專利名稱：吲哚咔唑和雙吲哚馬來酰亞胺生物堿及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有蛋白激酶C(PKC)抑制活性并具有抗腫瘤作用的吲哚咔唑和雙吲哚馬來酰亞胺生物堿，本發明公開了其制備方法，及其在腫瘤治療的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類生命健康的重大疾病，其發病率每年成上升趨勢。傳統的細胞毒類藥物多存在療效差、毒副作用大、易產生耐藥性等問題，限制其臨床使用。近年來，針對細胞受體、關鍵基因和調控分子的分子靶向藥物，特別是多靶點聯合阻斷細胞信號傳導的藥物開發成為抗腫瘤藥物新的發展方向。研究表明，蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)在多種腫瘤細胞中高表達，對腫瘤細胞的生長、增殖和分化起重要作用，是重要的細胞信號傳導分子(Jussi K.，Vesa A.，Juha P.，Protein kinase C(PKC)family in cancerprogression，Cancer Lett.2006，235，1-10；Hoffman J.The potential for isoenzyme-selective modulation ofprotein kinase C，FASEB J.1997，11649-669；Czifra G.T.I.，Marincsák R.，et al Insulin-like growthfactor-I-coupled mitogenic signaling in primary cultured human skeletal muscle cells and in C2C12 myoblasts.Acentral role of protein kinase C δ.Cell Signal 2006，181461-1472；Steinberg S.F.，Distinctive activationmechanisms and functions for protein kinase C δ.Biochem 2004，384449-459.)。因此，一些能夠封閉PKC活性、阻斷細胞因子與受體結合、或干擾細胞信號傳導通路的PKC的小分子抑制劑可以開發為新一代的抗腫瘤藥物。目前已有6種吲哚咔唑生物堿類PKC抑制劑進入了I-III期臨床研究，其中Lestaurtinib(Cephalon公司)已被FDA于2006年4月核準作為孤兒藥(患者人數少于20萬人或盛行率小于萬分之一)，用于治療急性骨髓性白血病(AML)，表明此類化合物具有廣闊的成藥前景(ClinicalTrials.gov(a service ofthe US NationalInstitutes of Health).Available at http://clinicaltrials.gov；Further information available athttp://www.cephalon.com；Undevia S.D.，Vogelzang N.J.，et al，Phase I clinical trial of CEP-2563 dihydrochloride，a receptor tyrosine kinase inhibitor，in patients with refractory solid tumors.Invest New Drugs，2004，22，449-458.)。我們從一株新的海洋來源的馬杜拉屬放線菌Actinomadura sp.007的發酵物中發現一個新的吲哚咔唑生物堿ACT-007(ZHD-0501)，具有較強的腫瘤細胞增殖抑制活性，對A549、P388、HL-60和BEL-7402的IC50分別為0.05、0.82、0.69和0.91μM(Xiaoxian Han，Chengbin Cui，Qianqun Gu，Weiming Zhu，HongbingLiu，Jingyan Guand Hiroyuki Osada，ZHD-0501，a novel naturally occurring staurosporine analog fromActinomadura sp 007.Tetrahedron Lett 2005，46(36)6137-6140)。為了獲得活性更好、毒性更低的化合物，我們保留吲哚咔唑母核結構，并在三個氮原子位點進行結構修飾，合成了一系列新的具有細胞毒和PKC抑制活性的吲哚咔唑生物堿的衍生物和與之結構類似的二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物。
發明內容
本發明旨在提供一類吲哚咔唑類化合物以及一類二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物，它們對腫瘤細胞以及調節腫瘤細胞代謝、增長、生殖和分化的關鍵激酶——蛋白激酶C(PKC)具有良好的抑制活性，從而治療與之相關的腫瘤，是潛在的治療癌癥藥物。
本發明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤藥物中的用途。
本發明合成了一類二吲哚取代的馬來酰亞胺類生物堿和一類吲哚咔唑生物堿，其結構如式I、式II所示
其結構特征是式I、式II化合物的基本骨架分別為雙吲哚馬來酰亞胺和吲哚咔唑，其中G1～G8均可代表-H、-OH、-OMe、-NH2、-NO2、-F、-Cl、-Br、-I。X代表-H、-(CH2)nOY、-(CH2)nNH2、-(CH2)nAr(Y＝-H、glycosyl、amino acids，n＝1-4)，R1，R2＝-H、-Et、-(CH2)mCN(m＝1-4)、-CH2OH；藥學上可接受的有機或無機酸的鹽，包括鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、杏仁酸、蘋果酸、樟腦磺酸等；前藥形式如磷酸酯、氨基甲酸酯等，當以這種形式給藥時，其在體內轉變為活性形式起效。
優選的本發明化合物是所述的式I化合物1～7及式II化合物8～10，其中G1～G8＝-H，R1＝-Et、-CH2OH、-CH2CH2CN、-CH2CH2CH2CN，R2＝-H、-CH2OH、-CH2CN、-CH2CH2CN、-CH2CH2CH2CN，X＝-H、-CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2OGlc，結構式分別為
上述發明中優選的吲哚咔唑類衍生物以及二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物是由吲哚和吲哚乙酸經下列化學合成方法制備而得
本發明采用MTT和SRB法測試了式I、式II化合物對HL-60、BEL-7402和A549細胞株的抗腫瘤活性。實驗證實，式I、式II化合物對HL-60腫瘤細胞有較好的增殖抑制作用，對BEL-7402和A549也有一定增殖抑制作用。因此本發明的式I、式II化合物可用作細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑。
采用熒光偏振法測試了化合物對PKC βII的抑制活性，結果表明式I、式II化合物對PKC βII具有一定的抑制作用，其中優選的化合物9對PKC βII的IC50值約3.3μM，故本發明的式I、式II化合物可用作靶向抗腫瘤藥物。
本發明的藥物可以通過口服給藥和注射給藥，也適合其它的給藥方式，如經皮給藥等。藥物可以制成片劑、膠囊、粉劑、顆粒、錠劑、栓劑或口服液或無菌胃腸外懸液等液體制劑形式。還有大或小容量注射劑、凍干粉劑等針劑形式。上述劑型的藥物均可按照藥學領域的常規方法制備。
本發明的式I、式II化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療，載體包括藥學領域常規的稀釋劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
式I、式II化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用于生命科學研究，作為探針應用時，式I、式II化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。
