胎盤干細胞抗腫瘤疫苗及其制備方法與應用的制作方法

專利名稱：胎盤干細胞抗腫瘤疫苗及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學工程技術，特別是一種用胎盤干細胞制作的抗腫 瘤疫苗以及該疫苗的制備方法與應用背景技術無論是在發展中國家還是發達國家，惡性腫瘤依然是一類常見的疾 病，其發病率與死亡率居高不下，甚至有增無減，仍然是威脅人類生存的頭號殺手，嚴重干 擾患者的健康和影響生存質量。目前治療腫瘤的技術方法有化療、放療、手術與生物治療四 大模式。化療對患者有著嚴重的毒副作用，例如骨髓抑制，包括粒細胞減少等；臟器損傷，包 括腎臟，肝臟等的嚴重毒副作用；消化道反應，包括食欲減退、惡心、嘔吐等；此外還包括脫 發、局部組織壞死、靜脈炎等。放療的毒副作用主要表現在皮膚、粘膜放射性潰瘍及縻爛；對 眼睛、骨骼、肺等也存在嚴重副作用。腫瘤的手術治療也存在許多不足，包括創面大、易伴發 感染、出血等嚴重副作用。腫瘤的生物治療目前比較熱門的包括細胞因子治療、基因治療、 免疫治療等。腫瘤細胞因子治療的缺點主要是制備過程繁瑣，細胞本身具有毒副作用。基 因治療的主要缺點包括基因載體構建困難、載體的毒副作用，以及基因轉染效率低等。目前 對腫瘤疫苗的研究，主要包括樹突狀細胞腫瘤疫苗，但該疫苗制作過程繁瑣、且在大多數腫 瘤中，沒有可被樹突狀細胞呈遞的供T細胞識別的抗原決定簇。這些局限性導致其應用很 有限，且預防腫瘤形成的效果不明顯。因此，尋求效果更佳的策略和方案一直是惡性腫瘤預 防與治療學研究的重要課題。發明內容本發明正是為了克服上述現有技術中的不足之處，而提供一種在腫瘤 建立之前可以起到疫苗防御作用的，使機體對腫瘤干細胞產生特異性免疫抗體與致敏淋巴 細胞，抑制腫瘤干細胞生長與遷徙，從而達到阻斷體內腫瘤形成與轉移的細胞生物制劑胎 盤干細胞抗腫瘤疫苗及其制備方法與應用。越來越多證據表明腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是腫瘤形成的起始 細胞與腫瘤轉移的先鋒細胞，同時也為腫瘤復發的根源。由于腫瘤干細胞免疫原性低下， 對機體免疫系統持續刺激易于誘導免疫耐受，從而有利于腫瘤產生與轉移形成，刺激機體 打破對腫瘤干細胞的免疫耐受，產生特異免疫抗體與致敏淋巴細胞，抑制腫瘤干細胞增生， 可能成為將來防治腫瘤的有效新途徑。近期研究表明，間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)與腫瘤干細胞之間有許多類似的生物學特征包括免疫原性與反應原性，二 者之間可能具有交叉免疫性。間充質干細胞可通過免疫原性的提高，從而打破免疫系統 對腫瘤干細胞的免疫耐受。人胎盤衍生的干細胞(human placenta-derivedstem cells, hPDSCs)更是近幾年備受關注的研究領域，hPDSCs來源于孕產婦生產過程中的胎盤，屬 于人體遺棄組織，取材方便、來源充足，沒有倫理及法律方面的制約；先期研究結果表明 hPDSCs具有間充質干細胞的生物學性狀。人胎盤干細胞有著和其他來源的間充質干細胞 相似的生物學特征，具有大規模培養的可能，可以為腫瘤生物學防治提供潛在的理想方法。 hPDSCs在形態上與骨髓MSC類似，光學顯微鏡下胎盤干細胞呈長梭形，為典型的成纖維細 胞樣，排列規則，經2周后逐漸形成扁平單層細胞，并呈漩渦狀或成簇生長(參見說明書附 圖1)，隨著細胞密度的增加，胞體變得細長，形態類似成纖維細胞。本發明的任務是這樣實現的胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，是在Iml的小凍存管中保存有培養8代后的胎盤干細胞，每只小凍存管含胎盤干細胞抗腫瘤疫苗和人AB血清，總體 積為200μ 1，其中胎盤干細胞數量為5X IO5個，置于-80°C冰箱保存待用。上述胎盤干細胞抗腫瘤疫苗的制備方法，其操作是在無菌條件下進行，分為四個 步驟(1)處理胎盤組織，(2)胎盤干細胞的獲取，(3)胎盤干細胞的培養并傳代8次，(4) 制作胎盤干細胞抗腫瘤疫苗。胎盤干細胞抗腫瘤疫苗的應用是生產直接用于抑制腫瘤的發生、發展和轉移，預防和治療腫瘤的疫苗。本發明的胎盤干細胞抗腫瘤疫苗的使用選擇在腫瘤發生之前，即在 動物模型上，我們先定期對動物接種疫苗，注射部位選擇背側部右后方皮下，為了避免短期 重復免疫而使機體產生免疫耐受，第一次與第二次接種疫苗的時間間隔為1 2周，第二次 與第三次疫苗接種間隔為1周，一共接種疫苗3次，以加強小鼠對干細胞的免疫功能，第三 次接種后間隔1周接種腫瘤細胞。


