煙酰胺作為抗真菌藥物增效劑的用途的制作方法

本發明涉及醫藥技術領域，具體地說，是煙酰胺作為抗真菌藥物增效劑的新用途。

背景技術：

侵襲性真菌感染近年來已成為許多國家重癥加強護理病房(ICUs)的重要死亡因素之一。然而臨床上可選用的抗真菌藥物種類比較少、毒副作用大，并且臨床耐藥菌株被不斷的分離并報道出來，這使得真菌感染的治療面臨著越來越嚴峻的挑戰。唑類、棘白菌素類及多烯類等抗真菌藥物是臨床上常用的能有效治療深部及淺表部真菌感染的抗真菌藥，如唑類中的氟康唑和伏立康唑等；棘白菌素類中的卡泊芬凈；多烯類中的兩性霉素B等。但隨著臨床上的耐藥菌株越來越普遍，致使不得不加大用藥劑量，某些抗真菌藥物甚至加大用藥量也無效。加大用藥劑量必然會增加毒副作用，尤其如兩性霉素B等對肝臟或心臟有毒副作用的藥物。此外卡泊芬凈、伏立康唑等原本價格高昂的藥物的應用將受到限制。

煙酰胺(Nicotinamide)，又名煙堿酰胺、尼克酰胺，是維生素B₃的酰胺形式，它同時也是輔酶I和輔酶II的重要組成部分，其結構如式(I)所示。

臨床實踐中，煙酰胺是一種具有廣泛用途的藥物，如用于糙皮病、天皰瘡、病態竇房結綜合征、房室傳導阻滯等的治療。近年來，煙酰胺更是作為一種在高給藥劑量下也安全、有效的藥物用于非黑色素瘤皮膚癌、日光性角化癥和弗里德希氏共濟失調的治療，且相關的研究進行到了三期臨床試驗階段。但至今未見煙酰胺可作為唑類、棘白菌素類或多烯類等抗真菌藥物增效劑的報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種煙酰胺作為抗真菌藥物增效劑的新用途。

本發明的第一方面，提供煙酰胺作為抗真菌藥物增效劑的新用途，即，煙酰胺在制備抗真菌藥物增效劑中的應用。

優選的，所述的抗真菌藥物是唑類、棘白菌素類或多烯類等抗真菌藥物。

優選的，所述的抗真菌藥物是氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈或兩性霉素B等抗真菌藥物。

優選的，所述的煙酰胺的用量為在抗真菌藥物有效濃度中加入0.8～35mg/ml。例如，在每毫升含氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈或兩性霉素B 0.0078～8微克的液體制劑中，加入煙酰胺0.8～35毫克；或者在每毫升含氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈或兩性霉素B 0.0078～8微克的固體制劑中加入煙酰胺0.8～35毫克。

優選的，所述的真菌是白色念珠菌、熱帶念珠菌或新生隱球菌。

在本發明的實施例中，所述的真菌是白色念珠菌38、白色念珠菌901、白色念珠菌885、白色念珠菌953、白色念珠菌557；熱帶念珠菌2718、熱帶念珠菌ATCC750、熱帶念珠菌112936；新生隱球菌553、新生隱球菌20186、新生隱球菌041。

本發明的第二方面，提供一種抗真菌的藥物組合物，所述的藥物組合物的活性成分是抗真菌藥物和煙酰胺。

優選的，所述的抗真菌藥物是唑類、棘白菌素類或多烯類等抗真菌藥物。

更優選的，所述的抗真菌藥物是氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈或兩性霉素B等抗真菌藥物。

經實驗表明，當抗真菌藥物與煙酰胺合用時，煙酰胺能降低抗真菌藥物的用藥劑量，不僅能在減少抗真菌藥物用藥量的情況下確保其對真菌的抗菌效果，而且對于臨床分離的耐藥性菌株、熱帶念珠菌或新生隱球菌均具有明顯的增效作用。侵襲性真菌感染的動物模型顯示，煙酰胺能增強氟康唑的治療效果。因此煙酰胺可用作抗真菌藥物的增效劑，用于不同真菌感染的治療。