具體實施例方式實施例1化合物1～10的制備 化合物1的制備 i)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)acetic acid(1a)的制備 氬氣保護下，在250mL三口瓶中，加氫化鈉(4g，100mmol，60％分散在石蠟中)，加80mL四氫呋喃在0℃攪拌懸浮，加入30mL四氫呋喃溶解的吲哚-3-乙酸(3.5g，20mmol)，攪拌半小時后，滴加30mL四氫呋喃溶解的碘乙烷(5mL，60mmol)，緩慢升至室溫，反應過夜后，降至0℃下，滴加10滴甲醇，再加適量水至得亮黃色溶液，乙酸乙酯萃取，水層加濃鹽酸后再萃取，合并有機層，并用無水Na2SO4干燥，真空蒸干，后經過硅膠柱分離(石油醚∶乙酸乙酯8∶1)得產物(1a)3.87g，收率95.4％。1H NMR(CDCl3)δ7.59(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.30(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.20(dt，1H，J＝0.9Hz，8.2Hz，Ar-H)，7.10(dt，1H，J＝1.0Hz，8.2Hz，Ar-H)，7.07(s，1H，Ar-H)，4.10(q，2H，J＝7.3Hz，CH3-CH2-)，3.77(s，2H，-CH2-COOH)，1.41(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(CDCl3)δ178.6，135.9，127.6，126.1，121.7，119.2，119.0，109.4，106.0，40.8，31.1，15.4.ESI-MS m/z 202.1[M-H]-. ii)3-(1H-indol-1-yl)propanenitrile(1b)的制備 氬氣保護下，在100mL三口瓶中加氫化鈉(360mg，9.0mmol，60％分散在石蠟中)后加入30mL乙腈，在0℃攪拌懸浮，滴加10mL乙腈溶解的吲哚(702mg，6.0mmol)，攪拌反應30min后，緩慢滴加10mL乙腈溶解的3-溴代丙腈(744μL，9.0mmol)，緩慢升至室溫反應24小時后，將反應液倒入100mL冰水中，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，無水Na2SO4干燥，真空蒸干，硅膠柱分離(石油醚∶乙酸乙酯15∶1)，得無色油狀產物(1b)949mg，收率94％。1H NMR(CDCl3)δ7.65(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.30(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.25(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.15(t，1H，J＝6.8Hz，Ar-H)，7.13(d，1H，J＝3.2Hz，Ar-H)，6.55(d，1H，J＝3.2，Ar-H)，4.42(t，2H，J＝6.9Hz，N-CH2-CH2)，2.78(t，2H，J＝J＝6.9Hz，-CH2-CN).13C NMR(CDCl3)δ135.4，129.1，127.5，122.3，121.6，120.2，117.4，108.7，103.0，42.2，19.2. iii)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleic anhydride(1c)的制備 用60mL CH2Cl2溶解的化合物(1b)(988mg，5.81mmol)，在0℃下滴加5mL CH2Cl2溶解的草酰氯(1107mg，8.72mmol)后反應2h，升至室溫，真空抽干后得黃色晶體。在100mL三口瓶中加入化合物(1a)(1180mg，5.81mmol)，并用15mLCH2Cl2溶解，加入三乙胺(1176mg，11.64mmol)，后在攪拌下將上步所生成的黃色晶體用30mLCH2Cl2溶解(有部分黃色晶體不溶)后導入，反應液由淡黃色變為橙色，瓶中有白霧生成，反應過夜后為深橙紅色，真空抽干溶劑，經硅膠柱分離(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)，得紅色粉末(1c)530mg，收率23％。1H NMR(CDCl3)δ7.84(s，1H，Ar-H)，7.66(s，1H，Ar-H)，7.35(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.34(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.22(dt，1H，J＝1.0Hz，7.3Hz，Ar-H)，7.16(dt，1H，J＝1.4Hz，7.5Hz，Ar-H)，7.11(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.90(dt，1H，J＝1.0Hz，7.8Hz，Ar-H)，6.89(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.82(dt，1H，J＝1.0Hz，7.3Hz，Ar-H)，4.47(t，2H，J＝6.9Hz，N-CH2-CH2-)，4.23(q，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3)，2.85(t，2H，J＝6.9Hz，-CH2-CH2-CN)，1.51(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(CDCl3)δ166.7，166.6，136.2，135.5，132.8，131.5，129.6，126.2，126.0，125.6，123.4，122.9，122.8，122.5，121.3，120.8，116.5，110.0，109.1，106.7，105.0，42.4，41.7，19.0，15.1.ESI-MSm/z 410.2[M+H]+. iv)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleimide(1)制備 在密封的單口瓶中，用4mLDMF溶解化合物(1c)(230mg，0.56mmol)，將HMDS(12mL，57mmol)和MeOH(1.2m L，28.5mmol)混合后，注入到單口瓶中，反應液即由紅色變為淡黃色混濁物，漸變為澄清液，顏色漸變為橙紅色。反應過夜后，倒入25mL冷水中，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，無水Na2SO4干燥，真空蒸干。硅膠柱分離(純氯仿)得橙紅色粉末(1)219mg，收率95％。1H NMR(CDCl3)δ7.75(s，1H，Ar-H)，7.58(s，1H，Ar-H)，7.51(s，1H，N-H)，7.31(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.29(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.16(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.11(t，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.09(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.88(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.85(t，1H，J＝7.4Hz，Ar-H)，6.77(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，4.45(t，2H，J＝6.9Hz，N-CH2-CH2-)，4.20(q，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3)，2.80(t，2H，J＝6.9Hz，-CH2-CH2-CN)，1.48(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(CDCl3)δ171.8，171.7，136.0，135.4，131.7，130.6，129.5，126.6，126.3，125.9，123.0，122.7，122.3，122.2，120.8，120.2，116.7，109.6，108.8，107.3，105.4，42.3，41.5，18.9，15.2.HR-ESIMS[M-H]-m/z 407.1493(計算值407.1508)。
