入凝血酶和氟磷酸二異丙酯。但是，不導致所述蛋白質的任何變化(在此后稱為FCB-2-thr )。
對于其它的陰性對照，將培養基(Life techn. Inc.公司，PaiskyUK的RPMI)用凝血酶如上述處理并且隨后滅活(RPMI-thr)或者用uPA按上述處理并且滅活(RPMI-uPA)。
實施例2:
肽Aa (SEQ ID NO 12)相應于血纖蛋白a鏈的氨基酸1 - 28并且與血纖蛋白原Aa鏈序列的氨基酸17-45相同
Gy Pro Arg Val Val Glu Arg His Gn Ser Ala Cys LysAsp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp AsnTyr Lys
肽B|3 (SEQ ID NO ll)相應于血纖蛋白卩鏈序列的氨基酸1-28，其與血纖蛋白原Bp鏈序列的氨基酸15-43相同，其具有下述序列
Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala ProSer Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro lie Ser Gy Gy GyTyr Arg
按照Merrifield R. B. ， J. Amer. Chem. Soc. 1963; 85，2149-2154,用多功能肽合成器，按照Carpino L. A.和Han. G Y， J.Amer. Chem. Soc. 1981; 37; 3404-3409應用藥基甲氧基羰基(FMOC)-保護基策略通過固相肽合成合成兩種肽。粗品肽的純化通過制備反相HPLC，用Nucleosil 100-10, C18柱，按照Engelhart H.和Miil lerH.的Chromatography 1984 19: 77以及Henschen A. ， Hupe K. P.和Lottspeich F. High Performance Liquid Chromatography VCH1985進行。用相同長度，但具有無規氨基酸序列的肽作為對照肽。
實施例3: HU-SCID小鼠模型
將人的皮膚移植到SCID小鼠的背部，在兩周后將人淋巴細胞注射到腹膜內。這一過程按照Petzelba雨等(J. Invest. Dermatol.1996, 107; 576-581)的方法進行。然后，將15只這樣準備的小鼠通過其尾靜脈注射:
a)100網人類而k-ii
b)100人類FCB-2
c)100欣 Aa
d)100肽Bp
e)100無^見的Aa
f)100無規的B卩
24小時后，取下人類皮膚并評價炎性位點的數量，用細胞數/O. 3mm'表示，并且測定帶有標準偏差的平均值。
對于a:22 +/2. 8
對于b9 +/-2.1
對于c4 +/-1.1
對于d6 +/-1.1
對于e5 +/-1.2
對于f7 +/-1.3
由此可推出，NDSK-II引起炎癥，因此，所述蛋白質^皮用作致病物質。其它化合物本身沒有表現出炎性細胞量的任何明顯的增加。
比較例4:
按照實施例3通過其尾靜脈給15只小鼠注射100 ng人NDSK-II和100 pg無規的肽Aa。
按照實施例3繼續實施，可測得23 +/- 3. 5個炎性位點/O. 3 mm2。比較例5:
按照實施例3通過其尾靜脈給15只小鼠注射100 pg按照實施例1的人NDSK-II和100 pg無關見的肽Bp。
按照實施例3繼續實施，可測得24 +/- 2個炎性位點/0. 3 mm2。
實施例6:
按照實施例3給15只小鼠注射100 jag人NDSK-II和100 合成的肽Aa。
按照實施例3繼續實施，可測得21 +/- 2. 2個炎性位點/0. 3 mm2。實施例7:
按照實施例3通過其尾靜脈給15只小鼠注射100 人NDSK-II和100 合成的肽Bp。
按照實施例3繼續實施，可測得14 +/- 2炎性位點/0. 3 mm2。實施例4-7表明，肽Bp阻斷淋巴細胞的炎癥。
比較例8:
用紅色熒光染料(Cell Tracker Orange, 1 |ig/ml， MolecularProbes, Eugene, OR)標記人類的臍靜脈內皮細胞(HUVEC)并且接種到股原基質(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)上。在內皮細胞融合后，重疊用綠熒光染料(Cell Tracker Green， 1Molecular Probes公司，Eugene, Or igon)標記的夕卜周血單核細胞(PBMC) (105個細胞/25 mm2)。此后，在37°C溫育細胞12小時。
用激光掃描顯微鏡給粘附的進入凝膠的細胞照相，并轉換成圖像(Pixel)并且用"NIH image"按照Gr6ger等(J. Immunol. Method1999; 222: 101-109)進行評價。
每0. 1 mi^的粘附的細胞的數量可例如按在"粘附"下提及的方法進行測定。每0.04 mm3遷入的細胞的數量可例如按照在"遷移"下提及的方法測定。測定具有標準偏差的三次的平均值。粘附 遷移
a) RPMI-uPA0,140+ /-44+ /-3
1,038+ /-25+ /-2
1 0,0(ig/ml32+ /-45+ /-1
b) NDSKo,ipg/ml3 1+ /-1 86+ /-
1,0pg/ml35+ /-1 S+ /-2
i o;opg/ml36+ /-246+ /-3
c) NDSK-II0,1fag/ml55+ /-2 1I 2+ /-5
I，O67+ /-3 I19+ /-
10,0(ig/ml65+ /-3 119+ /-10
d) NDSK-uPA0,1jig/ml58+ /-10+ /-
1,060+ /-3,514+ /-
10,0jig/ml65+ /-31 8+ /-〗.
