^99mTc標記肼基煙酰胺基-葉酸配合物的制備方法及應用的制作方法

專利名稱：^99mTc標記肼基煙酰胺基-葉酸配合物的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及"mTc標記的放射性藥物化學和臨床核醫學技術領域，具體說是涉及到 一種99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物的制備方法及應用。
背景技術：
在醫學放射性藥物化學技術領域中，葉酸(NHHN-Folate)受體是一種通過聚糖磷 酯酰肌醇連接在細胞膜上的糖蛋白。葉酸受體在正常健康細胞中的表達高度保守，但是在 許多源于上皮組織的惡性腫瘤，如卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、肺癌、鼻咽癌等腫瘤中卻有 高度表達。葉酸受體對葉酸、甲氨蝶呤、5_甲基四氫葉酸等葉酸類似物具有很高的親和性和 特異性，可介導這些物質內吞進入細胞。利用這一頗具特點的轉運過程，可以將放射性核素 或其它治療藥物與葉酸或葉酸類似物偶聯，通過葉酸受體介導進入靶細胞。因而，葉酸受體 可以作為放射性藥物的"耙目標"，實現對葉酸受體高度表達的腫瘤的放射性核素顯像和治 療。 與單克隆抗體等其它靶向轉運體系相比，葉酸及其類似物具有親和性高、穿透能 力強、價格低廉、易于結構修飾、穩定性高等特點。因此，與葉酸及其類似物偶聯的復合藥物 成為目前靶向藥物設計研究的一個熱點。 當前用于標記葉酸受體靶向放射性藥物的核素主要有^8Ga，min，"mTc嚴Cu，及 ，，"C等。其中min-DTPA-folate(Y)是第一個進入并完成II期臨床的葉酸受體靶向腫 瘤顯像劑(Siegel BA， Dehdashti F， Mutch DG， et al. Evaluationof mIn_DTPA_folate as a receptor—targeted diagnostic agent for ovarian cancer :initialclinical results. J Nucl Med 2003 ;44 :700-707)，但是由于mIn核素來源不方便，并且價格昂 貴，阻礙了其在臨床上的進一步應用。"mTc理想的核性質使其成為核醫學中應用最廣泛 的核素，其中"mTc-EC20已經成功用于卵巢癌、宮頸癌、腎癌等臨床I期診斷試驗，II期 臨床試驗正在進行(Reddy JA， Xu LC， Parker N， Vetzel M， Leamon CP. Preclinical evaluation of 99mTc_EC20 for imaging folaterec印tor-postive tumors. J Nucl Med 2004;45:857-866)。 HYNIC(肼基煙酰胺基)作為一種雙功能連接劑，由于它所形成的配 合物有很高的穩定性和標記率，廣泛應用于"mTc標記。文獻報道99mTC-HYNIC-f0late有 好的腫瘤/血、腫瘤/肉等靶與非靶比值，但是在荷KB腫瘤小鼠模型中的腫瘤絕對攝取 值較低，并且肝臟、脾等的本底較高(W.Guo， G.H.Hinkle， R. J. Lee，99mTc-HYNIC-folate : a novelrec印tor—based targeted radiopharmaceutical for tumor imaging. J Nucl Medl999 ;40 :1563-1569 ;劉麗琴，王世真等.葉酸受體腫瘤顯像劑99mTc-肼基煙酰胺基酰 肼_葉酸的合成與動物顯像.中國醫學科學院學報.2006 ;28 :786-789中國醫學科學院學 報)。因此，研制出新型的99mTc標記肼基煙酰胺基_葉酸配合物用于腫瘤顯像劑，具有重要 的意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種具有高腫瘤攝取、放射化學純度高、穩定性好，應用在
腫瘤顯像領域的"mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物，同時也提供其制備方法。 為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案， 一種"mTc標記的肼基煙酰胺
基-葉酸配合物，表達式為"mTc-HYNIC-NHHN-Folate，其結構式為<formula>formula see original document page 4</formula> 該結構式中配體HYNIC-NHHN-Folate (肼基煙酰胺基 一 葉酸)分子中肼基 的氮原子、共配體Tricine和TPPTS分子中的氧原子與磷原子與99mTc進行配位得到 99mTc-HYNIC-NHHN-Folate配合物。 99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物的制備方法如下
a.配體肼基煙酰胺基 一 葉酸(HYNIC-NHHN-Folate)的合成