化合物2的制備 以化合物1的制備方法，溴代乙腈為原料，可得2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1-cyanomethyl-1H-indol-3-yl)maleimide(2d)，在15mL反應瓶中加入(2d)(84mg，0.21mmol)和NaHCO3(36mg，0.42mmol)，加入甲醛溶液(1mL，37％)，50℃攪拌反應10小時后倒入冷水中。乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，真空蒸干，硅膠柱分離(石油醚∶乙酸乙酯2∶1)，得紅色粉末的N-hydroxymethyl-2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1-cyanomethyl-1H-indol-3-yl]maleimide(2)60mg，收率67％。1H NMR(CDCl3)δ7.66(s，1H，Ar-H)，7.52(s，1H，Ar-H)，7.30(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.29(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.16(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.10(t，1H，J＝7.6Hz，Ar-H)，6.92(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.90(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.79(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.77(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，5.20(d，2H，J＝7.8Hz，N-CH2-OH)，4.91(s，2H，N-CH2-CN)，4.12(q，2H，J＝7.4Hz，-CH2-CH3)，2.04(s，1H，-OH)，1.41(t，3H，J＝7.4Hz，-CH2-CH3).13C NMR(CDCl3)δ171.7，171.6，136.1，135.7，132.0，130.7，129.7，126.5，126.2，125.0，123.5，122.8，122.5，122.4，121.3，120.6，114.1，109.8，109.2，108.2，105.5，61.7，41.6，34.5，15.3.HR-ESIMS[M+H]+m/z 425.1632(計算值425.1614). 化合物3的制備 i)2-[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]acetic acid(3a)的制備 氬氣保護下，在100mL三口瓶中，加氫化鈉(1.6g，40mmol，60％分散在石蠟中)，40mLDMF在0℃攪拌懸浮，加入10mL DMF溶解的吲哚-3-乙酸(1.4g，8mmol)，攪拌半小時后，滴加10mL DMF溶解的溴丙腈(2.0mL，24mmol)，緩慢恢復至室溫，反應過夜后，降至0℃下，滴加10mL甲醇，再加適量水至得亮黃色溶液，用30ml乙醚萃取，分出有機層，水層用6N鹽酸酸化至弱酸性，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，用無水Na2SO4干燥，真空蒸干，后經硅膠柱分離(石油醚∶乙酸乙酯3∶1)得產物(3a)653mg，收率36％。1H NMR(DMSO-d6)δ12.2(s，1H，-COOH)，7.54(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.53(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，7.34(s，1H，Ar-H)，7.17(t，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，7.06(t，1H，J＝7.5Hz，Ar-H)，4.46(t，2H，J＝6.6Hz，N-CH2-CH2-)，3.66(s，2H，-CH2-COOH)，3.00(t，2H，J＝6.6Hz，-CH2-CH2-CN).13C NMR(DMSO-d6)δ173.4，136.3，128.3，127.5，122.0，119.6，119.6，119.5，110.3，108.6，41.6，31.3，19.2.ESI-MSm/z 227.2[M-H]-. ii)2，3-bis[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleic anhydride(3c)制備 以化合物1c的制備方法，化合物1b(485mg，2.85mmol)、草酰氯(543mg，4.28mmol)、化合物3a(650mg，2.85mmol)和三乙胺(576mg，5.7mmol)為原料制得紅色粉末(3c)472mg，收率41％。1HNMR(DMSO-d6)δ8.06(s，2H，Ar-H)，7.62(d，2H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.08(t，2H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.80(d，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.71(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，4.62(t，4H，J＝6.9Hz，N-CH2-CH2)，3.06(t，4H，J＝6.9Hz，-CH2-CH2-CN).13C NMR(DMSO-d6)δ166.8，136.1，133.3，128.5，126.2，123.0，122.0，121.0，119.0，111.1，105.6，42.1，19.0.ESI-MS m/z 435.2[M+H]+. iii)2，3-bis[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleimide(3)的制備 以化合物1的制備方法，從化合物3c(300mg，0.69mmol)、HMDS(5.8mL，27.6mmol)、MeOH(0.55mL，13.8mmol)制得橙紅色粉末(3)269mg，收率87％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.0(s，1H，NH)，7.94(s，2H，Ar-H)，7.55(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.02(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.77(d，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.65(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，4.59(t，4H，J＝6.4Hz，N-CH2-CH2)，3.04(t，4H，J＝6.4Hz，-CH2-CH2-CN).13C NMR(DMSO-d6)δ173.3，136.0，132.2，128.1，126.7，122.5，121.7，120.5，119.0，110.7，106.3，42.0，19.1.HR-ESIMS[M+H]+m/z 434.1596(計算值434.1617)。
化合物4的制備 i)1-benzyl-1H-indole的合成 在100mL三口瓶中，將NaH(300mg，7.5mmol，60％dispersion in mineral oil)用30mL DMF懸浮，-5℃下緩慢滴加10mL DMF溶解的吲哚(585mg，5mmol)，升至室溫反應30min再降至-5℃。滴加溴化芐(0.89mL，7.5mmol)，滴加完畢，-5℃下攪拌反應30min，反應完全，加入10mL甲醇，后加100mL飽和氯化銨溶液，CH2Cl2萃取(100mL×3)，合并有機層，無水硫酸鈉干燥，真空蒸干，硅膠柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯100∶1)得1.02g乳白色固體的1-benzyl-1H-indole，收率99％。1H NMR(CDCl3)δ7.76(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，7.33-7.38(m，4H，Ar-H)，7.27(dt，1H，J＝0.9Hz，6.8Hz，Ar-H)，7.22(dt，1H，J＝0.9Hz，6.9Hz，Ar-H)，7.20(t，1H，J＝3.2Hz，Ar-H)，7.18(d，2H，J＝6.8Hz，Ar-H)，6.65(dd，1H，J＝0.9Hz，3.2Hz，Ar-H)，5.37(s，2H，Ph-CH2-)。13C NMR(CDCl3)δ137.7，136.5，128.9，128.9，128.4，127.8，127.0，126.9，121.9，121.2，119.7，119.7，109.9，101.9，50.2.ESI-MS m/z 208.2[M+H]+。