本發明優點在于：

本發明為煙酰胺開辟了一種新用途，作為抗真菌藥物的增效劑，可降低唑類、棘白菌素類及多烯類等抗真菌藥物的用藥劑量，從而減輕了藥物的毒副作用，特別是氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈及兩性霉素B等。尤其是煙酰胺作為抗真菌藥物的增效劑，使抗真菌藥物恢復對耐藥真菌的作用，有效治療真菌感染特別是耐藥性真菌感染，降低藥物的毒性并減輕病人用藥的經濟負擔，此外還能增強抗真菌藥物對熱帶念珠菌及新生隱球菌的作用，具有重要的臨床應用價值。

附圖說明

圖1.煙酰胺對氟康唑治療小鼠侵襲性真菌感染效果的影響。小鼠由尾靜脈注射0.2ml白色念珠菌(5×10⁶個/ml)，煙酰胺單用或與氟康唑聯用的藥液由腹腔注射。圖A為單獨或聯合腹腔注射0.125mg/kg氟康唑、350mg/kg煙酰胺時，系統性真菌感染小鼠生存率變化的曲線；圖B為單獨或聯合腹腔注射0.25mg/kg氟康唑、350mg/kg煙酰胺時，系統性真菌感染小鼠生存率變化的曲線。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1：煙酰胺和氟康唑合用對不同臨床真菌菌株的作用

材料和方法

1.試藥：

煙酰胺：美國sigma試劑公司(下同)。

氟康唑：美國sigma試劑公司(下同)。

二甲亞砜：中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

煙酰胺用培養液配成濃度為200mg/ml的母液，氟康唑用二甲亞砜配成濃度為6.4mg/ml的母液，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。

2.菌株：

白色念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌臨床株，由上海長海醫院真菌室提供，均經形態學和生化學鑒定。

所有實驗用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養基(SDA)劃板活化，于35℃培養1周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法培養后于4℃保存備用。

3.培養液：

RPMI 1640培養液：RPMI 1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO₃ 2.0g，嗎啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH調pH至7.0，定容至1000ml，濾過消毒，4℃保存。

沙堡葡萄糖瓊脂(SDA)培養基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入濃度為2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調整pH至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。

YEPD培養液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入濃度為2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。

4.儀器：

隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；

THZ-82A臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫療器械廠)；

511型酶標分析儀(上海第三分析儀器廠)；

5.菌液制備：

(1)念珠菌菌液

從4℃保存的SDA培養基上挑取念珠菌少量，接種至1mlYEPD培養液，于30℃以200rpm振蕩培養活化，使真菌處于指數生長期后期。取該菌液至1mlYEPD培養液中，用上述方法再次活化16小時后，用血細胞計數板計數，以RPMI 1640培養液調整菌液濃度至3×10³～5×10³個/ml。

(2)新生隱球菌菌液

從4℃保存的SDA培養基上挑取新生隱球菌少量，接種至1mlYEPD培養液，于30℃以200rpm振蕩培養活化，使真菌處于指數生長期后期。取該菌液至1mlYEPD培養液中，用上述方法再次活化16小時后，用血細胞計數板計數，以RPMI 1640培養液調整菌液濃度至3×10³～5×10³個/ml。

6.藥敏板制備：

將煙酰胺母液用RPMI1640培養液稀釋為25.6～0.8mg/ml。取無菌96孔板，于每排1～12號孔加入含有或不含一定濃度煙酰胺的RPMI1640培養液100μl；2號孔再分別加入相應的培養液196μl和氟康唑溶液4μl，或加入148.8μlRPMI1640培養液和煙酰胺溶液51.2μl。

對2～11號孔進行倍比稀釋，使2～11號孔的最終氟康唑濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml；煙酰胺濃度為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05mg/ml；再于每排2～12號孔加入菌液100μl，使得1號孔為不含藥物的RPMI 1640培養液，作為陰性對照，12號孔為不含藥物的菌液，作為陽性對照。各藥敏板于振蕩器上振蕩混勻5分鐘后于30℃培養。

7.MIC₈₀值判定：

含菌96孔板分別于30℃培養48小時后，按常規用酶標分析儀于620nm測各孔OD值。與陽性對照孔比，以OD值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC₈₀(真菌生長80％被抑制時的藥物濃度)。