e) FCB2o,ifig/ml30+ /-266+ /-/j
1,010+ /-103+ /-2
10,0lig/ml21+ /-75+ /-4
f) FCB-2-thr0,1pg/ml20+ /-126+ /-5
i,ofig/ml23+ /-13 7+ /-
I 0,0pg/ml26+ /-1 I4+ /-
g) RPMI-thr0,1(ig/ml29+ /-154+ /-5
1,0Hg/ml26+ /-145+ /-5
10,0jig/ml41+ /-205+/-4
由此可以得出，NDSK-II導致外周血單核細胞(PBMC)的明顯遷移比NDSK-uPA程度大，并且因此具有致病活性。對照a)、 b) 、 e) 、 f)和g)均不導致明顯的遷移。
實施例9:
將100 pg NDSK-ll和Bp或者無規的B(3加到按照實施例8的含有 PBMC懸浮液的膠原基質中，并按照實施例8繼續進行。
粘附遷移
a)不加NDSK-II38+/-156 +/-4
b)僅100 pg NDSK-II73+/-2916 +/--7
c)10 pg Bp + NDSK-II63+ /-337 +/-4
d)100 Bp + NDSK-II47+/-345 +/-4
e)1000 Bp + NDSK-II52+/-2710 +/-.6
f)10 無*見的Bp + NDSK—II77+/-3316 +/-6
g)100 |ug無關見的Bp + NDSK-II86+/-3515 +/-6
h)1000 無*見的Bp + NDSK-II78+/—3113 +/-8
從這些試驗結果中可以得出，肽Bp阻斷炎癥。 實施例10:
將100 NDSK-ll和Aa或者無規的Aa加到按照實施例8的含 有PBMC懸浮液的膠原基質中，并按照實施例8繼續進行。
粘附 遷移
a)不力口而K-II42+/-610+/-1
b)僅NDSK-II96+/-1124+/-3
c)10 Aa + NDSK-II69+/-1221+/-4
d)100 Aa + NDSK-II73+/-1315+/-6
e)1000 Aa + NDSK-II70+/-613+/-5
f)10 |ug無關見的Aa + NDSK—II70+/-625+/-2
g)100 無規的Aa + NDSK-II65+/-1624+/-3
h)1000 |ag無規的Aa + NDSK-II70+/-1226+/—3從這些試驗結果中可以得出，肽Aa只是部分地阻斷PBMC的遷移。 實施例11:
由于PBMC主要由淋巴細胞和單核細胞的混合物構成，所以在實 施例11中用純的'淋巴細胞代替PBMC(如在實施例8-10中)。
分別將100 pg NDSK-uPA或100 pg NDSK-II和Aa或B卩加到按 照實施例8的含有內皮細胞和淋巴細胞的膠原基質中。
粘附遷移
a)不力口68 +/-816+/_3
b)NDSK-uPA143 +/--1153+/_
c)NDSK-II119 +/--1143+/-4
d)僅100 Bp58 +/-1814+/-1
e)NDSK-uPA + 100 Bp74 +/-819+ /_2
f)NDSK-II + 100 ng B(374 +/-817+/-3
g)僅100 Aa77 +/-418+/-1
h)NDSK-uPA + 100 jig Aa131 +/-.440+/-3
i)NDSK-II + 100 ng Aa131 +/-'444+/-4
j)僅100 g無規的B卩75 +/-19+/_1
k)NDSK-uPA + 100 無規的Bp134 +/-.1346+/-4
1)NDSK-II + 100 無頭見的B(3120 +/-.1242+/—4
這些試驗結果表明
1) NDSK-II和NDSK-uPA都促進、淋巴細胞的炎癥，
2) 肽B(3完全阻斷由NDSK-11和NDSK-uPA誘導的淋巴細胞粘附 和遷移，而肽Aa不具有阻斷活性，這表明自由的a鏈對誘導淋巴細 胞的粘附和遷移不是需要的。
實施例12:
按照實施例ll進行操作，但是替代淋巴細胞應用純的單核細胞。 分別將100 NDSK-uPA或100 NDSK-II加到肽Aa、無規的Aa、 BP或者無規的Bp中。
15粘附遷移
a)不力口43+/-87 +/-1
b)NDSK-uPA48+/-1010 +/--2
c)NDSK-II90+/-1119 +/--6
d)100 (ig Bp59+/-75 +/_1
e)NDSK-uPA + 100 Bp61+/-118 +/-3
f)NDSK-II + 100 Bp70+/_77 +/-
g)100 無規的Bp40+/-76 +/-1
h)NDSK-uPA +100 無規的Bp45+/-8 +/-3
i)NDSK-II + 100 ng無去見的B(392+/-1020 +/--7
j)100 Aa59+/-65 +/-1
k)NDSK-uPA + 100 jag Aa62+/_48 +/-
1)NDSK-II + 100 ng Aa68+/-109 +/-6
m)100 g無規的Aa58+/-76 +/-1
n)NDSK-uPA + 100 jig無規的Aa50+/-1010 +/-■ 4