ii)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1-benzyl-1H-indol-3-yl)maleic anhyd ride(4c)的制備 以化合物1c的制備方法，從化合物1-benzyl-1H-indole(356mg，1.72mmol)、草酰氯(328mg，2.58mmol)、化合物1a(349mg，1.72mmol)和Et3N(347mg，3.44mmol)為原料，制得紅色固體(4c)299mg，收率39％。1H NMR(DMSO-d6)δ8.02(s，1H，Ar-H)，7.94(s.1H，Ar-H)，7.53(d，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.44(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.33(t，2H，J＝6.4Hz，Ar-H)，7.27(t，1H，J＝6.8Hz，Ar-H)，7.20(d，2H，J＝5.9Hz，Ar-H)，7.11(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.05(t，1H，J＝6.8Hz，Ar-H)，6.91(d，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.88(d，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.75(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.73(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，5.52(s，2H，Ph-CH2-)，4.29(q，2H，J＝6.4Hz，-CH2-CH3)，1.34(t，3H，J＝6.8Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ167.0，166.9，137.9，136.6，136.3，133.9，133.3，129.2，129.2，128.8，128.1，127.8，127.6，127.6，126.2，125.9，122.9，122.8，122.2，122.0，120.8，120.7，111.5，111.1，105.3，104.7，50.0，40.5，15.7.ESI-MS m/z 447.2[M+H]+。
iii)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1-benzyl-1H-indol-3-yl)maleimide(4d)的制備 以化合物1的制備方法，從化合物4c(260mg，0.58mmol)、HMDS(2.44mL，11.7mmol)、MeOH(0.23mL，5.8mmol)制得紅色粉末狀固體(4d)248mg，收率96％。1H NMR(DMSO-d6)δ7.90(s，1H，Ar-H)，7.83(s，1H，Ar-H)，7.46(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.36(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.32(t，2H，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.26(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.17(d，2H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.04(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.97(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.84(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.82(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.65(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.64(t，1H，J＝7.4Hz，Ar-H)，5.49(s，2H，Ph-CH2-)，4.26(q，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3)，1.34(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ173.4，173.4，138.2，136.4，136.0，132.8，132.0，129.1，129.1，128.5，128.0，127.5，127.4，127.4，126.7，126.4，122.4，122.2，121.8，121.7，120.2，120.1，111.1，110.7，106.0，105.4，49.9，41.3，15.8.ESI-MSm/z 446.2[M+H]+。
iv)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl)maleimide 將化合物4d(100mg，0.225mmol)用DMSO(0.85mL)溶解，攪拌條件下，滴加1M的t-BuOK/THF溶液(8.4mL，8.4mmol)，滴加完畢，向反應液中通入O2，鼓泡30min，加飽和氯化銨溶液終止反應，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，無水Na2SO4干燥，真空蒸干。硅膠柱層析分離(CH2Cl2∶乙酸乙酯6∶1)得紅色粉末2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl)maleimide 70.5mg，收率89％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.68(d，1H，J＝1.8Hz，NH-Indole)，10.93(s，1H，NH)，7.76(d，1H，J＝2.8Hz，Ar-H)，7.73(s，1H，Ar-H)，7.46(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.37(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.04(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.98(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.90(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.74(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，6.69(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.62(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，4.23(q，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3)，1.30(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ173.6，173.5，136.6，136.0，131.9，129.9，128.4，127.7，126.6，125.7，122.2，122.1，121.9，121.6，120.1，119.9，112.3，110.6，106.1，105.5，41.2，15.8.ESI-MS m/z 356.1[M+H]+。
v)N-hydroxy-2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1-hydroxy-1H-indol-3-yl)maleimide(4) 以化合物2的制備方法，從2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl)maleimide(100mg，0.28mmol)、NaHCO3(71mg，0.84mmol)制得紅色粉末狀固體(4)111mg，收率95％。1H NMR(DMSO-d6)δ7.99(s，1H，Ar-H)，7.72(s，1H，Ar-H)，7.56(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.49(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.07(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.05(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.02(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.74(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.68(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.64(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.62(t，1H，J＝7.3Hz，-CH2-OH)，6.32(t，1H，J＝6.4Hz，-CH2-OH)，5.61(d，2H，J＝7.3Hz，-N-CH2-OH)，4.98(d，2H，J＝6.4Hz，indole-N-CH2-OH)，4.25(q，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3)，1.30(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ171.6，171.5，136.1，136.0，132.6，132.1，127.8，127.4，126.8，126.4，122.4，122.3，121.9，121.7，120.5，120.3，111.4，110.7，105.7，105.4，69.7，60.8，41.3，15.8.HR-ESIMS[M+H]+m/z416.1598(計算值416.1610)。
