專利名稱：抑制鋅指蛋白ZBTB20的miRNA或其前體的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種抑制鋅指蛋白^TB20的miRNA或其前體的應用。
背景技術：
鋅指蛋白作為轉錄調控因子活躍在基因調控領域，參與細胞發育、代謝等調控，與許多發育、代謝疾病及癌癥發生息息相關。根據形成鋅指結構域保守序列的不同，鋅指蛋白主要分為Cys2His2、Cys4和Cys6三個亞型。其中，近幾年發現的^TB20 (Zinc finger and BTBdomain-containing protein 20)，屬于經典 Cys2His2 型鋅指蛋白分類下 POK(含有BTB/POZdomain)蛋白家族，最初由德國cDNA聯盟發現并克隆(GeneBank，accession numberAL050276)。2000年N. Tommerup等運用核放射及熒光原位雜交法將^TB20基因定位到3號染色體ql3. 2帶上。ZBTB20與BCL-6高度同源，可能參與造血、癌癥發生及免疫反應。利用^TB20基因敲除小鼠進行^TB20功能研究，發現^TB20作為一個關鍵的轉錄抑制子調節肝臟中甲胎蛋白AFP(肝癌重要指標之一)的表達。microRNA(miRNA)是非編碼小RNAs的一種，編碼miRNA的基因首先由RNA聚合酶 II轉錄生成初級轉錄本(pri-miRNA)，其發夾結構可被RNA酶III Drosha識別并剪切成為約70個核苷酸長度的發夾狀前體miRNA (pre-miRNA)。前體miRNA在Exportin5的作用下從細胞核轉運至細胞質中，再由另一種RNA酶111 Dicer加工處理成為長約22個核苷酸的成熟miRNA。先前的研究均表明miRNA作為一種新的基因表達調控因子，能夠通過序列特異性結合于靶基因mRNA的3’非翻譯區(3’ un-translated region，3’ UTR)來負調控靶基因的表達，廣泛參與機體內多種生理、病理過程。miRNA通過直接剪切mRNA或抑制mRNA翻譯在轉錄后水平調節基因表達。miRNA的異常表達與惡性腫瘤發生發展過程密切相關，這一事實使越來越多的研究人員著眼于對腫瘤相關miRNA的篩選、靶基因的確定和具體作用機制的研究。預測的miRNA對其靶基因是否存在真正的調控作用還有待實驗方法來證實。熒光報告載體實驗是目前驗證miRNA靶基因的常用方法，即將含有目的miRNA結合位點的靶基因 mRNA 3’UTR片段克隆插人熒光素酶(luciferase)編碼區的下游，構建熒光報告載體，有的學者用EGFP代替熒光素酶構建熒光報告分子，然后采用Western Blot的方法來檢測熒光蛋白表達情況。人類基因組總共表達約700個左右的miRNA，而鋅指蛋白目前發現的Cys2His2型有700多個，假設miRNA作為一種上游的調控因子調控鋅指蛋白的表達進而調控更廣范圍的基因的表達。但是，到目前為止，還沒有出現抑制調控鋅指蛋白^TB20表達的miRNA的報道。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種抑制鋅指蛋白^TB20的miRNA或其前體的應用，可以作為診斷造血系統疾病如肝癌的分子標志物，同時可開發為miRNA小分子藥物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種miRNA或其前體的用途，用于作為診斷造血系統疾病的分子標志物，所述miRNA或其前體包含選自SEQ ID NO :1 7中的序列。由于有證據顯是肝癌指標蛋白甲胎蛋白AFP的有效轉錄抑制子，肝癌病人血中甲胎蛋白含量明顯升高，很可能是由于^TB20量的減少或其活性降低造成，本發明的miRNA或其前體與^TB20能發生特異結合，進而對^TB20進行上游抑制調控。因此，可以將本發明的miRNA或其前體作為診斷造血系統疾病的分子標志物，通過檢測該miRNA或其前體的異常表達來診斷造血系統疾病。在本發明的另一方面，還提供了一種miRNA或其前體的用途，用于制備治療造血系統疾病的藥物，所述miRNA或其前體包含選自SEQ ID NO :1 7中的序列。所述藥物可以施用于因miRNA異常表達引起鋅指蛋調節失控、進而產生的造血系統疾病如肝癌、白血病、或淋巴瘤等。 優選的，所述miRNA選自SEQ ID NO 1 7中的序列，更優選的，所述miRNA選自 SEQ IDNO 1 2中的序列。優選的，所述miRNA前體選自SEQ ID NO :8 11中的序列，更優選的，所述miRNA 前體為SEQID NO 8所示序列。在本發明的另一方面，還提供了一種篩選上述miRNA或其前體的方法，包括以下步驟構建雙熒光報告基因系統，該系統包含靶基因3’UTR載體、以及含有候選miRNA的 miRNA載體，所述靶基因3，UTR載體為含有^TB20基因mRNA的3，UTR序列的載體；用雙熒光報告基因系統轉染細胞；檢測雙熒光，根據熒光數值判斷熒光蛋白的表達水平，若熒光蛋白表達水平降低， 則表明所述候選miRNA能與^TB20靶基因3，UTR結合而抑制^TB20基因翻譯。