反式西紅花酸的制備方法和應用的制作方法

專利名稱：反式西紅花酸的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種制備西紅花酸的方法，是從天然植物中提取 轉化得到反式西紅花酸，該反式西紅花酸具有治療脂肪肝的顯著功效。
背景技術：
西紅花酸是西紅花苷的苷元，是從一種鳶尾科番紅花屬植物_西紅花中分離提取 出的一種有效成分之一。它具有多不飽和共軛烯酸結構，屬類胡蘿卜素物質。西紅花酸在 桅子和西紅花等天然植物中含量較高；桅子、西紅花等天然植物中除了含有西紅花酸外還 含有大量的西紅花苷，即西紅花酸和糖的復合物，如西紅花苷1、2、3、4。在一定的條件下水 解西紅花苷的糖苷鍵，脫去糖配體就可生成西紅花酸。研究發現，西紅花酸具有抗氧化、保護心腦血管、提高免疫功能和抗腫瘤等多種生 理活性，在抗心血管系統疾病、抗動脈粥樣硬化、防治糖尿病并發癥等方面有明確的生物活 性。西紅花酸具有抗腫瘤活性，可以有效地抑制癌細胞的增殖，在胰腺癌、肺癌、膠質細胞 瘤、乳腺癌的相關實驗中都有證明。已有研究證明西紅花酸對于肝臟脂質代謝有重要的調 節作用，可以有效改善肥胖大鼠的胰島素抵抗情況。其對于黃曲霉素Bl以及各種急性的肝 中毒損傷也具有一定的保護作用。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD)是一種無過 量飲酒史，病變主體在肝小葉，以肝細胞彌漫性脂肪變性和脂肪貯積為主的臨床病理綜合 征。NAFLD所指的脂肪肝一系列的病變狀態，依照其嚴重程度可分為脂肪肝、脂肪性肝炎 (Non-alcoholicsteatoh印atitis，NASH)、肝硬化。其中，NASH伴隨有較明顯的肝脂肪變性， 肝纖維化等病理特征。據統計NAFLD在北美地區的患病率高達20% -30%，在亞洲，患病率 約有12% 24%，且這一數字也在呈不斷的上升趨勢。由于人們生活狀態的改變，過營養現象變得越來越普遍。日漸減少的體力活動加 上生活中無處不在的高脂肪含量食物，肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征已經成為了 NAFLD常 見的并發癥。目前普遍認為NAFLD是代謝綜合征和胰島素抵抗的一種肝臟表現。長期的 NAFLD —旦經過惡化，就會由單純的肝脂肪變性，誘發成為肝炎，肝纖維化，最后導致肝硬 化、肝細胞癌(h印atocellular carcinoma，HCC)，對人類生命健康造成極大的威脅。關于 NAFLD的發病機制研究中，Day所提出的“二次打擊學說”已得到學術界普遍認可。所謂2 次打擊學說，即指第一次打擊為肥胖、2型糖尿病、脂代謝紊亂等導致的胰島素抵抗、游離脂 肪酸增加、肝臟脂肪代謝障礙，從而使肝細胞合成甘油三脂(TG)增加而輸出減少，導致肝 細胞脂肪變性；第二次打擊是指在第一次打擊的基礎上再加重損傷，從而使單純性脂肪肝 發展至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)甚至肝纖維化。導致第2次打擊可有多種因素，而其中 氧化應激和脂質過氧化起到了重要的作用。在探討西紅花酸所起到的各種作用的同時，不容忽視的是它的抗氧化功效。研究 發現，西紅花酸對于H2O2產生的羥自由基(0H ·)有很好的清除作用，可有效降低自由基對 紅細胞和亞細胞膜性結構的破壞作用，同時也能顯著抑制自由基對DNA的損傷。
中國專利申請200710001116. 7公開了一種從桅子中提取制備西紅花酸的方法， 即將桅子粉碎經蒸餾水或乙醇溶液超聲強化提取，提取液過濾后濃縮，水提取的濃縮液乙 醇沉淀后再濃縮或經大孔樹脂分離桅子苷類物質，將西紅花苷洗脫液濃縮后酸堿水解，離 心得到西紅花酸粗品進一步純化后得高純度西紅花酸；該文件提供了一種西紅花酸的批量 生產方法。但是，這種方法在提取中均要采用乙醇提取或乙醇沉淀，且超聲強化提取的方法 受限于設備而不適于大規模生產，且其先提取后濃縮或上大孔樹脂后洗脫液濃縮以后再進 行酸堿水解的工藝繁瑣、存在多次濃縮過程，消耗大量能源不利于環保。