化合物5的制備 i)N-methyl-3，4-dibromomaleimide的制備 在50mL兩口瓶中，將NaH(30mg，0.75mmol)用5mL DMF懸浮攪拌，-5℃下滴加5mL DMF溶解的3，4-dibromomaleimide(127.5mg，0.5mmol)，低溫反應30min后，滴加碘甲烷(47μL，0.75mmol)，低溫反應30min，滴加飽和NH4Cl溶液終止反應，CH2Cl2萃取，有機層蒸干，硅膠柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯30∶1)得白色晶體92mg，收率69％。1H NMR(CDCl3)δ3.12(s，3H，-CH3).13C NMR(CDCl3)δ164.1，164.1，129.5，129.5，25.6. ii)N-methyl-3，4-di(1H-indol-3-yl)maleimide的制備 在50mL兩口瓶中置鎂絲(128mg，5.3mmol)，室溫下用5mLTHF懸浮攪拌，滴加溴代乙烷(396μL，5.3mmol)，室溫反應20min后升至45℃反應30min，滴加8mL甲苯溶解的吲哚(622mg，5.3mmol)，反應1h后，緩慢滴加8mL甲苯溶解的N-methyl-3，4-dibromomaleimide(286mg，1.1mmol)，后升至110℃回流2h，降至-5℃下滴加飽和NH4Cl溶液終止反應，乙酸乙酯萃取，有機層濃縮，硅膠柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯3∶1)得紅色固體粉末N-methyl-3，4-di(1H-indol-3-yl)maleimide 263mg，收率73％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.70(s，2H，NH)，7.77(d，2H，J＝2.3Hz，Ar-H)，7.38(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.98(t，2H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.82(d，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.64(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，3.04(s，3H，-CH3).13CNMR(DMSO-d6)δ172.4，136.6，129.7，127.6，125.9，122.2，121.5，119.9，112.3，106.2，24.5.ESI-MSm/z342.1[M+H]+。
iii)3，4-di(1H-indol-3-yl)maleic anhydride的制備 在50mL單口瓶中，用20mL 10％的KOH溶液懸浮N-methyl-3，4-dibromomaleimide(120mg，0.35mmol)，110℃下回流30min后冷卻至室溫，滴加2N鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，真空濃縮，硅膠柱層析分離(純CH2Cl2)得紅色固體104mg，收率90％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.93(d，2H，J＝2.8Hz，NH)，7.86(d，2H，J＝2.8Hz，Ar-H)，7.44(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.04(t，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.87(d，2H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.71(t，2H，J＝7.7Hz，Ar-H).13C NMR(DMSO-d6)δ167.1，136.7，131.1，125.8，125.5，122.6，121.7，120.4，112.7，105.5.ESI-MS m/z 329.1[M+H]+。
iv)3，4-di(1H-indol-3-yl)maleimide的制備 以化合物(1)的制備方法，從3，4-di(1H-indol-3-yl)maleic anhydride(100mg，0.3mmol)、HMDS(6.4mL，30.5mmol)、MeOH(0.61mL，15.2mmol)制得橙紅色粉末3，4-di(1H-indol-3-yl)maleimide 70mg，收率71％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.65(brs，2H，NH)，10.89(brs，1H，NH)，7.72(d，2H，J＝2.8Hz，Ar-H)，7.36(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.96(dt，2H，J＝8.2Hz，1.0Hz，Ar-H)，6.79(d，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.61(dt，2H，J＝8.2，1.0Hz，Ar-H).13C NMR(DMSO-d6)δ173.6，136.4，129.6，128.2，125.9，122.1，121.4，119.8，112.3，106.1.ESI-MS m/z328.2[M+H]+。
v)N，N，N-trihydroxy-3，4-di(1H-indol-3-yl)maleimide(5)的制備 以化合物2的制備方法，從3，4-di(1H-indol-3-yl)maleimide(76.5mg，0.23mmol)、NaHCO3(98mg，1.17mmol)和甲醛溶液制得紅色粉末狀固體(5)96mg，收率99％。1H NMR(DMSO-d6)δ7.95(s，2H，Ar-H)，7.55(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.03(t，2H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.76(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.64(t，2H，J＝7.3Hz，Ar-H)，5.60(s，4H，indole-CH2-OH)，4.98(s，2H，-CH2-OH).13C NMR(DMSO-d6)δ171.6，136.0，132.4，127.6，127.0，122.4，121.5，120.6，111.4，105.9，69.7，60.9.HR-ESIMS[M+Na]+m/z440.1236(計算值440.1222)。
化合物6的制備 i)1，2，3，4，6-penta-O-acetylglucose 在100mL單口瓶中，加葡萄糖(2g，11.1mmol)、無水乙酸鈉(2.5g，30.5mmol)、乙酸酐12.5mL，110℃回流，原料至回流溫度時溶解，反應液澄清，反應5min后又變渾濁，30min后反應完全，趁熱將反應液倒入約100g碎冰中，攪拌產生大量白色固體，冰溶解后抽濾，無水乙醇重結晶，得白色粉末4.1g，收率95％。
ii)2，3，4，6-tetra-O-acetylglucose 在N2保護下，在50mL兩口瓶中，用10mL無水THF溶解1，2，3，4，6-penta-O-acetylglucose(525mg，1.35mmol)，-5℃下滴加芐胺(0.22mL，2.02mmol)，緩慢升至室溫，反應過夜，點板檢測反應完全，真空蒸干，硅膠柱層析(石油醚∶乙酯3∶1)得白色固體441mg，收率94％。
iii)1-O-(2，2，2-trichloro-1-iminoethxyl)-2，3，4，6-tetra-O-acetylglucose 在兩口瓶中N2保護下，用5mLCH2Cl2溶解2，3，4，6-tetra-O-acetylglucose(390mg，1.12mmol)，-5℃下滴加三氯乙腈(1.35mL，13.45mmol)，滴加催化量的DBU，反應液由微黃色變為淺黃色，反應30min后，真空蒸干，硅膠柱層析(石油醚∶乙酯4∶1)得乳白色固體381mg，收率70％。
