專利名稱：一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地涉及一種結核分枝桿菌重組融合蛋白及其應用。
背景技術：
結核病是由結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,TB)感染所致的人類疾 病，是分支桿菌病的主要類型，主要通過呼吸道傳播。自1882年德國科學家Rrobert Koch 發現TB以來，全球約有兩億人死于TB，且疫情發展日趨嚴重。據WHO預計，全球現有TB病 人2000萬，如不控制今后10年還將有9000萬人發病。我國現有3. 3億結核菌感染者，肺 結核病人600多萬，其中有嚴重傳染性的病人150萬，每年死于結核病的達25萬人。因此， 結核病的預防、早期診斷和及時治療是高度關注的課題。MTB有H37Rv與H37Ra兩種標準菌 株，前者為毒力株而后者為減毒突變株，它們均來源于1934年的人肺H37分離株。與一些 臨床分離株不同的是，H37Rv對藥物敏感、利于基因工程操作并在TB動物模型中保留了完 整毒力，因而該菌株被廣泛應用于TB相關的生物醫藥研究(MTb H37Rv project at Sanger Institute, NCBI)。目前常用的結核病診斷方法有胸部X光透視和主要依靠患者痰液、胸 水、支氣管肺泡液的顯微鏡直接涂片檢查(AFP)和培養法，以及分子生物學和血清學檢查， 這些方法多基于高特異性的抗原建立。本發明提供了一種用基因工程方法生產的結核重組融合蛋白作為抗原，與常用抗 原相比特異性更強，用其作為抗原制備的免疫診斷試劑盒，可為結核病感染的檢測提供更 為特異、準確的工具。
發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的是提供一種結核分枝桿菌重組融合蛋白，并提供該結核分枝桿菌重 組融合蛋白在制備單抗、多抗、檢測試劑盒、蛋白芯片和疫苗中的應用。( 二)技術方案本發明提供了一種編碼結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白的融合基 因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本發明還提供了一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白，該重組融合 蛋白由所述融合基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本發明提供了一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白的表 達載體，該表達載體是將所述融合基因插入到質粒pET-28b上得到的重組質粒 pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其質粒圖譜如附圖1所示。本發明又提供了一種表達結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的 工程菌株，該工程菌株含有表達載體pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其宿主菌為大腸桿菌(Escherichia coli)。本發明還提供了一種結核分枝桿菌抗體IgG酶聯免疫檢測試劑盒，它包括前述的 38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白和酶標二抗。所述38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白的包被 量為2. 0 μ g/孔，酶標二抗工作濃度為4. Omg/mL。本發明提供了一種結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒，它包括TB抗原、膠體金標 記TB抗原和質控線包被兔抗TB抗體，其中所述TB抗原和膠體金標記TB抗原均是由前述 的結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白制得。本發明所述的結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒，TB抗原噴點濃度為 0. 25-2. Omg/mL,膠體金標記TB抗原染色液的工作濃度為OD值50. 