發明內容
本發明旨在提供一種反式西紅花酸的制備方法，在天然植物原料提取過程中將西 紅花苷轉化為西紅花酸。本發明還提供了上述反式西紅花酸在制備治療脂肪肝的藥物方面的應用。本發明采用稀堿提取，將提取濃縮和水解過程合而為一，在提取濃縮過程中將西 紅花苷進行水解轉化成西紅花酸。即將原料粉碎，用堿性稀醇溶液進行轉化提取，提取液用 酸調節至PH7 9，減壓濃縮，過濾或離心去除沉淀雜質，清液調節至pH2 5，過濾或離心 收集紅色沉淀，用弱酸性水或稀乙醇溶液洗滌沉淀，干燥，得西紅花酸含量高于50%的西紅 花酸粗品；西紅花酸粗品重結晶純化后得到含量高于95%的高純度反式西紅花酸，具體方 法如下(1)將植物原料過5 100目篩粉碎，用8 16倍原料重量、含醇量0 60wt% 的稀醇水溶液提取，過濾或離心得提取液；所述的稀醇水溶液用堿將PH調節為10 14 ；(2)提取液用酸調節至pH 7 9，并將提取液減壓濃縮得到濃縮液，所得到的濃縮 液體積與原料植物重量比為1 1 5L/Kg;(3)將濃縮液過濾或離心去除沉淀，得濃縮清液；(4)用酸調節濃縮清液至pH 2 5，靜置0. 5 12小時，離心或過濾得到西紅花 酸粗品；(5)西紅花酸粗品重結晶1 3次，即得反式西紅花酸，其中反式西紅花酸的含量 在95%以上；重結晶的工藝為將西紅花酸粗品用2 20倍重量份、pH 7 10的醇溶液溶解， 再緩緩加入酸調節至pH 2 4析出沉淀，靜置0. 5 12小時，離心或過濾得沉淀；所述的醇溶液為質量濃度50 100%的甲醇或乙醇溶液，且用氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉調節PH值；所述的用于調節pH的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸或草酸。步驟(1)采用的植物原料可選用桅子果實或西紅花(Crocussativus)的雌蕊， 其中桅子果實包括桅子(Gardenia jasminodes Ellis)、7jC桅子(Gardenia jasminodes Ellis f. longiarpa Z. ff. Xie et Okada)或大花桅子(Gardenia jasminodes Ellis var. fortuniana (Lindl) Ham)的果實。步驟(1)所述的提取方法為回流、浸漬或滲漉。步驟(1)中所述的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或碳酸氫鈣。步驟(2)和(4)中所述用于調節pH的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸或草酸。
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步驟(1)中所述的醇為甲醇或乙醇。本發明采用稀堿提取，將提取和水解過程合而為一，即在提取過程中將西紅花苷 進行水解轉化成西紅花酸，使提取與轉化一步完成，方法簡便、快速、成本大幅降低。在建立脂肪肝細胞模型基礎上，通過西紅花酸干預，結合對自由基代謝和相關生 化指標進行了的測定，證明一定濃度的反式西紅花酸干預，通過降低氧化水平確能改善脂 肪肝細胞的作用。通過細胞水平的實驗證明該反式西紅花酸和含有該反式西紅花酸的脂質 體具有顯著抗氧化活性和防治脂肪肝的功效。