iv)O-[2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleimiomethyl]-α-D-(2，3，4，6-tetra-O-acetyl)glucopyranosides(6d) 將化合物1-O-(2，2，2-trichloro-1-iminoethxyl)-2，3，4，6-tetra-O-acetylglucose(10mg，22.8μmol)和化合物(1)(7.5mg，15.2μmol)氣泵抽干后加到15mL兩口瓶中，在干燥器中抽3h。分子篩用馬弗爐烘干后粉碎，粉末用酒精噴燈燒30min，氣泵抽冷后加約200mg至反應瓶中，加入5ml干燥的CH2Cl2，氣泵換N2三次，降至-20℃下反應20min，滴加2μL BF3·Et2O，立即由紅色變為紫色，繼而回復紅色，升至室溫反應10h，反應完全。降至-5℃，加10mg NaHCO3終止反應，抽濾，蒸干溶劑，凝膠柱層析(CH2Cl2∶CH3OH 1∶1)得16.7mg紅色固體6d，收率95％。1H NMR(CDCl3)δ7.79(s，1H，Ar-H)，7.61(s，1H，Ar-H)，7.31(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.30(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.17(t，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.11(t，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.08(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，6.86(d，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.85(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.77(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，5.36/5.28(d，2H，J＝11.5Hz，N-CH2-O)，5.19(t，1H，J＝10.0Hz，Glc-C3-H)，5.10(t，1H，J＝10.0Hz，Glc-C2-H)，5.00(t，1H，J＝10.0Hz，Glc-C4-H)，4.86(d，1H，J＝8.2Hz，Glc-C1-H)，4.46(t，2H，J＝7.3Hz，N-CH2-CH2-CN)，4.21(q，2H，J＝7.3Hz，N-CH2-CH3)，4.18/4.03(dd，2H，J＝2.8Hz，12.4Hz，Glc-C6-H2)，3.70(dt，1H，J＝3.7Hz，10.1Hz，Glc-C5-H)，2.82(t，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CN)，1.94-1.99(s，12H，4-COCH3)，1.49(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(CDCl3)δ171.4，171.3，170.8，170.4，169.5，169.4，136.2，135.5，131.9，130.9，129.0，126.5，125.9，125.8，123.2，122.8，122.5，122.4，121.0，120.5，116.8，109.8，109.0，107.3，105.5，100.0，73.0，72.1，71.2，68.1，66.2，61.6，42.4，41.6，20.8，20.7，20.6，20.6，19.0，15.3.ESI-MSm/z791.4[M+Na]+。
v)O-[2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleimiomethyl]-α-D-glucopyranoside(6) 在單口瓶中，將樣品6d用1mLCH2Cl2溶解，加4mL無水甲醇，0℃攪拌下滴加NaOMe/MeOH，至pH 9～10，升至室溫反應30min，點板反應完全，0℃下加飽和NH4Cl溶液終止反應。乙酸乙酯萃取，蒸干，凝膠柱層析(CH3OH)分離得紅色固體，收率100％。1H NMR(DMSO-d6)δ7.94(s，1H，Ar-H)，7.87(s，1H，Ar-H)，7.60(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.48(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.06(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.04(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，6.82(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，6.78(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，6.68(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，5.20/5.14(d，2H，J＝11.0Hz，N-CH2-O)，5.10(d，1H，J＝5.5Hz，Glc-C1-H)，4.99(d，1H，J＝3.7Hz，Glc-C2-OH)，4.92(d，1H，J＝3.7Hz，Glc-C3-OH)，4.60(t，2H，J＝6.7Hz，N-CH2-CH2-)，4.47(t，1H，J＝6.0Hz，Glc-C6-OH)，4.41(d，1H，J＝8.2Hz，Glc-C4-OH)，4.27(q，2H，J＝7.3Hz，N-CH2-CH3)，3.62(m，1H，Glc-C2-H)，3.48(m，1H，Glc-C3-H)，3.11(m，2H，Glc-C6-H2)，3.09(m，1H，Glc-C4-H)，3.04(t，2H，J＝6.7Hz，-CH2-CN)，2.95(m，1H，Glc-C5-H)，1.34(t，3H，J＝7.3Hz，N-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ171.5，171.4，136.1，136.0，132.5，132.4，128.4，126.7，126.4，126.3，122.6，122.4，122.0，121.8，120.5，120.4，119.0，110.9，110.7，106.2，105.3，103.0，77.6，77.3，73.8，70.2，66.2，61.4，41.9，41.3，19.1，15.8.HR-ESIMS[M+Na]+m/z623.2139(計算值623.2118)。
化合物7的制備 i)2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl))maleic anhydride(7c)的制備 在50mL單口瓶中，用20mL 10％的KOH溶液懸浮化合物2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl)maleimide(50mg，0.14mmol)，110℃下回流40min后冷卻至室溫，滴加2N鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，真空濃縮，硅膠柱層析分離(純CH2Cl2)得紅色固體(7c)43mg，收率86％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.96(s，1H，NH)，7.89(d，1H，J＝2.8Hz，Ar-H)，7.83(s，1H，Ar-H)，7.52(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.44(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.10(t，1H，J＝7.4Hz，Ar-H)，7.05(t，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.98(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.78(t，1H，J＝7.6Hz，Ar-H)，6.77(d，1H，J＝7.6Hz，Ar-H)，6.70(t，1H，J＝7.1Hz，Ar-H)，4.25(q，2H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3)，1.30(t，3H，J＝7.3Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ167.1，167.0，136.8，136.2，133.1，131.3，128.7，127.9，126.1，125.2，122.7，122.7，122.2，121.9，120.7，120.5，112.8，111.0，105.5，104.8，41.4，15.7.ESI-MS m/z 357.1[M+H]+。