本發明抑制鋅指蛋白^TB20的miRNA或其前體，可以作為診斷造血系統疾病如肝癌的分子標志物，同時可開發為miRNA小分子藥物。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明實施例2靶基因3’ UTR載體psiCHECK_2及pEZX-MTOl的結構示意圖；圖2是本發明實施例2的miRNA載體pEZX_MR0X的結構示意圖；圖3是本發明實施例2的3，UTR載體pEZX-MT01、psiCheck_2與miRNA載體MROX 系列兼容性試驗柱狀圖；圖4是本發明實施例2的miRNA載體PEZX_MR03aPattL的結構示意圖；圖5是本發明實施例2中mir-21抑制PD⑶4的3’ UTR載體的柱狀圖；圖6是本發明實施例3篩選出的4個miRNA對^TB20_3，UTR的抑制效率柱狀圖；圖7是本發明實施例4的熒光定量PCR結果圖；圖8是本發明實施例5經候選miRNAs處理的細胞內^TB20蛋白水平變化圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學軍，舒躍龍的譯.北京 科學出版社，2004)中所述的方法進行。實施例1 預測針對鋅指蛋白^TB20的miRNAs借助miRNA數據庫miRbase和Targetscan，通過生物信息學預測出針對鋅指蛋白 ZBTB20的43個miRNAs (見下表1)。miRNA數據庫miRbase和Targetscan的網址如下DmiRbase :http://www. mirbase. org/index. shtml (zbtb20 相關頁面http:// www. ebi. ac. uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/detail_view. pi ？ transcript_id = ENST00000357258)；2)Targetscan :http://www. targetscan. org/(zbtb20 相關頁面:http://www. Targetscan.org/cgi_bin/targetscan/vert_50/view_gene.cgi ？ taxid = 9606&gs = ZBTB20&showcnc = O&shownc = 0。表1通過生物信息學預測的針對鋅指蛋白^TB20的43個miRNAs
權利要求
1.一種miRNA或其前體的用途，其特征在于，用于作為診斷造血系統疾病的分子標志物，所述miRNA或其前體包含選自SEQ ID NO :1 7中的序列。
2.—種miRNA或其前體的用途，其特征在于，用于制備治療造血系統疾病的藥物，所述 miRNA或其前體包含選自SEQ ID NO :1 7中的序列。
3.根據權利要求1或2所述的miRNA或其前體的用途，其特征在于，所述miRNA選自 SEQID NO :1 7中的序列。
4.根據權利要求3所述的miRNA或其前體的用途，其特征在于，所述miRNA選自SEQ IDNO 1 2中的序列。
5.根據權利要求1或2所述的miRNA或其前體的用途，其特征在于，所述miRNA前體選自SEQ ID NO :8 11中的序列。
6.根據權利要求5所述的miRNA或其前體的用途，其特征在于，所述miRNA前體為SEQ IDNO 8所示序列。
7.根據權利要求1或2所述的miRNA或其前體的用途，其特征在于，所述造血系統疾病包括肝癌、白血病、或淋巴瘤。
8.一種篩選權利要求1所述miRNA或其前體的方法，其特征在于，包括以下步驟 構建雙熒光報告基因系統，該系統包含靶基因3’ UTR載體、以及含有候選miRNA的miRNA載體，所述靶基因3，UTR載體為含有^TB20基因mRNA的3，UTR序列的載體； 用雙熒光報告基因系統轉染細胞；檢測雙熒光，根據熒光數值判斷熒光蛋白的表達水平，若熒光蛋白表達水平降低，則表明所述候選miRNA能與^TB20靶基因3，UTR結合而抑制^TB20基因翻譯。
全文摘要
本發明公開一種抑制鋅指蛋白ZBTB20的miRNA或其前體作為診斷造血系統疾病的分子標志物的用途，該miRNA或其前體包含選自SEQ ID NO1～7中的序列。本發明還公開了上述miRNA或其前體在制備治療造血系統疾病的藥物中的用途。本發明抑制鋅指蛋白ZBTB20的miRNA或其前體，既可作為肝癌等造血系統疾病的分子標志物，又可開發為miRNA小分子藥物。
文檔編號A61K48/00GK102234687SQ20101016460
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月29日 優先權日2010年4月29日
發明者張佩玲, 楊淑偉 申請人:中國科學院上海生命科學研究院