以下是本發明說明書附圖的圖面說明圖1是本發明分離的人胎盤干細胞(hPDSCs)的形態。圖2是本發明抗成瘤比較_肺癌模型，實驗組應用胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，腫瘤體 積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤。圖3是本發明抗成瘤比較-乳腺癌模型，實驗組應用胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，腫瘤 體積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤。圖4是本發明抗成瘤比較_結腸癌模型，實驗組應用胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，腫瘤 體積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤.圖5是抗成瘤比較_黑色素瘤模型，實驗組應用胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，腫瘤體積 明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤。圖6是本發明實驗組雖經多次加強免疫，相關內臟仍無明顯異常，但脾呈顯著免 疫增生反應。本發明與現有技術相比具有如下優點1.應用胎盤干細胞，作用于成瘤前的機體，誘導體內產生針對腫瘤干細胞的抗體 與致敏淋巴細胞，從而使機體免于腫瘤的發生；2.可以用于多種腫瘤，如肺癌、乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤等的防治；3.可以抑制多種腫瘤的生長和轉移，延長荷瘤小鼠的生存期，抑瘤率可以達到 70%以上；4.人胎盤衍生的干細胞(hPDSCs)來源于孕產婦生產過程中的胎盤，屬于人體遺 棄組織，取材方便、容易獲取，資源豐富，沒有倫理及法律方面的制約，具有大規模培養的可 能，為腫瘤生物學治療提供潛在的理想方法。
具體實施方式
本發明以下將結合實施例和說明書附圖作進一步詳述實施例1. 一種胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，是在Iml的小凍存管中保存有培養8代后 的胎盤干細胞，每只小凍存管含胎盤干細胞抗腫瘤疫苗和人AB血清，總體積為200μ 1，其 中胎盤干細胞數量為5 X IO5個，置于-80°C冰箱保存待用。實施例2.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗的制備方法其操作是在無菌條件下進行，分為四個步驟(1)處理胎盤組織，(2)胎盤干細胞 的獲取，(3)胎盤干細胞的培養并傳代8次，(4)制作胎盤干細胞抗腫瘤疫苗。以下分這四個步驟詳細說明(1)處理胎盤組織取足月生產的胎盤組織(捐獻者均簽署知情同意書，并經過醫院倫理委員會同意)，將胎盤組織剪碎成IcmX IcmX Icm大小，用總體積2L的D-Hank’ s平 衡鹽溶液，沖洗3次，直接用濾網過濾后收集胎盤組織。(2)胎盤干細胞的獲取取上述收集到的胎盤組織用0. 25%胰蛋白酶10ml37°C消 化5min，終止消化后，200目濾網過濾，收集單細胞。參見說明書附圖1就是本發明分離的 人胎盤干細胞(hPDSCs)的形態。(3)胎盤干細胞的培養將上述單細胞用D-Hank’ s平衡鹽溶液35ml洗一遍，加入 配好的含5%人AB血清的DMEM培養基，調整培養細胞濃度為4X IO5個/ml，接種于75cm2 的培養瓶內，置于37°C，5% CO2,飽和濕度95%的培養箱培養，每3 4天進行換液，即將培 養瓶中培養基倒出，換為新鮮配制的培養基，當胎盤干細胞生長至培養瓶壁70% 80%， 單層，即吸盡培養基，加入2 3ml的0. 