圖1為實施例7脂肪肝細胞加入西紅花酸前后用油紅染色后鏡下觀察脂變細胞的 比例圖2為實施例7脂肪肝細胞加入西紅花酸前后的油紅染色照片圖3為實施例7反式西紅花酸干預前后脂肪肝細胞內相對于正常細胞的TG含量 變化圖4為實施例7反式西紅花酸干預前后脂肪肝細胞內相對于正常細胞的ROS含量 變化圖5為實施例7反式西紅花酸干預前后脂肪肝細胞內相對于正常細胞的MDA含量 變化圖6為實施例7反式西紅花酸干預前后脂肪肝細胞內相對于正常細胞的NADPH變 化圖7為實施例7反式西紅花酸干預前后脂肪肝細胞內相對于正常細胞的GSH含量 變化圖8為實施例7反式西紅花酸干預前后脂肪肝細胞內SOD活性變化圖1、3 8中， 柱狀圖依次為空白組、FFA組和FFA+不同濃度反式西紅花酸和反式西紅花酸脂質體，黑色 柱為FFA+反式西紅花酸組，白色柱為FFA+反式西紅花酸脂質體組；縱坐標為IO6細胞中各 項指標相對于空白組的值；FFA的濃度為0. 5mmol/L。*表示反式西紅花酸組與FFA組相比 ρ < 0. 05，**表示反式西紅花酸脂質體組與西紅花酸組相比ρ < 0. 05。
具體實施例方式實施例1(1)桅子(Gardenia jasminodes Ellis)果實 10kg，粉碎過 40 目篩，分別用 60L、 40L30%稀乙醇溶液(用氫氧化鈉調節pH= 12)回流提取兩次，第一次3小時、第二次1. 5 小時，過濾得到提取液；(2)提取液用鹽酸調節pH = 8，減壓濃縮至約5L ；(3)過濾，取濾液得到濃縮清液；(4)濃縮清液中慢慢滴加鹽酸溶液，調節pH = 3，靜置4小時，過濾得磚紅色沉淀， 用PH = 5的鹽酸稀乙醇溶液(乙醇濃度為20% )洗滌沉淀2次，純水洗滌1次，干燥，即得 西紅花酸粗品，其中反式西紅花酸含量為81.4%。實施例2
(1)水桅子果實10kg，粉碎過5目篩，用80L 60%稀甲醇溶液(用氫氧化鉀調節PH 10)滲漉提取，離心得到提取液；(2)提取液用醋酸調節pH = 7，減壓濃縮至2L ；(3)過濾，取濾液得到濃縮清液；(4)濃縮清液中慢慢滴加醋酸溶液，調節pH至5，靜置0. 5小時，過濾得磚紅色沉 淀，PH = 4的醋酸稀醇(乙醇濃度為40% )洗滌沉淀2次，純水洗滌2次，干燥，即得西紅 花酸粗品，其中反式西紅花酸含量為86. 2%。實施例3(1)西紅花的雌蕊lkg，粉碎過100目篩，分別用7L、5L、4L水(用氫氧化鉀調節pH =14)浸漬提取三次，過濾，合并濾液，得到提取液；(2)提取液用鹽酸調節pH = 9，減壓濃縮至IL ；(3)過濾，取濾液，得到濃縮清液；(4)濃縮清液中慢慢滴加鹽酸溶液，調節pH至2，靜止12小時，過濾得磚紅色沉 淀，用PH = 6稀醇(乙醇濃度為30% )的洗滌沉淀1次，純水洗滌1次，干燥，即得西紅花 酸粗品，其中反式西紅花酸含量為80. 5%。實施例4將實施例1的西紅花酸粗品重結晶1次，得到西紅花酸。重結晶的步驟為取實施 例1的西紅花酸粗品IOOg溶解于500ml 50wt%乙醇水溶液(pH7. 5，用碳酸氫鈉調節)，過 濾，濾液調節至PH = 3，過濾得深紅色沉淀，純水洗滌至中性，即得西紅花酸，其中反式西紅 花酸含量為91.2%。實施例5將實施例1的西紅花酸粗品重結晶2次，得到西紅花酸。重結晶的步驟為取實施 例1的西紅花酸粗品IOOg溶解于1000ml 70wt%的甲醇溶液(pH7. 5，用碳酸氫鈉調節)， 5000轉離心10分鐘，上清液調節至pH = 2，過濾得深紅色沉淀，純水洗滌至中性；再將上述 步驟重復一次，即得西紅花酸，其中反式西紅花酸含量為97.2%。實施例6將實施例1的西紅花酸粗品重結晶3次，得到西紅花酸。重結晶的步驟為取實施 例1的西紅花酸粗品IOOg溶解于1000ml 95wt%的甲醇溶液(pH9. 0，，用NaOH調節)，5000 轉離心10分鐘，上清液調節至pH = 2，過濾得深紅色沉淀，純水洗滌至中性；再重復上述步 驟2次，即得西紅花酸，其中反式西紅花酸含量為98. 