將化合物葉酸(NHHN-Folate)和琥珀酰亞胺_6_叔丁基氧羰基肼基吡啶_3_甲酸 (NHS-HYNIC-Boc)溶解在10_50mL的二甲基亞砜中，加入5_25mL吡啶，室溫反應10_24h ;將 反應后的溶液緩慢滴入乙醚中，離心收集生成橙紅色沉淀物，分別用乙醚和二氯甲烷洗滌， 真空干燥得橙紅色固體；將橙紅色固體加入l-5mL的三氟乙酸中，在氮氣保護下，冰水浴反 應2h后，旋蒸除去三氟乙酸，將剩余油狀液體用0. l-2mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后 滴入100-500mL吡啶中，離心收集產生的沉淀并用乙醚洗滌，真空干燥得到棕黃色粉末。具
體合成路線如圖l所示
<formula>formula see original document page 5</formula>
b. 99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物(99mTC-HYNIC-NHHN-F0late)的制備
在青霉素小瓶中依次加入10-100mg三羥甲基-甲基甘氨酸(Tricine) ， 20-100 ii g 氯化亞錫(SnCl2 2H20) ， 20-200 y g配體肼基煙酰胺基_葉酸和0. l-lmL、 pH = 3. 6的醋 酸鹽緩沖溶液(NaAc-HAc，O. 2mol/L)，搖勻后向其中注入37 370MBq的Tc-99m淋洗液 0. 1-0. 5mL，沸水浴加熱15min ;在標記好的溶液中加入l_5mg三苯甲基膦三磺酸鈉溶液 (TPPTS)，搖勻后沸水浴加熱5-30min，得到本發明所述99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配 合物。 通過上述方法制備的99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物室溫下體外穩定性 好，其純化后放射化學純度大于90%。荷瘤小鼠體內生物分布實驗結果表明"，c標記的 肼基煙酰胺基_葉酸配合物在腫瘤中有很高的攝取和好的滯留，有很好的腫瘤/血，腫瘤 /肌肉比值，肝臟等非靶器官攝取低，適用于臨床顯像的要求。99mTC-HYNIC-NHHN-F0late、 99mTc-EC20和99mTC-HYNIC-F0late在荷瘤小鼠體內生物分布數據對比如下表1.配合物注射4h后在荷瘤小鼠體內的生物分布
99m'
Tc陽HYNIC-NHHN-Folate
99mTc-EC20
99m
Tc-HYNIC-Folate
0.98±0.20 0.86±0.10 0.64±0.19 0.29±0.06 114.88±8.12 0.36±0.14 0.81±0.23 0.30±0.07 9.79±1.66 12.09 40.3
2.20±0.06 4.22±0.04 1.58±0.19 0.44±0.07 109.90±12.78 3.04±2.04 1.99±0.39 0.26±0.07 17.24±4.22 8.66 66.31
0.68±0.09 4.03±0.41 1.66±0.86 2.55±0.39 42.0±6.76 0.48±0.12 0.67士0.10 0.48±0.04 5.62±0.75
8.39
11.7
BALB/c (KB細胞)
BALB/c (M109細胞)BALB/c (KB細胞) 以上結果表明，與99mTc-HYNIC-Folate相比，99mTc-HYNIC-NHHN-Folate有更高的腫 瘤攝取和更好的瘤/肉、瘤/血比值；與99mTc-EC20相比，99mTc-HYNIC-NHHN-Folate雖然腫 瘤絕對攝取稍低，但是有更好的瘤/肉比值以及更低的心、肝、肺攝取，所以其作為新型^Tc 標記的葉酸受體腫瘤顯像劑具有更優良的生物分布性能，適宜推廣應用。
具體實施例方式下面通過實施例詳述本發明一種"mTc標記的肼基煙酰胺基 其結構式為
H2N
葉酸配合物
-TPPTS 99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物的制備方法如下 a.配體肼基煙酰胺基 一 葉酸(HYNIC-NHHN-Folate)的合成將520mg Folate-NHHN和532mg NHS-HYNIC-Boc溶解在25mL 二甲基亞砜中，加入
10mL吡啶，室溫反應16h。將反應后的溶液緩慢滴入500mL乙醚中，離心收集生成的橙紅色
沉淀，分別用乙醚(3X5mL)和二氯甲烷(3X5mL)洗滌，真空干燥得363mg橙紅色固體，產
率48. 8%。 其核磁氫譜CHNMR， DMS0-d6)為 S :8. 94 (s， 1H) ，8. 65 (s， 1H) ，8. 53 (s， 1H) ，8. 19(m，2H) ，7. 85(m，2H)6. 98 (m. 1H)，
心肝肺脾腎腸肉血瘤細麵體l
66.61(d， J = 8. 3Hz，2H) ，4. 48(d， J = 5. 4Hz， 2H) ， 4. 32 (m， 2H) ， 3. 1—1. 8 (m， 16H) ， 1. 42 (s， 9H); 核磁碳譜(13CNMR， DMS0-d6)為:S :174. 0， 171. 5， 166. 2， 158. 6， 155. 0， 153. 8， 150. 7， 148. 5， 147. 6， 136. 5， 130. 3， 129. 0， 128. 8， 121. 3， 115. 6， 111. 1，79. 1，54. 8， 45. 7， 30. 7， 30. 5， 28. 7， 25. 7. 其質譜數據(ESI-MS)為m/z [M+H]+計算值為775. 4，產物測得775. 1.
