專利名稱：：一種醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種醋酸棉酚藥物制劑的制備方法，特別涉及一種醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的制備方法。
背景技術：
：棉酚(gossypol)，又稱為棉籽醇，是一種黃色的酚類化合物。天然存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉、莖及根部等器官中的。常溫下，棉酚呈黃色結晶，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷等有機溶劑，亦溶于油脂，但不溶于水、己烷及低沸點的石油醚，其中大部分有機溶劑對人體毒性較大，不適于作為藥物載體。棉酚作為男性節育藥已為人們所熟知。近年來，其抗腫瘤作用日益也受到重視，其對腫瘤細胞的具有廣泛的殺傷作用如子宮肌瘤、前列腺癌、結腸癌、肺癌、肝癌、喉癌、頭頸部腫瘤、膠質瘤等。棉酚作為一種廣譜抗腫瘤藥物，具有來源豐富、成本低等優勢，并可與化學治療、放射治療等發揮協同治療作用。我國是產棉大國，棉酚來源豐富，加強棉酚腫瘤制劑的研發將具有良好的經濟和社會效益。目前上市的棉酚制劑只有醋酸棉酚口服制劑，作口服男用避孕藥或用于治療婦科疾病，包括月經過多或失調、子宮內膜異位癥等。但由于棉酚及醋酸棉酚不溶于水，其口服制劑生物利用度低，對胃腸道刺激性食欲減退、惡心、嘔吐等胃腸道反應，并出現“峰谷”現象容易引起低鉀血癥。中國專利200510022777.9(申請人沈陽藥科大學，公開號CN1827117，公開日2006年09月06日，授權公告日期2009年12月16日)公開了一種口服醋酸棉酚緩釋制劑將醋酸棉酚片劑加入緩釋材料形成緩釋制劑避免出現“峰谷”現象，用于解決“峰谷”現象。但緩釋制劑在加入眾多緩釋輔料后其載藥量受限且仍無法避免其對胃腸道的刺激作用。而醋酸棉酚用于治療腫瘤的劑量相對較高，美國專利US5385936(申請日期1990年7月12日，公開日1995年1月31日)公開的醋酸棉酚用于腫瘤的治療方法表明，醋酸棉酚用于治療腫瘤的人用劑量為40-100mg/天。其一期臨床試驗中對部分腫瘤劑量達到70mg/天仍無效果。可見醋酸棉酚單位劑量至少為40-60mg，才能減少患者給藥次數并獲得較好的療效。并且上述制劑無法實現靶向性給藥。注射制劑通常有利于提高藥物生物利用度，有利于更好的發揮藥物的治療作用，但是由于醋酸棉酚水溶性較差，很難制成穩定的注射制劑，本發明的發明人在利用水溶性棉酚鈉制備注射劑的過程中發現，棉酚鈉在常用注射劑溶劑中也很難達到理想的載藥量和穩定性。脂肪乳劑是一種可以顯著提高藥物溶解度的藥物劑型，對改善水難溶性藥物的載藥量及藥劑學特征具有很大幫助，目前國內已研究了幾種藥物的脂肪乳劑。但是由于不同藥物如要獲得穩定的脂肪乳劑，對輔料即藥物載體的種類及用量的要求存在較大差異，需要對組方進行大量篩選實驗才能獲得最佳的藥物載體及配比。并需要對制備工藝進行優化涉及才能達到預期的穩定性及緩釋、靶向給藥的效果。目前，現有技術中并沒有關于棉酚的脂肪乳劑的制備方法的報道。
發明內容針對上述現有技術，本發明提供了一種用于制備醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的方法。本發明是通過以下技術方案實現的一種醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的制備方法，是以醋酸棉酚為活性成分，油酸乙酯或中鏈脂肪酸甘油三酸酯為油相，大豆卵磷脂為表面活性劑，無水乙醇或PEG400為助表面活性劑，滅菌注射用水為水相，其制備步驟如下(1)將醋酸棉酚溶于乙醚，然后與油相、表面活性劑、助表面活性劑混合，混合溫度為60或70°C，攪拌速率為1600-1800rpm，攪拌時間為1_2小時，減壓蒸發去掉乙醚，60或70°C恒溫保存備用；(2)將滅菌注射用水加熱，60或70°C恒溫保存備用；(3)60或70°C恒溫下將(1)、(2)所得液體混合，攪拌速率為2000-2400rpm，攪拌時間為1小時，至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，然后用均質機在40-60Mpa下反復勻化5_6次，用0.45μm微孔濾膜過濾。所述中鏈脂肪酸是指C8ClO的脂肪酸。為表述方便，及避免目前脂肪乳劑相關文獻中對“油相”一詞使用不規范造成的誤解，在本說明書后續部分中將步驟(1)所得液體稱為油相藥液，步驟(2)所得液體稱為水相液。