ii)N-(2-aminoethyl)-2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl)maleimide(7)的制備 在10mL單口瓶中，用2mL DMF將化合物7c(40mg，0.11mmol)溶解，攪拌下加入乙二胺(75μL，1.1mmol)，反應液由紅色變為橙黃色，室溫反應過夜，又恢復橙紅色，水與乙酸乙酯萃取，有機層蒸干，硅膠柱層析分離(CH2Cl2∶CH3OH10∶1)得紅色固體(7)42.5mg，收率95％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.89(brs，1H，NH)，7.80(s，1H，Ar-H)，7.72(s，1H，Ar-H)，7.47(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.41(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.05(t，1H，J＝7.1Hz，Ar-H)，6.99(t，1H，J＝7.1Hz，Ar-H)，6.97(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.75(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.72(t，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，6.63(t，1H，J＝7.1Hz，Ar-H)，4.3-4.7(brs，2H，-NH2)，4.23(q，2H，J＝7.1Hz，-CH2-CH3)，3.73(t，2H，J＝6.6Hz，-CH2-CH2-NH2)，2.97(t，2H，J＝6.6Hz，-CH2-CH2-NH2)，1.30(t，3H，J＝7.1Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ172.3，172.2，136.7，136.0，131.9，129.9，127.8，127.0，126.6，125.5，122.3，122.2，122.1，121.7，120.1，119.9，112.5，110.7，106.1，105.6，41.2，39.4，38.5，15.8.HR-ESIMS[M+H]+m/z399.1826(計算值399.1821)。
化合物8的制備 在敞口石英瓶中，用1.0L丙酮溶解化合物2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-[1-(2-cyanoethyl)-1H-indol-3-yl]maleimide(1)(50mg，0.12mmol)，加催化量的I2，在250W汞燈下照射攪拌24h，真空蒸去大部分溶劑后倒入到100mL飽和的Na2S2O3溶液中，攪拌10min，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，無水Na2SO4干燥，真空蒸干，硅膠柱分離(石油醚∶乙酸乙酯3∶1)，得黃色熒光粉末3-(13-ethyl-5，7-dioxo-6，7-dihydro-5H-indolo[2，3-a]pyrrolo[3，4-c]carbazol-12(13H)-yl)propanenitrile(8)42mg，收率87％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.21(s，1H，N-H)，9.14(d，1H，J＝6.9Hz，Ar-H)，9.13(d，1H，J＝6.9Hz，Ar-H)，7.98(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.92(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.67(t，1H，J＝6.9Hz，Ar-H)，7.66(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，7.47(t，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，7.44(t，1H，J＝7.3Hz，Ar-H)，5.06(t，2H，J＝6.4Hz，N-CH2-CH2-)，4.73(q，2H，J＝6.9Hz，-CH2-CH3)，2.69(t，2H，J＝6.4Hz，-CH2-CH2-CN)，1.06(t，3H，J＝6.9Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ171.2，171.2，144.9，143.7，133.5，133.1，128.3，128.2，125.6，125.4，124.3，124.0，122.6，122.0，121.9，121.2，120.9，120.8，118.3，113.4，113.3，44.1，43.9，16.5，14.0.HR-ESIMS[M-H]-m/z405.1337(計算值405.1352)。
化合物9的制備 i)12-ethyl-12，13-dihydro-5H-indolo[2，3-a]pyrrolo[3，4-c]carbazole-5，7(6H)-dione(9e) 在250mL單口瓶中，將化合物2-(1-ethyl-1H-indol-3-yl)-3-(1H-indol-3-yl)maleimide(400mg，1.13mmol)、DDQ(282mg，1.24mmol)、p-TsOH(214mg，1.13mmol)用100mL苯溶解，N2保護條件下回流30min，蒸干溶劑，100mL乙酸乙酯重新溶解，分別用飽和NaHSO3溶液、水、鹽洗，有機層用無水Na2SO4干燥，蒸干，凝膠柱層析分離(CH2Cl2∶MeOH 1∶1)得黃色粉末(9e)280mg，產率70％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.91(s，1H，NH)，10.99(s，1H，NH)，9.08(d，1H，J＝6.6，16.3.Hz，Ar-H)，9.07(t，1H，J＝7.2Hz，Ar-H)，7.78(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.72(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.55(t，1H，J＝7.2Hz，Ar-H)，7.54(t，1H，J＝7.2Hz，Ar-H)，7.34(d，1H，J＝7.7Hz，Ar-H)，7.33(t，1H，J＝7.2Hz，Ar-H)，4.88(q，2H，J＝6.6Hz，-CH2-CH3)，1.40(t，3H，J＝6.6Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ171.7，171.6，141.6，141.0，139.7，129.7，128.6，127.3，125.5，125.2，124.9，121.8，121.5，120.7，120.5，120.3，117.3，116.4，112.5，110.1，39.6，16.3.ESI-MSm/z354.1[M+H]+。
ii)12-ethyl-6-(hydroxymethyl)-12，13-dihydro-5H-indolo[2，3-a]pyrrolo[3，4-c]carbazole-5，7(6H)-dione(9) 將化合物9e(100mg)用4ml甲醛溶液懸浮，85℃下攪拌反應48h，乙酸乙酯和水萃取，有機層用無水Na2SO4干燥，蒸干。硅膠柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯2∶1)得黃色粉末(9)110mg，產率98％。1H NMR(DMSO-d6)δ12.06(s，1H，NH)，9.15(d，1H，J＝7.8Hz，Ar-H)，9.12(d，1H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.85(d，1H，J＝8.7Hz，Ar-H)，7.83(d，1H，J＝8.3Hz，Ar-H)，7.64(dt，1H，J＝1.4Hz，7.5Hz，Ar-H)，7.60(dt，1H，J＝1.4Hz，7.6Hz，Ar-H)，7.41(dt，1H，J＝1.0Hz，6.9Hz，Ar-H)，7.39(dt，1H，J＝1.0Hz，6.9Hz，Ar-H)，6.36(t，1H，J＝6.8Hz，-OH)，5.09(d，2H，J＝6.8Hz，-CH2-OH)，4.97(q，2H，J＝6.9Hz，-CH2-CH3)，1.45(t，3H，J＝6.9Hz，-CH2-CH3).13C NMR(DMSO-d6)δ169.1，169.1，141.2，140.6，129.3，128.2，127.1，127.1，124.5，124.1，121.1，120.9，120.5，120.4，118.8，118.6，116.9，116.0，112.2，109.9，59.9，40.1，15.7.HR-ESIMS[M-H]-m/z 382.1189(計算值382.1192)。