4%。實施例7西紅花酸抗氧化干預脂肪肝細胞的研究(1)材料和儀器材料L02人肝細胞株(浙江大學自由基生命科學研究中心饋贈)，RPMI-1640培養液 (GIBC0公司)，小牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)，反式西紅花酸(按實施例4的 方法制備得到)，油酸(國藥集團化學試劑有限公司)，磷鎢酸、棕櫚酸、二甲亞砜(國藥集 團化學試劑有限公司)，油紅0染色劑(復旦大學組織胚胎學系饋贈)，蘇木素(復旦大學 組織胚胎學系饋贈)，50%異丙醇(上海化學試劑有限公司)TG試劑盒、GSH試劑盒(南京 建成公司)，ROS試劑盒、GSH試劑盒(碧云天生物技術研究所)，煙酰胺、魯米諾、TBA、MTT、6PD、G6P (SIGAMA公司)，TRIS (博大泰克公司)，Triton X-100，EDTA (華美生物工程公司)。儀器電子分析天平，超凈工作臺，倒置相差顯微鏡(0LYMPUSCK40)，多功能酶標儀(ELX 800. BIO-TEK INSTRUMENTS), Panasonic DMC-FX3 照相機，752s 紫外分光光度計，熒光分光 光度計(HITACHI F-2500)，722s分光光度計，生物化學發光儀(SHG-1，上海檢測技術研究 所)(2)方法(a)細胞培養L02細胞在含10%的小牛血清的RPMI-1640培養液內，在37°C，5%
CO2培養箱內培養。(b)脂肪肝細胞模型的建立培養液內加入0. 5mmol/L脂肪酸混合液FFA(由油酸和棕櫚酸按2 1的比例配置而成)，培養48小時。(c)藥物處理細胞貼壁生長至70% -80%后由胰酶消化，接種于6孔板內，每孔 細胞數為IO5個/ml。分為①空白組(正常培養液培養72小時)，②脂肪酸(FFA)組(接 種24小時后，加入0. 5mmol/L的FFA混合液培養48小時)，③加藥組(接種12小時后加 入反式西紅花酸和含有反式西紅花酸的脂質體，使反式西紅花酸的終濃度為2. 5 μ mol/L、 5 μ mol/L和10 μ mol/L,培養12小時后再加入0. 5mmol/L的FFA混合液，培養48小時)。 脂質體處理采用薄膜分散法。(d)細胞活性的測量四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)待測96 孔板，每孔加入20μ1 ΜΤΤ，培養箱里培養4小時。棄上清，每孔加入150μ1 二甲亞砜，震蕩 IOmin0選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀測定各管吸光度。細胞存活率=實驗組吸光度 /對照組吸光度X 100%。(e)細胞油紅0染色細胞接種于6孔板(每孔放有蓋玻片)中，加有脂肪酸培養 2天后，PBS沖洗3次(每次5min)，50%的異丙醇固定lmin，油紅0染液染色lOmin，蒸餾 水沖洗3分鐘，蘇木素染色5min，分色，返藍，相機收集圖像。(f)細胞內甘油三酯(TG)測量細胞消化，離心收集后，-70°C和37°C快速凍融兩 次，鏡鑒，若細胞破碎不完全，再凍融一次。震蕩混勻，離心10000rpm，5min。吸取上清，利用 甘油三酯試劑盒(南京建成公司)進行測定。(g)細胞內活性氧族(ROS)測量按照ROS試劑盒內說明書操作，熒光檢測(h)細胞內GSH的測量待測細胞消化收集后，按照GSH試劑盒的說明書上的操作 執行。(i)細胞內NADPH測量參照Zhiquan Zhang等人提出的檢測方法。細胞消化，加 入緩沖液重懸，2次凍融破碎細胞。離心，收集上清，立即進行NADP、NADPH的測定。(j)細胞內SOD的測量采用連苯三酚自氧化方法。細胞消化后收集，快送凍融兩 次。