本發明的制備方法得到的醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑經研究表明，以油酸乙酯或中鏈脂肪酸(C8-C10)甘油三酸酯為油相、以豆卵磷脂或吐溫80為表面活性劑、以無水乙醇或PEG400為助表面活性劑、以滅菌注射用水為水相可顯著提高醋酸棉酚的載藥量，但混合溫度、攪拌速度、攪拌時間及均質壓力和勻化次數對制劑的穩定性及乳滴粒度、緩釋效果及靶向性均有顯著影響。經全面的制劑工藝研究及體內藥代動力學和組織分布表明，在油相藥液混合溫度為60或70°C，攪拌速率為1600-1800rpm，攪拌時間為1_2小時，油相藥液與水相液混合溫度為60或70°C，攪拌速率為2000-2400rpm，攪拌時間為1小時，均質壓力為40-60Mpa,勻化次數為5_6次時，用0.45μm微孔濾膜過濾所得注射劑乳滴平均粒徑可保持在70-150nm。所得注射液具有良好的緩釋和靶向效果，且具有良好的穩定性。本制備方法工藝簡單，利于工業化生產。用本方法制備醋酸棉酚注射劑具備突出的實質性特點和顯著的進步。圖1為醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑大鼠單次尾靜脈注射后的藥時曲線；圖2為醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑荷瘤小鼠單次尾靜脈注射后的組織含量。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明實施例1醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的配制組方醋酸棉酚40g油酸乙酯207g大豆卵磷脂35g無水乙醇18g_無菌注射用水至1000ml制備將處方量醋酸棉酚溶于乙醚，然后在60°C恒溫水浴下加入油酸乙酯、大豆卵磷脂、無水乙醇，邊加入邊攪拌，攪拌速度為1600rpm，攪拌2小時，減壓蒸發去掉乙醚，作為油相藥液，60°C恒溫水浴保存備用；將適量滅菌注射用水，60°C恒溫水浴保存作為水相液；在60°C恒溫下將油相液緩慢滴入水相液，邊加入邊攪拌，攪拌速度為2200rpm，攪拌1小時至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，然后用均質機(NS10012k高壓均質機，意大利NiroSoaviS.p.A.公司)60Mpa下反復勻化5次，0.45ym微孔濾膜過濾。分裝成1000份，滅菌保存。所得樣品，乳滴平均粒徑為104nm，包封率為87.2%。實施例2醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的配制組方醋酸棉酚60g油酸乙酯220g大豆卵磷脂43gPEG40035g_無菌注射用水至1000ml制備將處方量醋酸棉酚溶于乙醚，然后在70°C恒溫水浴下加入油酸乙酯、大豆卵磷脂、PEG400,邊加入邊攪拌，攪拌速度為1700rpm，攪拌1.5小時，減壓蒸發去掉乙醚，作為油相液，70°C恒溫水浴保存備用；將適量滅菌注射用水70°C恒溫水浴保存作為水相液；在70°C恒溫下將油相液緩慢滴入水相液，邊加入邊攪拌，攪拌速度為2000rpm，攪拌1小時至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，然后用均質機(NS10012k高壓均質機，意大利NiroSoaviS.p.A.公司)60Mpa下反復勻化6次，0.45ym微孔濾膜過濾。分裝成1000份，滅菌保存。所得樣品，乳滴平均粒徑為142nm，包封率為93.6%。實施例3醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的配制組方醋酸棉酚80g中鏈脂肪酸(C8-C10)甘油三酸酯297g大豆卵磷脂36gPEG40029g_無菌注射用水至1000ml制備將處方量醋酸棉酚溶于乙醚，然后在70°C恒溫水浴下加入中鏈脂肪酸(C8-C10)甘油三酸酯、大豆卵磷脂、PEG400，邊加入邊攪拌，攪拌速度為ISOOrpm，攪拌2小時，減壓蒸發去掉乙醚，作為油相液，70°C恒溫水浴保存備用；將適量滅菌注射用水70°C恒溫水浴保存作為水相液；在70°C恒溫下將油相液緩慢滴入水相液，邊加入邊攪拌，攪拌速度為2400rpm，攪拌1小時至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，然后用均質機(NS10012k高壓均質機，意大利NiroSoaviS.p.A.公司)40Mpa下反復勻化6次，0.45ym微孔濾膜過濾。分裝成1000份，滅菌保存。