0-100. 0，TB抗原噴點量 為0. 5-1. 75 μ L/cm,膠體金標記TB抗原噴點量為0. 5-1. 75 μ L/cm,質控線包被兔抗TB抗 體包被濃度為0. 5-2. Omg/mL,反應膜封閉時間為45-75分鐘，反應膜干燥條件為相對濕度 25% -30%下干燥30-75分鐘，膠體金標記TB抗原墊干燥條件為相對濕度25% -30%下干 燥3-5小時，標本檢測反應時間為15°C 30°C下反應10-30分鐘，溫度低于15°C時標本檢 測反應時間為40-50分鐘。優選地，TB抗原噴點濃度為1. Omg/mL，膠體金標記TB抗原染色液的工作濃度為OD 值80. 0，TB抗原噴點量為1. 0 μ L/cm,膠體金標記TB抗原噴點量為1. 0 μ L/cm,質控線包被 兔抗TB抗體包被濃度為1. 0mg/mL，反應膜封閉時間為60分鐘，反應膜干燥條件為相對濕度 25% -30%下干燥60分鐘，膠體金標記TB抗原墊干燥條件為相對濕度25% -30%下干燥4 小時，標本檢測反應時間為15°C 30°C下反應25-30分鐘。本發明還公開了所述的結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白在制備單 抗、多抗、檢測試劑盒及蛋白芯片和疫苗研制中的應用。(三)有益效果采用本發明提供的結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白制備的診斷試 劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，很好的滿足了 TB感染 臨床診斷的需要。
圖1是表達載體pET-28b-38Kd-16Kd_CFP10的構建流程圖；圖2是表達載體pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10酶切產物電泳圖，其中1表示DNA Marker, 2,3,4分別表示酶切后的三個陽性菌，5表示酶切前的重組質粒；圖3是結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白純化電泳圖，其中1表示細 胞裂解后的上清，2表示細胞裂解后的沉淀，3表示純化的TB蛋白；
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。實施例1結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白的制備1. 1基因融合通過計算機分析TB H37Rv基因組全序列，選擇其強抗原表位38kDa蛋白 (GENEBANK locus :YP_177770)、16kDa (GENEBANK locus :NP_214765)和 CFP10(GENEBANKlocus :BX842584)的DNA序列為模板，設計擴增引物為38kD擴增引物38-16-CFa :atcgCATATGtgtggctcgaaaccaccgagc 54. 8% Tm :79· 638-16-CFb :GATTGTTCATACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATC GC 55.8% Tm 8616kD擴增引物38-16-CFc :ggtggtggtggtATGAACAATCTCGCATTG 50% Tm 7638-16-CFd :TCCGCAATCACCACCACCACCCTACTTCGTATGGCGATGCG 58. 5% Tm 89CFPlO擴增引物38-16-CFe :ggtggtggtggtATGGCAGAGATGAAGACCGATG 50% Tm :61· 438-16-CFf :atcgCTCGAGTCAGAAGCCCATTTGCGAGG 55% Tm :64. 350mL 擴增體系ddH20 31. 5mL, IOXbuffer 5. OmL, 4XdNTP 4. OmL，上、下游引物 混液 4. OmL, DNA 1. 5mL, Taqplus 0. 2mL(lU)。取結核分支桿菌H37RV的菌體，加IOOmL蛋白酶K (10mg/mL)，置56°C水浴消化4 小時，用常規酚/氯仿法純化，用上述引物進行PCR擴增。其中，38Kd上游引物和CFPlO下 游引物分別增加了 Nde I和Xho I酶切位點。