將72mg上述橙紅色固體加入lmL的三氟乙酸中，在氮氣保護下，冰水浴反應2h 后，旋蒸除去三氟乙酸，將剩余油狀液體用0. 5mLN， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后滴入 200mL吡啶中，離心收集產生的沉淀并用乙醚洗滌(3 X 5mL)，真空干燥得到37mg棕黃色粉 末，產率59. 7% ; 其核磁氫譜CHNMR， DMS0-d6)為 S :8. 62 (s， 1H) ， 7. 96 (br， 1H) ， 7. 78 (m， 1H) ， 7. 63 (m， 2H) ， 6. 90 (m， 1H) ， 6. 62 (d， J =7. 32， 2H) ， 4. 46 (m， 1H) ， 4. 31 (m， 2H) ， 2. 01-3. 01 (m， 10H) ， 1. 02-1. 70 (m， 8H) 核磁碳譜(13CNMR， DMS0-d6)為 S :174. 0， 171. 5， 166. 2， 158. 3， 153. 8， 150. 7， 148. 5， 147. 4， 138. 5， 130. 3， 129. 0， 128. 8， 121. 4， 115. 6， 111. 1，54. 8，45. 9，30. 7，30. 5，25. 7.其質譜數據(ESI-MS)為m/z [M+H]+計算值為675. 3，產物測得675. 2.
b. 99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物的制備 本配合物采用兩步法進行標記，在青霉素小瓶中依次加入O. 5mL Tricine溶 液(80mg/mL)，0. 02mL SnCl2溶液(2mg/mL)，0. 05mL HYNIC-NHHN-Folate溶液(lmg/mL) 和0. 5mLNaAc-HAc緩沖溶液(0. 2mol/L， pH = 3. 6)，搖勻后向其中注入Tc_99m淋洗液 0. 2mL(約lmCi)，沸水浴加熱15min。冷卻至室溫后，在標記好的溶液中加入0. 2mLTPPTS溶 液(5mg/mL)，搖勻后沸水浴加熱15min，即可得到本發明所述99mTc-HYNIC-NHHN-Folate。
經采用高效液相色譜法(HPLC)對99mTC-HYNIC-NHHN-F0late的標記物進行鑒 定及純化，ALLTECH高效液相色譜儀，Kromasi C-18反相柱(5mm， 250mmX4. 6mm) 。 HPLC 條件為A :90 % NH4HC03(0. 05mol/LpH = 7. 0)/10 % CH30H， B :100 % CH30H ;0 30min， 20 50% B ;流速lmL/min。各組分保留時間為99mTc04— :2. 8min，99mTc-Tricine :3. 5min， 99mTc-HYNIC-NHHN-Folate :8. 7min。 HPLC測定標記率為78% ，分離純化后放射化學純度大 于90%。 對99mTc-HYNIC-NHHN-Folate的性能及參數測定如下 [OO38] 1.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate脂水分配系數測定 取0. lmL純化后的標記配合物溶液加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)-正辛醇混合液中 (0. 6mL PBS和0. 7mL正辛醇)，充分振蕩3 5min后，再置于離心機中離心5min。分別取 0. lmL有機相和水相測量放射性計數，計算脂水分配系數平均值及其LogP。 (P =有機相的 放射性活度/水相的放射性活度)，測得logP = -3. 26，說明99mTC-HYNIC-NHHN-F0late是 親水性物質。 2.99mTc-HYNIC-MlHN-Folate體外穩定性測定 將純化后的標記配合物于室溫下分別放置4h，期間采用HPLC法測定標記物的放 射化學純度，觀察標記配合物的體外穩定性。實驗表明該配合物在放置4h后，放射化學純
