專利名稱：一種具有抗菌活性的還原蒽醌類化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是從一種植物內生真菌Coniothrium sp.的發酵物中分離到三個新的具有抗菌活性的還原蒽醌類化合物Coniothranthraquinonel 3。
背景技術：
植物內生真菌Coniothrium sp.屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、腔孢綱 (Coelomycetes)、球殼抱目(Sphaeropsidales)、盾殼霉屬(Coniothrium)真菌。對盾殼 霉屬內生真菌化學成分的研究最早始于上世紀90年代，到目前為止，已報道的從盾殼霉 屬內生真菌中分離的化合物約有50個。化合物類型有硝基萘類、留醇類、聯苯類、多聚乙 酰類、內酯類、呋喃類、螺旋乙縮醛類等，部分化合物具有較強的生物活性，如抗真菌、抗細 菌、抗藻類等活性(Karsten Krohn，Andreas Michel，Ulrich Florke, Hans-Jiirgen Aust， Siegfried Draeger，Barbara Schulz. Palmarumycins C「C16 from Coniothyrium sp. Isolation，Structure Elucidation，and Biological Activity. Liebigs Ann Chem. 1994， 1099-1108 ；Ink Kock,Karsten Krohn,Hans Egold，Siegfried Draeger,Barbara Schulz, Joachim Rheinheimer. New Massarigenin E，and Coniothyrenol，Isolated from the Endophytic Fungus Coniothyrium sp. from Carpobrotus edulis. Eur J Org Chem. 2007, 2186-2190 ；Karsten Krohn, Simeon F.Kouam, Stephan Cludius—Brandt，Siegfried Draeger, Barbara Schulz.Bioactive Nitronaphthalenes from an Endophytic Fungus， Coniothyrium sp.，and Their Chemical Synthesis. Eur J Org Chem. 2008，3615-3618)。 但至今未見從內生真菌Coniothrium sp.中分離得到具有抗菌活性的還原蒽醌類化合物 Coniothranthraquinone 1 ~ 30
發明內容
本發明提供一種從植物內生真菌Coniothrium sp.發酵物中提取分離得到三個 具有抗菌活性的還原蒽醌類新化合物，分子式分別為C15H1405、C15H18O6和C15H16O5，分別命名 Coniothranthraquinone 1、Coniothranthraquinone 2、Coniothranthraquinone 3，它{門
的化學結構式分別為 本發明化合物 Coniothranthraquinone 1 3 由內生真菌 Coniothrium sp.的發 酵物制備制備得來，內生真菌Coniothrium sp.的發酵物由德國Paderborn大學提供。經 體外抗菌試驗表明，Coniothranthraquinone 1對花藥黑粉菌和巨大芽孢桿菌有明顯的抑菌效果；Coniothranthraquinone 2 禾口 Coniothranthraquinone 3 )(寸灰有明H白勺才屯菌 效果，因此可以用于制備抗菌藥物。本發明為研制抗菌藥物提供了新的先導化合物，對瀕危藥用植物的保護具有十分
重要的意義。
具體實施例方式實施例 1.制備化合物 Coniothranthraquinone 1 3按常規取內生真菌Coniothrium sp.發酵物(德國Paderborn大學提供)。將發酵 物(4. 46g)溶于5ml丙酮中，用正相硅膠色譜(200 300目)分離，以石油醚氯仿體積比 為100 1,80 20,50 50,20 80,1 100的洗脫液進行梯度洗脫，根據薄層板監測， 各流份按照極性的差別從小到大依次收集16個組分Fr.A Fr.P ；將Fr.H用CH2Cl2(1.0ml) 溶解，再經正相硅膠柱(200-300 目)以 CH2Cl2/Me0H100 1,50 1,30 1,20 1， 10 1為流動相進行梯度洗脫，根據薄層板監測收集相應洗脫液，得到4個部分Fr. HrFr. H4。Fr. H2經過Sephandex LH-20凝膠柱，用流動相體積比為1 1的CH2Cl2/Me0H洗脫，收 集黃色部分Fr. H2_2并用真空減壓旋轉蒸發儀回收溶劑濃縮至干。將Fr. H2_2通過半制備型 HPLC進行純化(C18，1.5ml/min)，以甲醇水的體積比為80 20的混合溶劑進行洗脫，用 示差檢測器監測，收集保留時間為12min的流份，得Coniothranthraquinone 1共2. Omg。將Fr.L 用 CH2C12 (1. 0ml)溶解，經正相硅膠柱(200-300 目)以 CH2C12/ MeOHlOO 1,50 1為流動相進行梯度洗脫，根據薄層板監測收集洗脫液，得到6個部分 Fr. LrFr. L6。將Fr. L5通過半制備型HPLC進行純化(C18，1. 5ml/min)，以甲醇水的體積 比為50 50的混合溶劑進行洗脫，用示差檢測器監測，收集保留時間為17min的流份，得 Coniothranthraquinone 2 共 1. 5mg。Fr. 0 用 CH2C12(1. 0ml)溶解，經正相硅膠柱(200-300 目)以 CH2Cl2/Me0H100 1， 80 1,50 1,30 1,20 1,10 1為流動相進行梯度洗脫，根據薄層板監測收集洗脫 液，得到10個部分Fr. 0rFr. 010。將Fr. 09通過半制備型HPLC進行純化(C18，1. 