將克隆片段進行修飾，產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，將含DNA條帶的膠塊 按DNA快速純化試劑盒(購自六合通_北京TAKARA公司，產品名稱TAKARA MiniBEST Plasmid purification)說明回收DNA。然后再以38kDa、16kDa和CFP10基因片段為模板 用連接PCR擴增38kDa、16kDa和CFP10融合基因，中間以4個Gly (ggtggtggtggt)連接。質粒DNA 和 38Kd-16Kd-CFP10 均經內切酶切，50mL 體系10 χ buffer5. OmL, DNA 12mL, Xho I和Nde I各15U，ddH20補至50mL ；37°C水浴6h。50mL酶切產物經瓊脂糖凝膠 電泳分離，切割DNA條帶瓊脂塊，并按DNA快速純化試劑盒說明回收DNA。將融合基因片段克隆至pET_28b質粒(具有Xho I和Nde I酶切位點，購自華美 生物公司)，20mL連接體系ddH2015. OmL，10 χ buffer 2. OmL，PET_28b 2. OmL, Pab 1. OmL, T4DNA連接酶20U。質粒自身連接對照，20mL連接反應體系ddH20 16. OmL, 10 χ buffer 2. 0mL，PET-28b 2. OmL，T4DNA連接酶20U。按上述加樣后，混勻、稍離心，14°C _16°C連接過 夜。轉化E. coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養基)并挑克隆提質 粒測序，確定序列正確的克隆。重組質粒的酶切(Ndel/Xhol)電泳圖如附圖2所示。1. 2產物測序測序弓丨物為S38-16-CF(TCAACAACCGCAAAAGGACGC)及T7promoter 和 T7 terminator的通用引物。所有擴增引物和測序引物的合成以及重組質粒序列 pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10的測定都由華大基因公司提供服務。測得目的融合基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO 1所示。1.3目的蛋白的表達、純化將驗證正確克隆的重組質粒(pET-28b-38Kd-16Kd_CFP10)，轉化大腸桿 菌BL21(DE3，購自華美生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含體內進行表達將含有 38K-16K-CFP10基因的BL21(DE3)宿主菌培養到OD 0.6，用終濃度ImM IPTG誘導表達，4 小時之后收集菌體、超聲破碎、高速離心、收集沉淀。對收集的沉淀用M柱(Pharmcia公 司 chelating sephrose fast flow)進行純化，用如下溶液洗脫300mM 咪唑，20mM Tris,500Mm NaCl，8M Urea。38kDa、16kDa和CFPlO融合基因表達蛋白共614個氨基酸，氨基酸序 列如SEQ ID NO 2所示。1.4融合蛋白檢定1. 4. 1純度和分子量的測定經SDS-PAGE電泳檢測(蛋白上樣量10 μ g)，為單一 區帶，薄層掃描鑒定純度為95.4%。分子量約為78. 6kD，檢測結果見附圖3。1. 4. 2濃度測定經Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白作為標準參比品，抗原蛋白 濃度為 3. 5 士0. 12mg/mL。1. 4. 3活性測定用間接ELISA方法測定。包被量2. 0 μ g/孔，使用內部質控血清 測定OD值，結果見表1。表1抗原活性測定結果 抗原抗體反應采用蛋白印記技術(Western Blot)，以抗人結核IgG抗體陽性人 血清測試TB融合抗原，可見陽性反應，SDS-PAGE并證實抗原的分子量為78. 6KD。結果見附 圖3。1. 4. 4融合蛋白穩定性測定蛋白質濃度的穩定性測定，分三次測定保存的結核抗原溶液的蛋白質濃度的穩定 性，結果見表2.表2結核蛋白的濃度測定
抗原 批號蛋白濃度測定(mg/mL)
第1次(3個月)第2次(6個月)第1次(12個月) 測試結果顯示，_85°C保存的結核抗原溶液的蛋白質濃度非常穩定。結核抗原活性的穩定性測定，分三次噴點_85°C保存的結核抗原并制成膠體金試 劑盒，以企業質控參比品進行測定結果見表3.表3結核抗體企業質控參比品的考核結果