25%胰酶，消化3 5min，在倒置顯微鏡下觀察，當 90%的細胞漂浮變圓時，加入大于2倍于胰酶體積的培養基終止消化，并用彎管吹打混勻， 轉移到15ml離心管中，離心1500rpm，3min，棄上清，加少許培養基混勻，分裝入2 4個裝 有約IOml培養基的75cm2培養瓶中，擴大培養，3 4天傳代1次，直至傳代8次。(4)制作胎盤干細胞抗腫瘤疫苗當傳代8次后的胎盤干細胞生長至培養瓶壁 70% 80%，單層，即按上述步驟消化細胞，離心，棄上清后，加入人AB血清，將細胞吹散混 勻，并將細胞濃度調至2. 5 X 106/ml，按照200 μ 1，即5 X IO5個胎盤干細胞，分裝于Iml小凍 存管中，然后置于-80°C冰箱中保存待用。實施例3.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗抑制腫瘤發生的動物模型構建采用6-8周齡、18_24g的C57BL/6小鼠建立肺癌與黑色素瘤模型，采用6_8周齡、 18-24g的BALB/c小鼠建立乳腺癌和結腸癌模型。實驗組動物分成兩組，每只右側脅部皮下 接種胎盤干細胞抗腫瘤疫苗5 X IO5個(200 μ 1)，于第一次免疫后1 2周(隔1周與隔2 周免疫組)進行第二次免疫，部位和劑量同第一次。并且觀察小鼠的精神狀態，有無成瘤， 有無消瘦，食欲不振，死亡等不良反應。于第二次免疫后1周行第三次免疫，第三次免疫后 1周，接種肺癌、乳腺癌、結腸癌與黑色素瘤等腫瘤細胞。實施例4.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗體內注射抑制腫瘤的發生第三次免疫后1周接種Lewis肺癌(LL/2c)細胞、乳腺癌(4T1)細胞、結腸癌細胞 (C26)細胞、黑色素瘤(B16-F10)細胞，每只5 X IO5個(200 μ 1)，并于接種后每隔4天測量 一次腫瘤體積和小鼠體重，觀察有無體重減輕等不良反應。接種腫瘤后第6天，對照組有一 半小鼠可以捫及腫瘤，第9天對照組所有小鼠可以捫及腫瘤；與對照組相比，實驗組在接種 后第12天，有一半小鼠可捫及腫瘤，第27天60-80%小鼠可捫及腫瘤。實驗組在腫瘤接種 后第21和30天的抑瘤率分別達到了 71. 5%和59%。實驗組腫瘤的生長明顯較對照組慢， 20-40%的小鼠甚至不形成腫瘤，結果具有統計學意義(P < 0. 05)。參見說明書附圖2，就是本發明抗成瘤比較_肺癌模型，實驗組應用胎盤干細胞抗 腫瘤疫苗，腫瘤體積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤。參見說明書附圖3，就是本發明抗成瘤比較_乳腺癌模型，實驗組應用胎盤干細胞 抗腫瘤疫苗，腫瘤體積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤。參見說明書附圖4，就是本發明抗成瘤比較_結腸癌模型，實驗組應用胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，腫瘤體積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤.參見說明書附圖5，就是抗成瘤比較_黑色素瘤模型，實驗組應用胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，腫瘤體積明顯小于對照組，甚至不形成腫瘤.實施例5.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗體內注射抑制腫瘤血管生成我們通過對腫瘤組織免疫組化染色，觀察到實驗組腫瘤組織中的新生血管明顯少 于對照組，這也與腫瘤體積明顯小于對照組相呼應。實施例6.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗體內注射抑制腫瘤干細胞的生長與對照組相比，腫瘤組織的⑶133免疫組化染色顯示，實驗組腫瘤組織中腫瘤干 細胞明顯少于對照組，這與實驗組腫瘤體積顯著小于對照組，甚至實驗組有小鼠不成瘤有 關，結果有統計學意義(P < 0. 