化合物10的制備 以化合物3的制備方法，用溴代丁腈為原料，可得2，3-bis[1-(3-cyanopropanyl)-1H-indol-3-yl]maleimide(10d)。以化合物8的制備方法，從化合物10d(50.0mg，0.108mmol)、I2(2.0mg，0.008mmol)制得黃色粉末4，4′-(1，3-dioxo-2，3-dihydro-1H-indolo[2，3-a]pyrrolo[3，4-c]carbazole-8，9-diyl)dibutanenitrile(10)23mg，收率45％。1H NMR(DMSO-d6)δ11.2(s，1H，NH)，9.14(d，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.89(d，2H，J＝8.2Hz，Ar-H)，7.66(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.44(t，2H，J＝7.8Hz，Ar-H)，4.81(t，4H，J＝6.9Hz，N-CH2-CH2-)，2.13(t，4H，J＝6.9Hz，-CH2-CH2-CN)，1.71(m，4H，-CH2-CH2-CH2-).13C NMR(DMSO-d6)δ171.2，144.3，133.2，128.1，125.5，123.9，122.2，121.6，120.5，120.2，113.3，47.5，24.2，14.2.HR-ESIMS[M-H]-m/z 458.1604(計算值458.1617)。
實施例2抗腫瘤活性的測試 1細胞毒活性 1.1測試方法 被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中合成的單體化合物1～10。準確稱取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測試。
細胞系及細胞的繼代培養活性測試采用A549、BEL-7402和HL-60細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養基，在37℃通入5％二氧化碳的培養箱中繼代培養。
細胞增殖抑制活性測試方法 本發明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對HL-60癌細胞增殖的抑制活性。活細胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量與活細胞數成正比，所以可根據吸收度求出活細胞的數目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。活性測試時，取對數生長期的HL-60細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升5×104個細胞的細胞懸液，按每孔200μL接種于96孔板中，在37℃下培養24小時后，每孔加入2μL不同濃度的樣品溶液，繼續培養72小時。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養4小時，移出150μL培養液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
本發明采用SRB法，測試評價了被測試樣品對A549和BEL-7402癌細胞增殖的抑制活性。SRB是一種蛋白質結合染料，可與生物大分子中的堿性氨基酸結合，其結合產物在515nm波長的OD讀數與細胞數呈良好的線性關系，故可用作細胞數的定量。取對數生長期的A549和BEL7402，用新鮮的RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔200μL接種于96孔板中，每孔加入2μL不同濃度的樣品溶液，32℃下培養17h。然后每孔加入80％三氯醋酸50μL，置于4℃固定1h，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50μL并在室溫靜置30min。用1％醋酸水清洗4次，除去未結合的游離SRB染料。每孔加入150μLTris緩沖液(10mmol/L，pH 10.5)溶解蛋白結合染料，在520nm處測定其吸收度。按照IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
1.2實驗結果 由活性測試結果發現，雙吲哚馬來酰亞胺化合物的活性比其關環后得到的相應的吲哚咔唑化合物的抗腫瘤活性強，可能與后者水溶性差，分子柔性小有關。此外，取代基的長短對活性有一定的影響，當取代基長度適中時，活性最佳。
表1.化合物1～10的對人腫瘤細胞的增殖抑制活性(IC50，μM)
2PKC抑制活性測試利用熒光偏振方法，測試化合物對蛋白激酶PKC βII的抑制活性，結果表明MDZ-03(9)對PKC βII具有明顯抑制作用，其IC50值約3.3μM。
3結論 化合物1～10對人來源的癌細胞具有抗腫瘤作用，其中化合物1、3對HL-60細胞表現出較強的抑制活性，化合物9還具有較強的PKC βII的抑制活性，預示著其在預防和治療腫瘤藥物方面具有廣泛的前景。因此，本發明的式I、式II化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現象本質的生命科學實驗研究中。
權利要求
1.式I、式II化合物
其中G1～G8均可代表-H、-OH、-OMe、-NH2、-NO2、-F、-Cl、-Br、-I。X代表-H、-(CH2)nOY、-(CH2)nNH2、-(CH2)nAr(Y＝-H、Glycosyl、amino acids，n＝1-4)，R1，R2＝-H、-Et、-(CH2)mCN(m＝1-4)。
2.權利要求1所述的式I、式II化合物的藥學上可接受的有機或無機酸的鹽。例如可以由鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、杏仁酸、蘋果酸、樟腦磺酸以及類似的已知可以接受的酸形成鹽。
3.權利要求1所述的式I、式II化合物的前藥形式，如磷酸酯、氨基甲酸酯等，當以這種形式給藥時，其在體內轉變為活性形式起效。
4.權利要求1所述的式I、式II化合物，其中化合物1-10的G1～G8為氫，R1＝-Et、-CH2OH、-CH2CH2CN、-CH2CH2CH2CN，R2＝-H、-CH2OH、-CH2CN、-CH2CH2CN、-CH2CH2CH2CN，X＝-H、-CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2OGlc，結構式分別為
5.權利要求1所述的二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物(I)的制備方法，其特征在于按以下步驟進行帶有氮位烷基取代的吲哚與氮位具有烷基取代的吲哚乙酸發生Perkin縮合反應得到通式I中N-X為氧原子取代的該類化合物，其它該類衍生物由所得到的通式I中N-X為氧原子取代的化合物進行氨解和羥甲基化得到。
6.權利要求1所述的吲哚咔唑衍生物(II)的制備方法，其特征在于按以下步驟進行得到的二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物(I)，進行光照環化或DDQ氧化環化反應得到。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于按以下步驟進行①將吲哚與不同的烷基化(包括芐基)試劑反應得到氮位烷基取代的吲哚；②將吲哚乙酸與不同的烷基化試劑反應得到氮位烷基取代的吲哚乙酸；③得到的氮位烷基取代的吲哚利所得到氮位烷基取代的吲哚乙酸在草酰氯、三乙胺、二氯甲烷條件下發生Perkin縮合得到通式II中N-X為氧原子取代的該類化合物；④得到的通式I中N-X為氧原子的該類化合物在六甲基二硅胺脘(HMDS)、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇條件下氨解或在其它相應條件下氨解，以及隨后對其進行羥甲基化修飾得到二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物(I)；⑤芐基保護的通式I化合物采用與O2、DMSO、t-BuOK/THF氧化脫除芐基。
8.權利要求6所述的制備方法，其特征在于按以下步驟進行得到的二吲哚取代的馬來酰亞胺衍生物(I)，在丙酮、高壓汞燈光照以及碘單質作為催化劑的條件下進行光照環化反應得到，或者在對甲基苯磺酸的催化下，在苯溶劑中與DDQ發生氧化關環得到。
9.權利要求1所述的式I、式II化合物在制備細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑及其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及吲哚咔唑和雙吲哚馬來酰亞胺類生物堿及其制備方法和用途。本發明從吲哚和吲哚乙酸出發，經化學反應制備了結構新穎的上述類型的化合物。經實驗證實，該類化合物具有腫瘤細胞毒活性和蛋白激酶C(PKC)抑制活性，可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號A61K31/404GK101812097SQ20101016711
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月17日 優先權日2010年4月17日
發明者朱偉明, 徐志紅, 張亞鵬, 王乂, 劉培培 申請人:中國海洋大學