測定結果顯示，_85°C保存的結核抗原的免疫活性穩定。注本發明所用樣本由全軍結核病研究所提供。由臨床細菌學檢查及臨床X線等 臨床確診的結核病患者血清結核抗體IgG陽性的感染者及陰性血清、血漿制成。30支樣品， 其中15支抗人結核抗體IgG陰性參考品(N) ；15支抗人結核抗體IgG陽性參考品(P)。實施例2酶聯免疫法(ELISA)檢測結核分枝桿菌抗體IgG的建立采用間接ELISA方法檢測結核分枝桿菌抗體IgG，可用于TB抗原活性的檢定和TB 感染的輔助診斷。根據測試結果，在38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白的包被量為2. 0 μ g/孔，酶標二 抗使用濃度為4mg/ml時，檢測結果最佳，故以38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的包被量為 2. Oyg/孔，酶標二抗工作濃度為4mg/ml，建立結核分枝桿菌抗體IgG酶聯免疫檢測試劑
品.ο實施例3結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒(膠體金法)的制備及性能檢定2. 1試劑盒組成及制備本發明試劑盒以純化的結核分枝桿菌38Kd-16Kd_CFP10重組融合蛋白制得的TB 抗原和膠體金標記TB抗原作為抗原，采用雙抗原夾心法。使用時加入待檢血清，如樣品中 含有抗TB特異性抗體，則先與膠體金標記TB抗原結合，前行再與膜表面的相應TB抗原結 合形成復合物而呈現紫紅顏色。如樣品中無抗TB特異性抗體，則只有質控線顏色，其顏色 強度直接與樣品中存在的抗TB特異性抗體IgG的量呈正比。試劑盒主要組成成分為測試板，包括加樣區、膠體金標記TB抗原包被膜區、TB抗 原包被檢測區、質控區和吸水墊區。2. 1. 1質控線包被兔抗TB抗體(購自北京賽蒂克生物技術公司，蛋白濃度為 4.0 士 0. 15mg/mL，免疫瓊脂雙擴散效價彡1 16)。2. 1. 2膠體金標記TB抗原膠體金直徑30nm膠體金顆粒，原液光密度OD不小于 10. 0。2. 1.3條件優化2. 1. 3. ITB抗原和膠體金標記TB抗原包被濃度的確定采用方陣滴定選擇最佳TB 抗原包被濃度和相應的膠體金標記TB抗原工作濃度，見下表4。表4最佳抗原和相應的金標記抗原工作濃度的選擇膠體金標記TB抗原TB抗原濃度(mg/mL )
100.0 +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+注以陽性和陰性血清質控參比品為測試樣品，陰性參考品出現任何一份陽性即 判斷出現假陽性結果，在表中即以“+/”表示；陽性參考品出現任何一份陰性即判定出現假 陰性結果，在表中即以“_/”表示。根據測試結果，在TB抗原噴點量為1. 0μ L/cm和膠體金標記TB抗原噴點量為 1. 0 μ L/cm的條件下，選定最佳TB抗原噴點濃度為1. Omg/mL,膠體金標記TB抗原染色液的 工作濃度為OD值80. 0。2. 1. 3. 2最佳TB抗原噴點量的確定在已確定最佳TB抗原噴點濃度為1. Omg/mL 和最佳膠體金標記TB抗原噴點濃度為OD值80. 0的基礎上，采用方陣滴定選擇最佳TB抗 原噴點量(見表5)表5最佳抗原噴點量的確定
樣品NOTB抗原噴點量(μ L/cm)- 根據測試結果，選定最佳TB抗原噴點量為1. 0 μ L/cm.2. 1. 3. 3最佳膠體金標記TB抗原噴點量的確定；在已確定最佳TB抗原噴點濃度 為1. Omg/mL,噴點量為1. 0 μ L/cm和最佳膠體金標記TB抗原噴點濃度為OD值80. O的基礎 上，采用方陣滴定選擇最佳膠體金標記TB抗原噴點量(見表6)。表6最佳膠體金標記TB抗原噴點量的確定 根據測試結果，選定最佳膠體金標記TB抗原噴點量為1. O μ L/cm。2. 1.3.4質控線包被兔抗TB抗體包被濃度的選擇抗TB抗體包被量為1 μ L/cm。質控線包被兔抗TB包被濃度選擇的實驗結果見表 7。表7質控線包被兔抗TB包被濃度的選擇 -未出現對照線；+對照線清晰；+++ 對照線線清晰粗大。表7顯示，兔抗TB抗體與本試驗中所用膠體金標記TB抗原有較好的反應性。 1. Omg/mL濃度的抗TB包被基本上能夠較好地顯示對照效果，繼續提高抗體濃度未能明顯 提高反應強度。因而選擇1. Omg/mL抗TB的濃度作為質控線包被兔抗TB抗原的濃度。2. 1.3.5反應膜封閉時間的選擇硝酸纖維素膜包被TB抗原和抗TB抗體后，經封閉液封閉可以有效地降低非特異 性反應。對反應膜封閉時間的選擇實驗結果見表8。表8反應膜封閉時間(37°C )的選擇實驗結果 -陰性反應；士 可疑陽性；++陽性反應；X 反應膜背景模糊表8表明，封閉時間 不同對正確反映實驗結果有一定的影響。封閉時間過短會造成反應膜背景模糊，影響結果 判讀。本實驗的結果表明封閉45分鐘-75分鐘，封閉效果較好，有助于提高實驗結果的準 確性。選擇封閉60分鐘為生產控制條件。
