專利名稱：南瓜蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗腫瘤藥物領域，尤其涉及南瓜蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的疾病，目前臨床常用的化療藥物在殺傷腫瘤 細胞的同時，也很大地損傷了正常組織和細胞，這就限制了它的應用。尋找高效、低毒的治 療腫瘤的藥物已成為當前抗癌藥物研究的方向和迫切任務。從天然物質中尋找抗腫瘤藥物 已被認為是一種有效的途徑，對天然活性物質進行抗腫瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及 誘導凋亡和分化方面進行探索，將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)廣泛存在于高等植物 中，迄今分離到的植物RIP約80余種。植物RIP通常按結構不同分為兩型1型RIP為單鏈 蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多數；II型RIP是通過二硫鍵 連接的雙鏈蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它們是一類RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷 酶，具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學活性。植物RIP抗腫瘤方面的研究早就引起 人們的興趣RIP對腫瘤細胞的殺傷作用遠比對正常細胞的強，尤其是與單克隆抗體交聯 成的免疫毒素對腫瘤細胞具有靶向性和高殺傷效應。而有關RIP抗腫瘤的機制，最初認為 在于RIP的細胞毒作用所致的腫瘤細胞壞死，后來發現是通過誘導腫瘤細胞凋亡產生的。CN 1263107A提供了從南瓜中分離出的類型IRIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公 開了它的制備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為27kDa，等電點pi > 9，具有強烈抑制細 胞內核糖體蛋白質合成的活性。南瓜蛋白已長出可供χ-射線衍射用的單晶，晶體結構分 析結果指出，南瓜蛋白與天花粉蛋白具有結構同源性[Chen et al. Acta Cryst. D562000, 665-666 ；Shi etal =Chinese J. struct, chem. 2003, 22 (2), 165-168] CN 1603340A 提供了 南瓜蛋白具有RNA N糖苷酶活性和體外抑制白血病細胞增殖的抗腫瘤活性。本發明是基于上述現有技術基礎，通過實驗證實了南瓜蛋白對體外培養的實體瘤 細胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宮頸癌和肺癌 等)具有顯著的抑制作用，而對人正常肝細胞株L02及外周血淋巴細胞的影響小，表現出明 顯的選擇性。通過細胞形態觀察、細胞增殖周期分析及瓊脂糖凝膠電泳測定等研究發現，南 瓜蛋白對胃癌、肝癌和黑色素瘤等實體瘤細胞具有誘導凋亡的作用。此外，以黑色素瘤B16 細胞為模型，通過細胞形態觀察、流式細胞儀分析及黑色素含量測定等研究發現，南瓜蛋白 對黑色素瘤細胞尚具有誘導分化的作用；對腫瘤細胞的誘導凋亡和誘導分化作用同時存 在，但低濃度時以誘導分化為主，而高濃度時則具有顯著的誘導凋亡的作用。我們首次發現 南瓜蛋白能誘導腫瘤細胞分化，誘導分化是其抗腫瘤的新機制。南瓜蛋白對腫瘤細胞的誘 導凋亡和誘導分化作用是其抗腫瘤活性的重要機制。
發明內容
本發明的目的是通過研究南瓜蛋白在體內外的抗腫瘤活性，提供南瓜蛋白在抗腫 瘤制藥中的應用采用溫和的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、DEAE-纖維素過濾、CM-纖維素或 SP-瓊脂糖等強或弱的陽離子凝膠介質二次離子交換層析分離，可以從南瓜果肉中分離到 南瓜蛋白，SDS-PAGE檢測分子量為27kDa。層析純的南瓜蛋白(純度>97%)經過濾除菌 后用于實驗。本發明提供了南瓜蛋白作為制備治療肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、黑色素瘤 藥物的應用。
具體實施例方式下面用具體的實施例來說明南瓜蛋白的藥效作用和有益效果實施例1 南瓜蛋白對體外培養的腫瘤細胞的增殖抑制作用及對人正常細胞的影 響取對數生長期的腫瘤細胞(胃癌細胞SGC·，肝癌細胞！fepG2、Bel74tl4,非小細胞肺 癌細胞A549，乳腺癌細胞MCF-7及黑色素瘤細胞B16)和人正常肝細胞L02接種于96孔培 養板上，每孔接種量分別為3000 4000個/100 μ L和6000個/100 μ L ；無菌采集健康獻 血者靜脈血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640配制單個細胞懸夜，調細胞濃度為2 X IO5個/mL，接種于96孔培養板，每孔 IOOyL0上述各培養板細胞培養24h后，實驗組加不同濃度的南瓜蛋白100 μ L，每個濃度 做三個復孔；陰性對照組加營養液100μ 1，空白對照孔加營養液IOOyL,用于儀器調零。作 用不同時間(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20 μ L，繼續培養4h，甩去上清，每孔加 二甲亞砜150 μ L。用酶標儀(BI0-RAD產品)測定570nm各孔的吸光度值(A57tl),各組取平 均值，計算抑制率抑制率=(I-實驗組A57tl/對照組A57tl) X 100%。用SPSS12. 0進行統計 學分析，并計算IC5(I。結果南瓜蛋白對上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及黑色素瘤 細胞均具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性和時間依賴性，其48h的IC5tl從9. 77到 36. 91 μ g/mL, 72h的IC5tl從1. 94 μ g/mL到13. 54 μ g/mL ；而南瓜蛋白對人正常肝細胞和外 周血淋巴細胞抑制作用較小，其48h的IC50分別> 80 μ g/mL和> 40 μ g/mL, 72h的IC50分 別為27. 30 μ g/mL和> 40 μ g/mL (表1)。可見南瓜蛋白對腫瘤細胞具有明顯的選擇性抑制 作用。表1南瓜蛋白對腫瘤細胞及正常細胞的半數抑制濃度
權利要求
1.南瓜蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
全文摘要
南瓜蛋白在制藥中的應用，能夠從南瓜果肉中分離出一種核糖體失活蛋白—南瓜蛋白，該蛋白顯示了良好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。南瓜蛋白能顯著抑制體外培養的胃癌細胞SGC7901，肝癌細胞HepG2、Bel7404，非小細胞肺癌細胞A549，乳腺癌細胞MCF-7及黑色素瘤細胞B16，而對人正常肝細胞和外周血淋巴細胞的抑制作用較小，表現出明顯的選擇性；南瓜蛋白亦能在小鼠體內明顯抑制宮頸癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等動物移植瘤。此外，本發明也證實了南瓜蛋白對腫瘤細胞的誘導凋亡和誘導分化作用是其抗腫瘤活性的重要機制。
文檔編號A61P35/00GK102038934SQ20101016668
公開日2011年5月4日 申請日期2005年11月3日 優先權日2005年11月3日
發明者謝捷明, 陳明晃 申請人:中國科學院福建物質結構研究所, 福建醫科大學