0)NDSK-II + 100 無規的Aa108:+/--821 +/-.5
這些試驗結果表明，僅NDSK-II并且不是NDSK-uPA促進單核細 胞的遷移，即a鏈和P鏈必須具有一個游離的N-末端并阻斷單核細胞 的遷移。
實施例13:
按照實施例11的步驟進行，應用純的淋巴細胞。分別將100 NDSK—uPA或100 NDSK—II力口至'J4汙生于Act Gly Pro Arg (Pro)—NH2 乙酸鹽(Aa-衍生物)或者衍生于Bp Gly His Arg Pro-OH乙酸鹽(B(3-衍生物)的短肽的鹽中。
粘附 遷移
a) 不力口 60 +/— 8 14 +/- 1
b) NDSK-uPA 149 +/- 12 57 +/- 5
c) 鵬K-II 121 +/— 11 48 +/— 7d)僅100 |Lig Bp-書f生物58 +/-1012+/-9
e)NDSK-uPA + 100 Bp-衍生物70 +/-816+/-3
f)NDSK-II + 100 Bp-衍生物69 +/-714+/-
g)僅100 Aoc-Ut生物77 +/-418+/-1
h)NDSK-uPA +100 Act-4汙生物134 +/--448+/-5
i)NDSK-II + 100 Aoc-衍生物131 +/--749+ /-6
j)僅100 無規的Bp-衍生物70 +/-14+/-了
k)NDSK-uPA + 100 jig無規的Bp-書t生物130 +/--1249+/-6
1)NDSK-II + 100 |ag無規的Bp-衍生物120 +/--1055+/—8
由這些試驗得出，如杲淋巴細胞遷移^^抑制，這些以適當方式連 續加入的短鏈肽與長鏈肽具有相同的活性。
實施例14:
按照實施例12進行操作，應用純的單核細胞。分別將100 NDSK—uPA或100 NDSK—II力口至ij書亍生于Act Gly Pro Arg (Pro)-NH2 乙酸鹽(Aa-衍生物)或者衍生于Bp Gly His Arg Pro-OH乙酸鹽(Bp-衍生物)的短肽的鹽中。
粘附遷移
a)不力口40+/-85 +/-1
b)NDSK-uPA54+/-97 +/-2
c)NDSK-II85+/-1122 +/-匿6
d)100 jxg Bp-纟汙生物52+/-76 +/-1
e)NDSK-uPA + 100 B(3-衍生物61+/-118 +/-3
f)NDSK—II + 100 jig B|3—汙生物68+/-78 +/-4
g)100 ng無規的Bp-衍生物40+/-76 +/-1
h)NDSK-uPA + 100 無規的Bp-衍生物44+/-68 +/-2
i)NDSK-II + 100 無規的B(3-衍生物92+/-1023 +/--7
j)100 pg Aoc-4汙生物50+/-4 +/-4
k)NDSK-uPA + 100 Aa-4汙生物60+/-7 +/-6
1)NDSK-II + 100 Aa-書亍生物64+/—118 +/—2m) 100 ng無規的Act-衍生物 54 +/- 1 06 +/- 3
n) NDSK—uPA + 100 無規的Aa-衍生物 5 0 +/- 10 10 +/- 4 o) NDSK-II + 100 無規的Aa-4汙生物99 +/- 8 21 +/- 7
由這些試驗得出，如果單核細胞遷移被抑制，這些以適當方式連 續加入的短鏈肽與長鏈肽具有相同的活性。
實施例15:
該試驗用220 g- 280 g重的雄性Wistar大鼠進行。給這些大鼠 提供標準的食物和水。為了進行該試驗，將大鼠麻醉并進行頻率為 70次/分鐘的人工呼吸，其中通過1 mm-2 mm水銀的超壓按照每千 克8 ml - 10 ml給予含有30體積％氧氣的氣體。給右心動脈安裝測
量插管并測定該動脈的血壓和心率。測定壓力比率，作為該動脈中的 血壓和心率的乘積，其量綱為mm水銀/分鐘/103。在右側的靜脈安裝 測量插管用于施加測試物質。在進行外科處理后，向大鼠心臟提供2 ml大鼠血液。30分鐘后，將左側的心動脈閉合。再過25分鐘將閉合 +>開，以給缺血區域供血。在此刻，給半數動物靜脈施用800 ng/kg 的肽B(3或無規的肽B|3，然后等待2小時。
然后，為了區分受損的和未受損的心肌組織，給左側心臟動脈提 供濃度為2重量％的evans藍染料。然后將取下的心臟水平切片成 5部分，去除右靜脈壁并用氯化三苯基tetratol(l重量％)在37°C 處理這些切片20分鐘，以區分正常組織和梗塞的組織。用電腦控制 的面積法評價這些切片。
由于血管閉合，對照大鼠心臟中心肌的62. 5 %受到威脅，而在 試驗大鼠心臟中為60%。在對照大鼠心臟中受到威脅的組織的46 %壞死，相反在試驗大鼠心臟中只有29%。這相當于壞死組織降低 了 37% (p < 0. 05)。
按照本發明的物質以及按照本發明的物質的用于制備藥物組合 物的用途具有特別的意義
用于治療由自主反應的淋巴細胞的組織破壞作用引起的疾病中 <吏用的藥物組合物。
屬于這類的疾病的是自身免疫領域的疾病，例如膠原性疾病、風濕病、牛皮癬和感染后/副感染疾病和由移植物與宿主反應引起的疾 病。產生治愈效果，因為這些藥物組合物阻斷淋巴細胞遷移到組織中。 因此，這些淋巴細胞停留在血液中并且不能產生自主反應性組織破壞 作用。