當藥物的MIC₈₀值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統計：氟康唑MIC₈₀值高于最高濃度64μg/ml時，計為“>64μg/ml”；煙酰胺MIC₈₀值高于最高濃度25.6mg/ml時，計為“>25.6mg/ml”。上述實驗均平行操作2到3次，當MIC₈₀值能準確重復時才被接受；當MIC₈₀值相差一個濃度以上時，則需要重新實驗，直到符合要求為止。

實驗結果見表1，表2。

表1煙酰胺與氟康唑單用和合用時，5株臨床白色念珠菌的MIC₈₀值

注：fluconazole的單位為μg/ml，nicotinamide的單位為mg/ml(下同)

表2煙酰胺與氟康唑單用和合用時，6株熱帶念珠菌及新生隱球菌的MIC₈₀值

由表1和表2可見，合用時，12.8～25.6mg/ml的煙酰胺可使白色念珠菌對氟康唑的MIC₈₀值下降16～32倍，3.2～25.6mg/ml的煙酰胺可使臨床熱帶念珠菌對氟康唑的MIC₈₀值下降8～64倍，6.4～25.6mg/ml的煙酰胺可使臨床新生隱球菌對氟康唑的MIC₈₀值下降8～64倍，說明煙酰胺能明顯增強氟康唑的抗真菌作用。

實施例2：煙酰胺和伏立康唑合用對不同臨床真菌菌株的作用

材料和方法

1.試藥：

煙酰胺：美國sigma試劑公司(下同)。

伏立康唑：美國sigma試劑公司(下同)。

二甲亞砜：中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

煙酰胺用培養液配成濃度為200mg/ml的母液，伏立康唑用二甲亞砜配成濃度為6.4mg/ml的母液，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。

2.菌株：

白色念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌，由上海長海醫院真菌室提供，經形態學和生化學鑒定確認。

其它實驗步驟與方法同實施例1。

實驗結果見表3、表4。

表3煙酰胺與伏立康唑單用和合用時，5株臨床白色念珠菌的MIC₈₀值

注：voriconazole的單位為μg/ml，nicotinamide的單位為mg/ml(下同)

表4煙酰胺與伏立康唑單用和合用時，6株熱帶念珠菌及新生隱球菌的MIC₈₀值

由表3和表4可見，合用時，12.8～25.6mg/ml的煙酰胺可使白色念珠菌對伏立康唑的MIC₈₀值下降>256倍，3.2～12.8mg/ml的煙酰胺可使臨床熱帶念珠菌對伏立康唑的MIC₈₀值下降>8～>128倍，6.4～12.8mg/ml的煙酰胺可使臨床新生隱球菌對伏立康唑的MIC₈₀值下降1～>256倍，說明煙酰胺能明顯增強伏立康唑的抗真菌作用。

實施例3：煙酰胺和卡泊芬凈合用對不同臨床真菌菌株的作用

材料和方法

1.試藥：

煙酰胺：美國sigma試劑公司(下同)。

卡泊芬凈：美國sigma試劑公司(下同)。

二甲亞砜：中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

煙酰胺用培養液配成濃度為200mg/ml的母液，卡泊芬凈用二甲亞砜配成濃度為0.2mg/ml的母液，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。

2.菌株：

白色念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌，由上海長海醫院真菌室提供，經形態學和生化學鑒定確認。

其它實驗步驟與方法同實施例1。

實驗結果見表5，表6。

表5煙酰胺與卡泊芬凈單用和合用時，5株臨床白色念珠菌的MIC₈₀值

注：caspofungin的單位為μg/ml，nicotinamide的單位為mg/ml(下同)

表6煙酰胺與卡泊芬凈單用和合用時，6株熱帶念珠菌及新生隱球菌的MIC₈₀值

由表5和表6可見，合用時，0.8～12.8mg/ml的煙酰胺可使白色念珠菌對卡泊芬凈的MIC₈₀值下降 4～8倍，25.6mg/ml的煙酰胺可使臨床熱帶念珠菌對卡泊芬凈的MIC₈₀值下降 1～32倍，6.4～12.8mg/ml的煙酰胺可使臨床新生隱球菌對卡泊芬凈的MIC₈₀值下降4～64倍，說明煙酰胺能明顯增強卡泊芬凈的抗真菌作用。