取干凈測定管，分別加入CBS (pH ^ 10)，魯米諾，最后加入連苯三酚(lmmol/L)，反應20s 后開始測定其放光值。細胞內SOD活性由相對于連苯三酚自氧化產生的自由基基線ROS水 平的抑制率值表示。(k)細胞內脂質過氧化物(MDA)的測量采用硫代巴比妥酸(TBA)熒光法。取細 胞懸液，分別加入H2SO4、磷鎢酸后，室溫下混勻，離心，棄上清。然后加入TBA，混勻；沸 水浴lh，流水冷卻；加入正丁醇，振蕩混勻；離心，取上層液測定；發射光(EM)為553nm，激 發光(EX)為515nm測定。
(3)結果(a)不同濃度反式西紅花酸干預對脂肪肝細胞脂滴含量的影響脂肪肝細胞加藥前后用油紅染色后，鏡下觀察脂變細胞的比例，結果如圖1所 示)。加入FFA的細胞，脂變細胞比率為28. 7%，加入低濃度西紅花酸后脂變細胞比率下降 為16%，并隨干預濃度的增加脂變細胞下降幅度增大。加入低濃度脂質體反式西紅花酸后 脂變細胞比率下降幅度增大，低濃度時差異更明顯。圖2為油紅染色照片，結果顯示，空白組細胞(A)邊緣清晰，核大，細胞內少見染色 脂滴。單加脂肪酸組(B)可見大部分細胞內含較多脂滴。低濃度西紅花酸組(C)細胞內可 見染色脂滴數比僅加脂肪酸組少，大多細胞內只存有少數幾個脂滴，細胞狀態也顯示似空 白組。脂質體反式西紅花酸干預組(D)細胞內的脂滴數更少。加藥干預組相對于單純FFA 組的脂滴數明顯減少，進一步說明反式西紅花酸可在細胞水平上預防由混合脂肪酸引起的 細胞脂肪化。反式西紅花酸的脂質體可進一步改善細胞的脂肪化。
(b)反式西紅花酸干預后脂肪肝細胞內TG含量的變化甘油三酯TG是細胞內脂含量的重要指標，圖3顯示的是各組相對于正常組細胞內 TG的含量。FFA處理后，導致細胞內TG的含量明顯上升，增加了 363% ；而低反式西紅花酸 干預后可使已上升的TG含量顯著降低，相對于正常細胞TG值僅上升了 230% ；隨反式西紅 花酸干預濃度的增加TG下降幅度明顯增大。說明一定濃度的反式西紅花酸處理能夠明顯 改善細胞內脂肪的堆積。而加入脂質體處理的反式西紅花酸后，TG的下降幅度比單純反式 西紅花酸明顯增大，低濃度時差異更明顯。說明反式西紅花酸脂質體還可使西紅花酸抗脂 肪肝作用提高。(c)反式西紅花酸干預后脂肪肝細胞內氧化應激水平的變化ROS及MDA含量是反映細胞內自由基水平的重要指標。ROS的高低一定程度上也 代表細胞氧化水平的高低，圖4可以看出，加入FFA后，ROS明顯增高，升高了 44%，說明 在脂肪酸誘導脂肪肝的過程中，細胞的氧化水平增高；加入低濃度反式西紅花酸后細胞的 ROS含量降低，隨反式西紅花酸干預濃度的增加ROS下降幅度明顯增大，中濃度反式西紅花 酸干預相對于正常細胞ROS值僅上升了 11 %，說明反式西紅花酸具有清除自由基、改善細 胞內氧化水平的作用。當加入脂質體處理的反式西紅花酸后，ROS的下降幅度比單純反式 西紅花酸干預組增大，低濃度時差異更明顯。MDA是脂質過氧化物的產物，能促進自由基鏈鎖反應，進而可使蛋白質、核酸、脂類 等發生損傷，使生物膜變性，從而導致細胞突變、衰老或死亡，MDA的變化也能反映出機體內 脂質過氧化的程度，即可間接反映出細胞氧化損傷的程度。當加入西紅花酸后細胞內的MDA 含量比脂肪酸細胞組降低(圖5)。西紅花酸干預呈現劑量效應，隨著西紅花酸濃度的增加 MDA下降也增加。表明西紅花酸藥物干預能夠減輕細胞內脂質過氧化的水平，從而減輕脂肪 肝細胞的氧化損傷。當加入脂質體處理的西紅花酸后，MDA的下降幅度比單純西紅花酸干 預組增大，低濃度時差異更明顯。(d)反式西紅花酸干預后脂肪肝細胞內抗氧化水平的變化NADPH也反映體內可調節抗氧化系統的重要指標，圖5顯示NADPH相對于空白組的 含量，加入FAA造模后，細胞內的NADPH含量比空白組明顯降低(下降30% )，加入西紅花 酸后細胞的NADPH含量比FAA組升高，中高濃度反式西紅花酸干預組已接近或超過正常水平。