在治療和/或預防器官移植后發生排斥時這些藥物產生治愈效 果，因為這些藥物阻止淋巴細胞從血液向外來器官中遷移，因此，外 來器官不能被自主反應性淋巴細胞破壞。
在治療和/或預防器官移植后的動脈硬化時這些藥物產生治愈效 果，因為這些藥物抑制淋巴細胞和單核細胞向血管壁中的遷移，因此， 阻止了血管壁中細胞的活化。對此，將器官移植后動脈硬化發生率最 小化或者被阻止。
在治療和/或預防術后再灌注損傷或者藥物引起的血流恢復，例 如心肌梗塞后、中風后、血管手術后、分流術和器官移植后的血流恢 復時這些藥物產生治愈效果，因為這些藥物抑制淋巴細胞和單核細胞 向血管壁中遷移。再灌注損傷是由于血流恢復過程中存在的血管細胞 由于缺氧/酸中毒引起的并導致其活化。因此，淋巴細胞和單核細胞 粘附到血管壁上并向其中遷移。淋巴細胞和單核細胞在血管壁上的粘 附和向血管壁中的遷移被抑制的事實降低了缺氧/酸中毒引起的損 傷，不會由于隨后的炎性反應引起任何永久性血管損傷。
在治療和/或預防代謝疾病或老化過程之后的動脈硬化時，這些 藥物產生治愈效果，因為這些藥物抑制淋巴細胞和單核細胞向血管壁 中的遷移，因此，抑制了由此引起的動脈硬化斑的進展。
也可以用本發明的藥物組合物轉運另一種藥物物質。按照本發明
的藥物組合物特異性結合到內皮細胞的表面分子。因此，與其偶聯的 藥物物質可以高濃度與內皮細胞接觸，而使它們不會在其它位置引發 副作用。作為實例可提及應用抑制細胞分裂的物質，這些物質被特異 性地引導到內皮細胞之后發揮其抗血管生成作用。在這種情況下對肺 瘤患者有治療作用，因為通過抑制內皮細胞的增殖和因此通過避免新 血管生成而阻斷了腫瘤的生長。序列表
〈110> FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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<170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4. 0, Office 97 〈210〉 1 〈211〉 32 〈212〉肽
〈400〉 Gly His Arg Xaa2 Xaa29〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
<120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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〈150〉 AT 2063/2000 〈151〉 2000 12 12 〈160〉 12
〈170> Microsoft Windows NT， Workstation 4. 0， Office 97 〈210〉 2 〈211〉 32 〈212〉肽
<400〉 Gly Pro Arg Xaa2 Xaa29〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
〈130〉 〈140〉 <141>
〈150〉 AT 2063/2000 〈151〉 2000 12 12 <160> 12
〈170〉 Microsoft Windows NT, Workstation 4.0， Office 97 〈210〉 3 〈211〉 7 to 35 〈212〉肽
〈400〉 Gly His Arg Pro Val Xaa2 Xaa30序列表
〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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〈211〉 7 to 32 〈212〉肽
〈400〉 Gly His Arg Val Val Xaa2 Xaa30說明書第20/27頁
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〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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〈170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4.0， Office 97 〈210〉 5 〈211〉 7 to 35 〈212〉肽
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〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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〈170〉 Microsoft Windows NT, Workstation 4.0， Office 97 <210> 6 〈211〉 7 to 35 〈212〉肽