實施例4：煙酰胺和兩性霉素B合用對不同臨床真菌菌株的作用

材料和方法

1.試藥：

煙酰胺：美國sigma試劑公司(下同)。

兩性霉素B：美國sigma試劑公司(下同)。

二甲亞砜：中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

煙酰胺用培養液配成濃度為200mg/ml的母液，兩性霉素B用二甲亞砜配成濃度為2mg/ml的母液，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。

2.菌株：

白色念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌，由上海長海醫院真菌室提供，經形態學和生化學鑒定確認。

其它實驗步驟與方法同實施例1。

實驗結果見表7，表8。

表7煙酰胺與兩性霉素B單用和合用時，5株臨床白色念珠菌的MIC₈₀值

注：Amphotericin B的單位為μg/ml，nicotinamide的單位為mg/ml(下同)

表8煙酰胺與兩性霉素B單用和合用時，6株熱帶念珠菌及新生隱球菌的MIC₈₀值

由表7和表8可見，合用時，6.4～12.8mg/ml的煙酰胺可使白色念珠菌對兩性霉素B的MIC₈₀值下降 2～4倍，12.8～25.6mg/ml的煙酰胺可使臨床熱帶念珠菌對兩性霉素B的MIC₈₀值下降 4～256倍，6.4～25.6mg/ml的煙酰胺可使臨床新生隱球菌對兩性霉素B的MIC₈₀值下降4～16倍，說明煙酰胺能明顯增強兩性霉素B的抗真菌作用。

實施例5：煙酰胺和氟康唑合用對小鼠體內真菌感染的治療作用

材料和方法

1.試藥：

煙酰胺：美國sigma試劑公司(下同)。

氟康唑：美國sigma試劑公司(下同)。

二甲亞砜：中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

煙酰胺用培養液配成濃度為200mg/ml的母液，氟康唑用二甲亞砜配成濃度為6.4mg/ml的母液，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。

2.菌株：

白色念珠菌SC5314(菌株的詳細信息和制備方法參考文獻：Fonzi WA,Irwin MY.Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.Genetics 1993；134:717-28.)。

3.動物：

Balb/c雌性小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

4.溶液：

沙堡葡萄糖瓊脂(SDA)培養基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入濃度為2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調整pH至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。

YEPD培養液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入濃度為2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。

PBS緩沖液：磷酸二氫鉀 0.27g，磷酸氫二鈉 1.42g，氯化鈉 8g，氯化鉀0.2g，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH至7.4，最后定容到1000ml，高壓滅菌后4℃保存。

5.菌液制備：

從4℃保存的SDA培養基上挑取念珠菌少量，接種至1mlYEPD培養液，于30℃以200rpm振蕩培養活化，使真菌處于指數生長期后期。取該菌液至1mlYEPD培養液中，用上述方法再次活化16小時后，用血細胞計數板計數，以PBS緩沖液調整菌液濃度至5×10⁶個/ml。

6.真菌感染及治療：

煙酰胺用PBS稀釋成35mg/ml，氟康唑用PBS或35mg/ml煙酰胺溶液稀釋成 0.0125mg/ml及0.025mg/ml的溶液，使得給藥時的藥物劑量為煙酰胺350mg/kg，氟康唑0.125mg/kg或0.25mg/kg。小鼠隨機分組，每組8只，其中三組小鼠腹腔注射煙酰胺溶液0.2ml，其余小鼠腹腔注射PBS溶液0.2ml。30分鐘后，由小鼠尾靜脈注入0.2ml菌液，并于4小時后由腹腔注射0.2ml藥液，此后1天、2天、4天及6天再次給藥。以給菌當天為0天，每天觀察并記錄小鼠生存情況，連續觀察15天。實驗結果見圖1。

由圖1可見，合用時，350mg/kg的煙酰胺可顯著增強0.125mg/kg或0.25mg/kg氟康唑對小鼠侵襲性真菌感染的治療效果。

以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。