5ml/min)， 以甲醇水的體積比為70 30的混合溶劑進行洗脫，用示差檢測器監測，收集保留時間為 17min 的流份，得 Coniothranthraquinone 3 共 2. 0mgo通過紅外、紫外、質譜和二維核磁共振等多種現代光譜技術的綜合解析，確定了化 合物Coniothranthraquinone 1 3的化學結構。Coniothranthraquinone 1為亮黃色無定形粉末，易溶于氯仿、甲醇； HR-T0F-EI-MS 顯示有[M]+ 峰 m/z274. 0842 (C15H1405，calcd. 274. 0841)。IR(film)vmax 3353 (OH) ,2943, 2833 (CH3, CH2)，1664，1625 (C = 0) cnT1 ；UV(MeOH) A maxnm 274,250,221 ；1H 和13C核磁共振數據見表1。Coniothranthraquinone 2為淡粉色無定形粉末，易溶于甲醇；HR-TOF-EI-MS 顯示有[M]+峰 m/z294. 1102(C15H1806，calcd. 294. 1103)。IR(film) vmax 3365 (OH)，2921， 2852 (CH3, CH2)，1675 (C = 0)，860，652 (芳環)cnT1 ；UV(MeOH)入 max nm :265，225 ；1H 禾口 13C 核 磁共振數據見表2。Coniothranthraquinone 3為黃色無定形粉末，易溶于丙酮、甲醇；HR-T0F-EI-MS 顯示有[M]+ 峰 m/z276. 1000 (C15H1605, calcd. 276. 0998)。IR(film)vmax 3290 (OH), 2921, 2854 (CH3,CH2), 1629 (C = 0)，849，767 (芳環)cnT1 ；UV(MeOH) A max nm 334，274，266，257，227 ；1H和13C核磁共振數據見表3。表1. Coniothranthraquinone 1 的和 13C NMR 數據(DMS0_d6，500MHz/125MHz) 表2. Coniothranthraquinone 2 的屮和 13C 匪R 數據(DMS0_d6，500MHz/125MHz) 體外抗菌試驗一、試驗用真菌、細菌和藻類
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1.試驗用真菌花藥黑粉菌(Microbotryum violaceum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)和殼針孢葉枯病菌(Septoria tritici)；2.試驗用細菌大腸桿菌(Escherichia coli)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)；3.試驗用藻類小球藻(Chlorella fusca)。二、實驗用藥1.陽性對照藥青霉素(Penicillin)、鏈霉素(Str印tomycin)；2.陰性對照品丙酮(Acetone)；3. Coniothranthraquinone 1、Coniothranthraquinone 2 禾口 Coniothranthraquinone 3 fi^HM 1 備三.實驗方法1.配制藥物溶液將青霉素、鏈霉素和Coniothranthraquinone 1 3分別用丙 酮配制成濃度為2mg/ml的溶液，單次測試用量25 yl。2.將上述3種真菌、2種細菌和1種藻類按無菌操作的要求分別用7ml滅菌水配 制成菌液，各用噴霧器取4ml菌液，分別均勻噴灑于各自培養皿的培養基表面，再在每個培 養皿內分別放置直徑約1cm滅菌濾紙兩塊，覆蓋于培養基表面，然后分別取上述配制的藥 液25 yl滴于濾紙上，蓋上培養基蓋子進行培養。各培養皿蓋子上均注明相應培養基種類、 菌種、化合物名稱、接種時間。花藥黑粉菌室溫培養4天，灰霉菌室溫培養5天，殼針孢葉枯 病菌20°C培養4天，大腸桿菌37°C培養24小時，巨大芽孢桿菌37°C培養24小時，小球藻 20°C培養5天。按時觀察結果，測量抑菌圈的大小(半徑)，平行試驗3次，結果見表4。表4.瓊脂擴散實驗活性篩選(mm) 由表4可見，Coniothranthraquinone 1對花藥黑粉菌和巨大芽孢桿菌均 有 H 著白勺才屯 作用；Coniothranthraquinone 2 禾口 Coniothranthraquinone 3 對灰 霉菌有有顯著的抑制作用(陽性對照藥對此真菌無抑制作用)。因此，本發明化合物 Coniothranthraquinone 1 3可用于制備抗菌藥物。
權利要求
一種還原蒽醌類化合物Coniothranthraquinone 1～3，其特征在于化學結構式分別如下FSA00000168877500011.tif
2.權利要求1所述的還原蒽醌類化合物Coniothranthraquinone 1或2或3在制備抗 菌藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是從植物內生真菌中分離到3種還原蒽醌類抗菌化合物Coniothranthraquinone 1～3，化學結構式分別如下。體外抗菌試驗表明Coniothranthraquinone 1對花藥黑粉菌和巨大芽孢桿菌具有顯著的抑制作用；Coniothranthraquinone 2和Coniothranthraquinone 3對灰霉菌具有顯著的抑制作用。本發明為研制新的抗菌藥物提供了新的先導化合物，對瀕危藥用植物的保護具有十分重要的意義。
文檔編號A61P31/04GK101885676SQ20101020795
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月23日 優先權日2010年6月23日
發明者劉寶姝, 孫鵬, 張文, 易楊華, 李玲, 湯華, 霍娟 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學