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〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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〈170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4. 0， Office 97 〈210〉 7 〈211〉 7 to 35 〈212〉肽
〈400〉 Gly Pro Arg Pro Leu Xaa2 Xaa30序列表
〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
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〈150〉 AT 2063/2000〈151〉 2000 12 12〈160〉 12
〈170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4.0， Office 97〈210〉 8〈211〉 7 to 35〈212〉肽
〈400〉 Gly His Arg Pro Leu序列表
〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
〈130〉〈140>〈141>
〈150〉 AT 2063/2000〈151〉 2000 12 12〈160〉 12
<170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4. 0， Office 97〈210〉 9<211〉 7 to 35〈212〉肽
〈400〉 Gly Pro Arg Val Leu Xaa2 Xaa30〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
〈130〉〈140〉〈141〉
〈150〉 AT 2063/2000
〈151〉 2000 12 12
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〈170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4.0， Office 97
〈210〉 10
〈211〉 7 to 35〈212〉肽
〈400〉 Gly His Arg Val Leu Xaa2 Xaa30說明書第26/27頁
序列表
〈110> F工BREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
〈130〉〈140〉〈141〉
〈150> AT 2063/2000〈151〉 2000 12 12〈160〉 12
〈170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4.0， Office 97〈210〉 11〈211〉 28〈212〉肽
〈400〉 Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu GluAla Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro lieSer Gly Gly Gly Tyr Arg〈110〉 FIBREX醫學研究和發展公司/Petzelbauer Peter
〈120〉肽和/或蛋白質及其用于制備治療性和/或預防性藥物組合物的用途
〈130〉 〈140〉 〈141〉
〈150〉 AT 2063/2000 〈151〉 2000 12 12 〈160〉 12
〈170〉 Microsoft Windows NT， Workstation 4. 0， Office 97 〈210〉 12 〈211〉 28 〈212〉肽
〈400〉 Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gin Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys
權利要求
1.通式I(SEQ ID NO 1、2)的肽或蛋白質其中R1和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個，特別是至多10個碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Z1表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，Z2表示精氨酸殘基、包含起始精氨酸殘基的，特別是包含2-30個氨基酸的肽殘基或者蛋白質殘基，及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的用于人和/或獸醫學中的用于治療性和/或預防性應用的物質的混合物。