7度仍然大于90%，表明99mTC-HYNIC-NHHN-F0late在室溫下體外穩定性好，適于臨床應用的 需要。 3.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate電荷性質測定 利用紙電泳法測定標記配合物的電荷性質。采用新華一號層析紙為支持體，電泳 液為0. 025mol/L的PBS(pH = 7. 4)。將純化后的標記配合物點樣于已備好的層析紙正中， 調節電壓至150V。電泳進行120min后關閉電源，取出層析紙條，晾干后測量標記配合物在 層析紙上的放射性分布。分別計算移向正極、負極及滯留原點組份的相對百分比值。結果 表明90%以上的放射性計數集中在正極，表明99mTC-HYNIC-NHHN-F0late為電負性物質。
4.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate的體外細胞結合性測定 在孔板中培養葉酸受體高表達的KB細胞(人口腔上皮癌細胞)，調整細胞濃度使 每孔細胞數為2X 105 4X 105。待12h細胞貼壁后，將細胞分為A、 B、 C三組，分別為總吸 收、內化和抑制組，每組三孔。A， B組加入配制好的乏葉酸培養基975 ii L， C組加入475 y L 培養基和500 ii L葉酸溶液(100 ii M) ， 37t:孵育40min后，A、B、 C組分別加入分離純化后的 標記配合物25iiL(lMBq/mL)，37t:孵育lh。將孔板從培養箱中取出后吸出培養基，A， C組 用冰凍的PBS(pH = 7. 4)沖洗三次，B組用stripping buffer (0. 15M NaCl和0. 1M HAc，pH =3)沖洗三次，收集吸出的培養基和沖洗的溶液作為水相。每孔用lmL胰蛋白酶消化細胞 并用PBS沖洗孔板，收集后轉入離心管作為固相，分別測定水相和固相放射性計數。結果表 明，此配合物與葉酸受體有很好的結合能力，細胞總結合占所加總放射性的24% ，抑制組加 入過量葉酸后，攝取受到顯著抑制，說明葉酸受體對此配合物的結合是特異性結合。
5.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在正常小鼠體內的生物分布測定
選18 20g雌性正常昆明小鼠12只，隨機分成4組，每組3只小鼠。用乏葉酸的 食物喂養小鼠一周后，從小鼠尾靜脈分別注射O. lmL純化后的標記配合物溶液(約185kBq， 放射化學純度大于90% )，于注射后不同時間將小鼠斷頸處死，取其血，心，肝，脾，肺等器 官，擦凈后稱重，并置于阱型Y探頭中測量其放射性計數，計算每克組織的放射性計數占 總注射劑量的百分數(％ ID/g)。抑制組同時注入0. lmL葉酸溶液(lmg/mL)。實驗結果見 表2。
表2.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在正常小鼠體內分布 臟器 lh 2h 2h (block) 4h 結果顯示該標記配合物在腎臟中有較高的攝取和很好的滯留，在其他組織和器官 中的攝取都較低，這是因為在正常組織中，腎小管的葉酸受體表達較高，而其他組織和器官
1.80±0.71 1.45±0.12 2.58±0.37 1.29±0.19 125.10±16.81 2.05±0.28 1.00±0.57 5.79±1.60 1.17±0.06 2.73±0.64
1.46±0.22 0.92±0.23 1.47±0.20 0.51±0.03 124.05±20.74 1.18±0.49 1.02±0.44 0.99±0.51 1.35±0.46 1,21±0.13
0.67±0.09 0.53±0.03 0.97±0.18 0.51±0.04 9.73±4.52 1.10±0.26 1.42±0.78 1.13±0.39 0.79±0.66 1.30±0.29
2.32±0.17 0.84±0.08 1.74±0.35 1.22±0.81 153.80±20.10 2.64±0.51 1.33±0.69 2.45±0.90 1.13±0.67 0.52±0.02
、七肝肺脾腎骨腸肉胃血
8的葉酸受體表達相對保守。當注入過量葉酸時，標記配合物在腎臟中的攝取被明顯抑制，表
明該標記配合物對葉酸受體具有較高的親和性及有較高選擇性。 6.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在荷瘤小鼠模型中的生物分布測定取體質量約18 20g的裸鼠，于左上肢皮下接種KB腫瘤細胞株0. lmL(6Xl(f)，接
種后用乏葉酸的食物喂養10 14天，待瘤徑長到0.8 l.Ocm時可用于實驗。取荷KB腫