說明反式西紅花酸對肝細胞脂化進程除了具一定抑制作用，并具調節細胞內氧化還原 系統的平衡。當加入脂質體處理的反式西紅花酸后，NADPH的上升幅度比單純反式西紅花 酸干預組也增大，低濃度時差異更明顯。圖6顯示細胞內還原型谷胱甘肽(GSH)的含量，GSH的含量變化可反映細胞內一些 系統的還原水平狀態，以及清除脂質過氧化的能力。FFA處理細胞后，細胞內GSH顯著下降， 降到只有原來的11%，這進一步印證了脂肪酸在誘導的脂肪肝細胞的過程中，會使胞內氧 化水平提高。而低濃度反式西紅花酸組的GSH水平比FFA組明顯上升(為空白組的65%)， 而中高濃度反式西紅花酸組GSH含量已接近或超過正常組。當加入脂質體處理的反式西紅 花酸后，對維持胞內GSH還原水平效果更明顯。
還原型谷胱甘肽(GSH)可稱謂是抵抗ROS生成的第一道屏障，在組織中起著細胞 防御因子的作用。因而GSH水平變化作為評價外源性物質對氧化損傷具防護作用的指標而 被廣泛應用。超氧化物歧化酶(SOD)是一種生物體內主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自 由基，可以特異的清除超氧陰離子，從而減少羥自由基等更具毒素作用的物質產生，在防御 氧的毒性、抑制老年疾病以及預防衰老等方面起著重要作用。實驗結果顯示FFA處理的細 胞類SOD活性降為原來的71 %，反式西紅花酸組干預組的SOD水平比FFA組明顯上升，并隨 干預濃度的增加SOD水平增加。加入反式西紅花酸干預后，SOD活性回復甚至超過正常，反 式西紅花酸的脂質體可使細胞內的SOD抗氧化酶水平進一步提高。見圖8。本實驗表明，脂肪肝細胞模型中GSH和SOD含量明顯降低，細胞抗氧化能力相對較 弱，氧化應激水平較高。而采用本方法制備的反式西紅花酸干預組則可以改善這一氧化還 原不平衡狀態，從而可提高細胞的存活率。脂質體處理后可使反式西紅花酸干預效果加強。 通過改變反式西紅花酸干預時間，即在誘導脂肪肝細胞模型前后不同的時間干預，表明西 紅花酸對于脂肪肝誘發具有一定的預防和控制作用。實驗數據采用平均值士標準偏差(mean士 SD)，組間比較采用T檢驗，ρ < 0. 05表
示差異有顯著性。實驗結果證明本方法制備的反式西紅花酸通過其抗氧化的功效可有效改善脂肪 肝細胞的氧化應激狀態。也提示本方法制備的反式西紅花酸對于脂肪肝變化具有一定的防 治作用。根據脂肪肝的“二次打擊學說”，在第二次打擊中，氧化應激和脂質過氧化物發揮 了主要作用。脂質過氧化作用主要是指在多不飽和脂肪酸中發生的一種自由基鏈式反應， 它主要是由自由基引發產生的，它的特點是鏈式的產生脂質過氧化物，破壞組織結構和功 能。伴隨著線粒體受損，肝輸送脂肪功能也顯著下降，這些變化能誘導編碼脂肪代謝酶的基 因改變，使得脂肪酸過氧化和甘油三酯堆積從而進一步造成肝損傷。持續過剩的ROS過剩 積累能使體內抗氧化劑逐趨耗竭，從而形成自由基鏈式反應的惡性循環。這些生物化學過 程使致炎細胞因子激活，導致肝細胞發生炎癥浸潤、壞死，甚至進展為肝纖維化、肝硬化。丙二醛(MDA)是脂質過氧化的產物，它可以直接反映自由基引起脂質過氧化的損 傷程度。脂肪肝模型中，ROS、MDA含量的顯著升高也驗證了脂肪肝細胞中的高水平的氧化 應激狀態使肝組織內的氧化還原平衡被嚴重破壞。而而本方法制備的西紅花酸干預卻可有 效降低氧化應激水平，從而防止“第二次打擊”的發生。本實驗通過建立脂肪肝細胞模型，在細胞水平上研究本方法制備的反式西紅花酸對脂肪肝細胞狀態的作用，為利用天然植物抗氧化成分防治脂肪肝病變提供了理論依據，也為臨床應用研究提供了實驗基礎。
權利要求