所得樣品，乳滴平均粒徑為93nm，包封率為97.4%。實施例4醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑在大鼠體內的藥代動力學實驗Wister大鼠12只，180_240g，雌雄各半實驗前禁食一夜，隨機分為2組，每組6只，實驗組單次尾靜脈注射給予實施例1所制靜脈注射脂肪乳劑(以醋酸棉酚40mg/kg體重給藥)，對照組將醋酸棉酚混懸與0.25%的羧甲基纖維素制成混懸液經口灌胃給藥(以醋酸棉酚40mg/kg體重給藥)。給要后第0、30、60分鐘及第2、8、16、24小時分別采血測定血漿中醋酸棉酚含量，繪制藥時曲線圖，結果見圖1。從藥時曲線圖可見靜脈注射脂肪乳劑具有顯著的緩釋特點，且生物利用度顯著高于口服給藥。實施例5醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑在荷瘤小鼠體內的組織分布實驗荷Lewis肺癌C-57模型小鼠由陜西中醫研究院實驗動物中心購得，C-57小鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供，4-6周齡，體重15-25g，共60只，雄性。將模型的腫瘤剪下，研磨制成細胞勻漿，接種于C-57實驗小鼠右前肢根部腹側皮下，每只接種2.0X107個腫瘤細胞，總體積0.20ml。2周后腫塊長大，用于實驗。將荷瘤小鼠隨機分為2組，每組30只，實驗組單次尾靜脈注射給予實施例2所制靜脈注射脂肪乳劑(以醋酸棉酚40mg/kg體重給藥)，對照組將醋酸棉酚混懸于0.25%的羧甲基纖維素制成混懸液經口灌胃給藥(以醋酸棉酚40mg/kg體重給藥)。給藥后1、2、8、12、16、24小時每組各處死5只小鼠，取出腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎、腦測定其組織含量。根據組織中藥物的濃度及組織重量計算其相對含量，結果見圖2。由組織分布圖可見醋酸棉酚靜脈注射劑給藥后腫瘤組織中醋酸棉酚含量顯著高于經口給藥制劑。醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑對腫瘤組織具有一定的靶向性。實施例6棉酚靜脈注射脂肪乳劑的穩定性實驗對實施例1-3所得靜脈注射脂肪乳劑進行穩定性實驗。(1)強光照射試驗將棉酚靜脈注射脂肪乳劑在40001x光照下分別放置5天和10天后進行觀測，結果發現，與放置前相比，注射劑仍保持澄清透明，未見油水分層。(2)高濕度試驗將棉酚靜脈注射脂肪乳劑放在密閉器皿中分別于25%、75%及92.5%相對濕度條件下放置，5天和10天后考察穩定性。與放置前相比，靜脈注射劑仍保持澄清透明，未見油水分層。(3)高溫試驗將棉酚靜脈注射脂肪乳劑放在密閉器皿中并分別置于40、60、80°C條件下，5天和10天后考察穩定性。與放置前相比，仍保持澄清透明，未見油水分層。(4)加速試驗將棉酚靜脈注射脂肪乳劑4000rpm離心lOmin，仍保持澄清透明，未見油水分層。(5)常溫留樣考察將棉酚靜脈注射脂肪乳劑在溫度25°C、相對濕度75%條件下分別放置1、2、3、6、12、24月，仍保持澄清透明，未見油水分層及藥物析出。實施例7制備溫度對棉酚靜脈注射脂肪乳劑的影響研究按照實施例1-3的處方，制備醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑，三種處方制備溫度均設定為40°C、60°C、70°C、80°C、90°C五種溫度，其他條件不變，將油相藥液與水相液混合至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，觀察脂肪乳劑表面油滴及乳劑掛壁情況。并進一步高壓均質制成脂肪乳劑。結果表明，在40°C條件下將油相藥液與水相液混合至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，乳劑表面有油滴及存在掛壁現象；80°C、90°C條件下將油相藥液與水相液混合至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，乳劑表面無油滴及掛壁現象，但高壓均質后脂肪乳劑的乳滴粒徑差異較大，可能使藥物釋放速度產生較大波動并對組織分布產生影響。在60°C、70°C條件下將油相藥液與水相液混合至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，乳劑表面無油滴及掛壁現象，高壓均質后脂肪乳劑的乳滴粒徑差異均不超過20nm。