瘤小鼠10只，分為2組，尾靜脈注射0. lmL (約185KBq，放射化學純度大于90 % )的標記物
溶液，在注射后4h將小鼠斷頭處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、骨、腫瘤、肌肉及血等組織，
稱重并在锝分析儀內測其放射性計數，計算每克組織的放射性計數占總注射劑量的百分數
(% ID/g)，抑制組同時注入0. lmL葉酸溶液(lmg/mL)。實驗結果如表3所示
表3. 99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在荷瘤小鼠體內分布 4h 4h (block) 通過以上實施例的檢測數據說明，"mTc-HYNIC-NHHN-Folate可以作為一種新型 39mTc標記葉酸受體腫瘤顯像劑推廣應用。
0.98±0.200.21±0.03
0.86±0.100.60±0.13
0.64±0.190.37±0.08
0.29±0.060.21±0.05
114.88±8.1217.25±1.22
0.36±0.140.20±0.10
0.81±0.230.24±0.08
0.57±0.371.83±2.73
0.30±0.070.35±0.08
9.79±1.660.60±0.09
、L肝肺脾腎腸肉胃血瘤
9
權利要求
一種99mTc標記的肼基煙酰胺基-葉酸配合物，其特征在于表達式為99mTc-HYNIC-NHHN-Folate，其結構式為該結構式中配體HYNIC-NHHN-Folate分子中肼基中的氮原子、共配體Tricine和TPPTS分子中的氧原子與磷原子與99mTc進行配位得到99mTc-HYNIC-NHHN-Folate配合物。FSA00000008760000011.tif
2.制備99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物的制備方法，其步驟如下 a.配體肼基煙酰胺基 一 葉酸的合成將化合物葉酸和琥珀酰亞胺-6-叔丁基氧羰基肼基吡啶_3-甲酸溶解在10-50mL的二 甲基亞砜中，加入5-25mL吡啶，室溫反應10-24h ;將反應后的溶液緩慢滴入乙醚中，離心收 集生成橙紅色沉淀物，分別用乙醚和二氯甲烷洗滌，真空干燥得橙紅色固體；將橙紅色固體 加入l-5mL的三氟乙酸中，在氮氣保護下，冰水浴反應2h后，旋蒸除去三氟乙酸，將剩余油 狀液體用0. l-2mL N，N-二甲基甲酰胺溶液后滴入100-500mL吡啶中，離心收集產生的沉淀 并用乙醚洗滌，真空干燥得到棕黃色粉末；合成路線為<formula>formula see original document page 2</formula>b. 99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物的制備在青霉素小瓶中依次加入lO-lOOmg三羥甲基-甲基甘氨酸，20-100 iig氯化亞錫， 20-200 g配體肼基煙酰胺基 一 葉酸和0. l-lmL、 pH = 3. 6的醋酸鹽緩沖溶液，搖勻后向 其中注入37 370MBq的Tc-99m淋洗液0. 1_0. 5mL，沸水浴加熱15min ;在標記好的溶液中 加入l-5mg三苯甲基膦三磺酸鈉溶液，搖勻后沸水浴加熱5-30min，得到本發明所述99mTc標 記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物。
3.如權利要求1所述的99mTc標記的肼基煙酰胺基_葉酸配合物，其特征在于所述配 合物可作為葉酸受體用于制備腫瘤顯像劑。
全文摘要
本發明公開了一種99mTc標記的肼基煙酰胺基-葉酸配合物及制備方法和應用，通過a.配體肼基煙酰胺基-葉酸的合成和b.99mTc標記的肼基煙酰胺基-葉酸配合物兩個步驟的制備，得到本目標配合物。本配合物具有放射化學純度高、穩定性好、價格低廉，腫瘤攝取高并且滯留好，腫瘤/血、腫瘤/肌肉等靶/非靶比值好的優點，可作為一種新型99mTc標記葉酸受體制備腫瘤顯像劑。
文檔編號A61K103/10GK101775039SQ20101010111
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月25日 優先權日2010年1月25日
發明者唐志剛, 龐燕, 張俊波, 張現忠, 王學斌, 郭紅娟, 陸潔 申請人:北京師范大學;北京師宏藥物研制中心