一種制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將植物原料過5～100目篩粉碎，用8～16倍原料重量、含醇量0～60wt％的稀醇水溶液提取，過濾或離心得提取液；所述的稀醇水溶液用堿將pH調節為10～14；(2)提取液用酸調節至pH 7～9，并將提取液減壓濃縮得到濃縮液，所得到的濃縮液體積與原料植物重量比為1∶1～5L/Kg；(3)將濃縮液過濾或離心去除沉淀，得濃縮清液；(4)用堿調節濃縮清液至pH 2～5，靜置0.5～12小時，離心或過濾得到西紅花酸粗品；(5)西紅花酸粗品重結晶1～3次，即得反式西紅花酸。
2.權利要求1所述的制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，所述步驟(1)采用的植物 原料為桅子的果實、水桅子的果實、大花桅子的果實或西紅花的雌蕊。
3.權利要求1所述的制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，步驟(1)所述的提取方法 為回流、浸漬或滲漉提取法。
4.權利要求1所述的制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，所述步驟(1)中用于pH 調節的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
5.權利要求1所述的制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，所述步驟(2)、(4)所述 的用于調節PH的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸或草酸。
6.權利要求1所述的制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，所述步驟(1)所述的醇為 甲醇或乙醇。
7.權利要求1所述的制備反式西紅花酸的方法，其特征在于，所述步驟(5)中重結晶的 工藝為將西紅花酸粗品用2 20倍重量份、pH 7 10的醇溶液溶解，再緩緩加入酸調節至 pH 2 4析出沉淀，靜置0. 5 12小時，離心或過濾得沉淀；所述的醇溶液為質量濃度50 100%的甲醇或乙醇溶液，且用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫 氧化鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉調節PH值；所述的用于PH調節的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸或草酸。
8.反式西紅花酸在制備治療脂肪肝藥物方面的應用。
9.含有反式西紅花酸的脂質體在制備治療脂肪肝藥物方面的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥領域，公開了一種制備西紅花酸的方法，采用稀堿提取，將提取濃縮和水解過程合而為一，在提取濃縮過程中將西紅花苷進行水解轉化成西紅花酸。即將原料粉碎，用pH 10～14的稀堿醇溶液進行轉化提取，提取液用酸調節pH7～9，減壓濃縮，過濾或離心去除沉淀雜質，調節pH2～5，過濾或離心收集紅色沉淀，得西紅花酸含量高于50％的西紅花酸粗品，將西紅花酸粗品重結晶純化后得到含量高于95％的高純度反式西紅花酸。這種反式西紅花酸可用于制備治療脂肪肝的藥物，也在腫瘤等其他疾病的防治中有著廣闊的應用前景。
文檔編號A61P1/16GK101811956SQ201010148218
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者劉珊林, 施冬云, 謝飛舟 申請人:施冬云;劉珊林;謝飛舟