2.按照權利要求1的具有通式II (SEQ ID NO 3 -IO)的肽或 者蛋白質<formula>formula see original document page 2</formula>其中l和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個，特別是至多10個碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Zi表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，Arg表示精氨酸殘基Z3表示脯氨酸殘基或纈氨酸殘基，Z4表示亮氨酸殘基或者纈氨酸殘基，Z5表示蛋白質殘基或者肽殘基，特別是包含2 - 30個氨基酸的肽殘基 或者蛋白質殘基，或者含有l-3，特別是至多IO個碳原子的醇基團，或者有機或無機堿基團，及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的 用于人和/或獸醫學中的用于治療性和/或預防性應用的物質的混合 物。
3. 按照權利要求2的肽或者蛋白質，其中Zs是衍生于血纖蛋白 Aa-鏈的肽殘基。
4. 按照權利要求2的肽或者蛋白質，其中Zs是衍生于血纖蛋白 Bp-鏈的肽殘基。
5. 按照權利要求2通式II的肽或者蛋白質，其中Zs是具有下述 氨基酸序列(SEQ ID NO ll)的肽殘基Asp Lys Lys Arg Gu Glu Ala ProSer Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro lie Ser GIy Gly Gly Tyr Arg并且Z,表示組氨酸殘基， Arg表示精氨酸殘基， Z3表示脯氨酸殘基， Z4表示亮氨酸殘基。
6. 按照權利要求2的通式II的肽或者蛋白質，其中Z5是具有下 述氨基酸序列(SEQ ID NO 12)的肽殘基Glu Arg His Gin Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys并且Zi表示脯氨酸殘基， Arg表示精氨酸殘基， Z3表示纈氨酸殘基， Z^表示纈氨酸殘基。
7. 按照權利要求1-6任一項的肽和/或蛋白質用于制備治療感染引起的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
8. 按照權利要求1-7任一項的肽和/或蛋白質用于制備治療基于自身免疫反應的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
9. 按照權利要求1 - 8任一項的肽和/或蛋白質用于制備治療基于風濕病的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
10. 按照權利要求l-9任一項的肽和/或蛋白質用于制備治療基于免疫系統紊亂的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
11. 按照權利要求1 - 10任一項的肽和/或蛋白質用于制備治療基于遺傳疾病的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
12. 按照權利要求1-11任一項的肽和/或蛋白質用于制備預防和/或治療器官移植后發生的排斥反應、動脈硬化、再灌注損傷、動脈硬化疾病和/或在衰老過程中血纖蛋白沉積增多的藥物組合物的用途。
13. 按照權利要求1 - 12任一項的肽和/或蛋白質用于制備預防和/或治療器官移植后動脈硬化的藥物組合物的用途。
14. 按照權利要求1 - 13任一項的肽和/或蛋白質用于制備預防和/或治療再灌注損傷的藥物組合物的用途。
15. 按照權利要求1 - 14任一項的肽和/或蛋白質用于制備預防和/或治療動脈硬化和/或血栓疾病的藥物組合物的用途。
16. 按照權利要求1-15任一項的肽和/或蛋白質用于制備預防和/或治療衰老過程中血纖蛋白沉積增多的藥物組合物的用途。
17. 按照權利要求1-16任一項的肽和/或蛋白質用于制備用于向人或動物內皮細胞遞送一種其它藥物的藥物組合物的用途。
18. —種藥物組合物，含有至少一種權利要求l-17任一項的肽和/或蛋白質。
19. 按照權利要求1 - 18任一項的藥物組合物，這些藥物組合物為適于注射的形式。
全文摘要
本發明涉及通式(I)的肽或蛋白質及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它物質的混合物用于人和/或獸醫學中治療性和/或預防性應用，其中R₁和R₂相同或不同，表示氫、具有1-3個，特別是至多10個碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Z₁表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，Z₂表示精氨酸殘基、具有起始精氨酸末端的，特別是包含2-30個氨基酸的肽殘基或者蛋白質殘基。
文檔編號A61P37/00GK101676299SQ20091016355
公開日2010年3月24日 申請日期2001年12月7日 優先權日2000年12月12日
發明者P·佩策爾保爾 申請人:菲布雷克斯醫療研究及開發有限責任公司