05)。實施例7.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗體內注射增加自然殺傷(NK)細胞在腫瘤周圍的 數量及活性與對照比較，腫瘤組織⑶56、⑶57免疫組化染色顯示，實驗組腫瘤組織周圍及腫 瘤組織中的自然殺傷(NK)細胞和T細胞明顯多于對照組，結果有統計學意義(P <0.05)。實施例8.胎盤干細胞抗腫瘤疫苗體內注射無成瘤性及毒副作用在注入胎盤干細胞抗腫瘤疫苗后，我們定期觀察小鼠右側脅部有無成瘤，未發現 有成瘤現象。小鼠無消瘦，脫毛，食欲不振等不良反映。處死小鼠后，心、肝、脾、肺、腎HE染 色顯示實驗組未發現明顯毒副作用。參見說明書附圖6，實驗組雖經多次加強免疫，相關內臟仍無明顯異常，但脾臟呈 顯著免疫增生反應。
權利要求
一種胎盤干細胞抗腫瘤疫苗，其特征在于在1ml的小凍存管中保存有培養8代后的胎盤干細胞，每只小凍存管含胎盤干細胞抗腫瘤疫苗和人AB血清，總體積為200μl，其中胎盤干細胞數量為5×105個，置于-80℃冰箱保存待用。
2.根據權利要求1所述的胎盤干細胞抗腫瘤疫苗的制備方法，下面操作是在無菌條件 下進行，其特征在于(1)處理胎盤組織取足月生產的胎盤組織，將胎盤組織剪碎成lcmXlcmXlcm大小， 用總體積2L的D-Hank’ s平衡鹽溶液，沖洗3次，直接用濾網過濾后收集胎盤組織，(2)胎盤干細胞的獲取取上述收集到的胎盤組織用0.25%胰蛋白酶10ml 37°C消化 5min,終止消化后，200目濾網過濾，收集單細胞，(3)胎盤干細胞的培養將上述單細胞用D-Hank’s平衡鹽溶液35ml洗一遍，加入配好 的含5%人AB血清的DMEM培養基，調整培養細胞濃度為4X 105個/ml，接種于75cm2的培 養瓶內，置于37°C，5% C02,飽和濕度95%的培養箱培養，每3 4天進行換液，即將培養瓶 中培養基倒出，換為新鮮配制的培養基，當胎盤干細胞生長至培養瓶壁70% 80%，單層， 即吸盡培養基，加入2 3ml的0. 25%胰酶，消化3 5min，在倒置顯微鏡下觀察，當90% 的細胞漂浮變圓時，加入大于2倍于胰酶體積的培養基終止消化，并用彎管吹打混勻，轉移 到15ml離心管中，離心1500rpm，3min，棄上清，加少許培養基混勻，分裝入2 4個裝有約 10ml培養基的75cm2培養瓶中，擴大培養，3 4天傳代1次，直至傳代8次，(4)制作胎盤干細胞抗腫瘤疫苗當傳代8次后的胎盤干細胞生長至培養瓶壁70% 80%，單層，即按上述步驟消化細胞，離心，棄上清后，加入人AB血清，將細胞吹散混勻，并 將細胞濃度調至2. 5X106/ml，按照200 iU，即5X105個胎盤干細胞，分裝于1ml小凍存管 中，然后置于-80°C冰箱中保存待用。
3.根據權利要求1所述的胎盤干細胞抗腫瘤疫苗的應用，其特征在于生產直接用于 抑制腫瘤的發生、發展和轉移，預防和治療腫瘤的疫苗的應用。
全文摘要
本發明涉及生物醫學工程技術，特別是一種用胎盤干細胞制作的抗腫瘤疫苗及其制備方法與應用。本發明的疫苗是在小凍存管中保存有培養8代后的胎盤干細胞，每只小凍存管有胎盤干細胞數量為5×105個(200μl)。其疫苗的制備方法有四個步驟(1)處理胎盤組織，(2)胎盤干細胞的獲取，(3)胎盤干細胞的培養并傳代8次，(4)制作胎盤干細胞抗腫瘤疫苗。本發明提供一種在腫瘤建立之前可以起到疫苗防御作用的，使機體對腫瘤干細胞產生特異性免疫抗體與致敏淋巴細胞，抑制腫瘤干細胞生長與遷徙，從而達到阻斷體內腫瘤發生、發展與轉移的細胞生物制劑。抑瘤率可以達到70％以上，可以用于多種腫瘤，如肺癌、乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤等的防治。
文檔編號A61P35/00GK101856496SQ20101019309
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月7日 優先權日2010年6月7日
發明者周莉娜, 楊莉, 陳縣城, 魏于全 申請人:四川大學