實施例8制備壓力對棉酚靜脈注射脂肪乳劑的影響研究按照實施例1和3的處方，制備醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑，二種處方制備均質壓力均設定20Mpa、40Mpa、60Mpa、90Mpa四種壓力。其他條件不變。制備完成后進行荷瘤小鼠組織分布實驗。荷Lewis肺癌C_57模型小鼠由陜西中醫研究院實驗動物中心購得，C_57小鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供，體重15-20g，共48只，雄性。將模型的腫瘤剪下，研磨制成細胞勻漿，接種于C-57實驗小鼠右前肢根部腹側皮下，每只接種2.0X107個腫瘤細胞，總體積0.20ml。2周后腫塊長大，用于實驗。將荷瘤小鼠隨機分為8組，每組6只，分別單次尾靜脈注射給予按照實施例1和3的處方在20Mpa、40Mpa、60Mpa、90Mpa四種均質壓力所制靜脈注射脂肪乳劑(以醋酸棉酚40mg/kg體重給藥)，給藥后24小時處死小鼠，取出腫瘤組織測定其組織含量。根據組織中藥物的濃度及腫瘤組織重量計算其相對含量，結果見表1。表1均質壓力對棉酚靜脈注射脂肪乳劑在腫瘤組織分布的影響(Pg/g，平均值士標準差)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例359.50±19.38I29.66±30.06ab132.90士6.74ab72.59±19.64a與20Mpa下制備的制劑相比p<0.05;a與90Mpa下制備的制劑相比p<0.05。結果表明均質壓力40Mpa和60Mpa制備的棉酚靜脈注射脂肪乳劑在腫瘤組織分布較高，且與20Mpa和90Mpa相比有顯著差異。實施例9勻質次數的影響按照實施例1和2的處方，制備醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑，二種處方制備的勻質次數均設定5次、6次、8次、10次四種勻質次數。其他條件不變。制備完成后測定其乳滴粒徑。結果見表2。表2勻質次數對棉酚靜脈注射脂肪乳劑乳滴粒徑的影響(nm，平均值士標準差)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果表明勻質次數超過8次時乳滴粒徑均差異較大。權利要求一種醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的制備方法，其特征在于是以醋酸棉酚為活性成分，油酸乙酯或中鏈脂肪酸甘油三酸酯為油相，大豆卵磷脂為表面活性劑，無水乙醇或PEG400為助表面活性劑，滅菌注射用水為水相，其制備步驟如下(1)將40～80g醋酸棉酚溶于乙醚，然后與200～300g油相、30～50g表面活性劑、10～40g助表面活性劑混合，混合溫度為60℃或70℃，攪拌速率為1600-1800rpm，攪拌時間為1-2小時，減壓蒸發去掉乙醚，60℃或70℃恒溫保存備用；(2)將滅菌注射用水加熱，60℃或70℃恒溫保存備用；(3)60或70℃恒溫下將(1)、(2)所得液體混合，攪拌速率為2000-2400rpm，攪拌時間為1小時，至形成透明均一的溶液，用滅菌注射用水定容至1000ml，然后用均質機在40-60Mpa下反復勻化5-6次，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。2.采用權利要求1所述的一種醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的制備方法制備得到的醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑。全文摘要本發明公開了一種醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑的制備方法，是以醋酸棉酚為活性成分，油酸乙酯或中鏈脂肪酸甘油三酸酯為油相，大豆卵磷脂為表面活性劑，無水乙醇或PEG400為助表面活性劑，滅菌注射用水為水相，其制備步驟如下(1)將醋酸棉酚溶于乙醚，然后與油相、表面活性劑、助表面活性劑混合，減壓蒸發去掉乙醚，恒溫保存備用；(2)將滅菌注射用水加熱，恒溫保存備用；(3)60或70℃恒溫下將(1)、(2)所得液體混合，攪拌至形成透明均一的溶液，定容，然后用均質機反復勻化，用微孔濾膜過濾。本發明的制備方法得到的醋酸棉酚靜脈注射脂肪乳劑經研究表明，具有良好的緩釋和靶向效果，且具有良好的穩定性。文檔編號A61K31/222GK101829053SQ20101016402公開日2010年9月15日申請日期2010年5月6日優先權日2010年5月6日發明者厲保秋申請人:山東大學