2. 1.3.6反應膜干燥條件的選擇表9反應膜干燥條件選擇的實驗結果 反應膜適宜的干燥條件不僅與試劑的靈敏度有關，而且與試劑的穩定性關系更為 密切。表9的結果表明，在相對濕度為20%環境下，干燥時間短則試劑的穩定性差，干燥時 間長則影響反應結果的準確性。在相對濕度為25%、30%的環境下干燥時間為45分鐘、60 分鐘、75分鐘時，反應結果比較接近，都有較好的敏感度和穩定性。考慮到在生產過程中的 可控性，采用相對濕度25% -30%、干燥60分鐘的條件為生產中的干燥條件。2. 1. 3. 7金標記抗原墊干燥時間的選擇表10膠體金標記TB抗原墊干燥時間選擇的實驗結果 膠體金標記TB抗原墊干燥在37°C條件下。表10顯示，干燥環境相對濕度過低可 能影響反應強度。在比較適宜的干燥環境下，干燥時間3小時、4小時、5小時干燥效果比較 接近，試劑的反應敏感性及穩定性均較好。故選用相對濕度25% -30%、干燥4小時為生產 控制條件。2. 1. 3. 8標本檢測反應時間的選擇表11標本檢測反應時間的選擇實驗結果(A) 表12標本檢測反應時間的選擇實驗結果⑶ 表11和表12表明，在通常室溫條件下(15°C 30°C )，抗TB陽性或強陽性反應 血清在反應后5-10分鐘即可出現明確的陽性反應結果。抗TB弱陽性反應血清在常溫下反 應時，需要較長的反應時間，在反應25-30分鐘時可獲得明確的陽性反應結果。抗TB陰性 血清在通常室溫條件下(15°C 30°C )，反應在30分鐘內，基本能正確反映測定血清性質。 反應時間過長有可能造成假陽性。因此，將結果判定時間確定在反應25-30分鐘時判定反 應結果。考慮到特殊情況下，可能實際工作的室溫低于15°C，影響反應結果，采取延長10分 鐘反應時間的措施，也可獲得比較滿意的結果。2. 1.4試劑盒的制造1)檢測板的包被=NC膜的預切割、粘貼，將TB抗原以ρΗ7. 2、0· 02mol/LPBS緩沖 液稀釋至1. Omg/mL，質控線包被兔抗TB抗體以pH7. 2,0. 02mol/LPBS緩沖液稀釋至1. Omg/ mL，分別以優化條件噴點于NC膜上，干燥、封閉、干燥；封閉液配方0. 02mol/L PBS緩沖液(ρΗ7· 2，含0. 25%脫脂奶粉)。2)膠體金標記TB抗原的粘貼以0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液(ρΗ8. 0)配制膠體 金標記TB抗原溶液，包被于玻璃纖維模上，干燥后粘貼于包被好的檢測板；3)組裝檢測板切割成測試條，裝配、密封包裝。2. 1. 5檢測方法及結果分析1)取出測試板，置于一平面操作臺上，平衡至室溫。2)加樣微量加樣器于加樣孔加入未稀釋的待測血清100 μ 1。3) 15-20分鐘內觀察并記錄結果。強陽性結果可在5分鐘出現，弱陽性和陰性結果 需等待20分鐘觀察。陽性判讀窗口(C和T位置)出現兩條紫紅色線條；陰性判讀窗口 僅出現一條紫紅色線條(C位置)；無效判讀窗口無紫紅色線條。2. 2試劑盒性能評價2. 2. 1對30份TB參考品的檢測結果應用本發明制備的試劑盒，對TB抗體參考品進行了檢測，檢測結果見表13。表13對30份TB抗體參考品檢測結果
-陰性反應；+陽性反應；++ 較強陽性反應；+++ 強陽性反應。從試驗的結果可以看出，陰性、陽性符合率均達100%。因此我們認為采用這一檢 測系統是可行的。2. 2. 2對HBV、HCV、HAV和梅毒等抗體陽性血清的交叉反應測試采用本發明試劑盒對HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)、HAV(甲型肝炎)、癌癥和 非結核病呼吸系統患者血清的交叉反應，以進一步評價其特異性，對上述確認患者血樣進 行了測試，結果見下表。表14HBV、HCV、HAV和梅毒等抗體陽性血清的交叉反應測試結果 結果顯示該試劑盒與上述患者血樣無交叉反應發生。2. 2. 3對梅毒(RF)陽性血清、血脂、膽紅素和血紅蛋白等干擾物的交叉反應檢測表15對梅毒(RF)陽性血清、血脂、膽紅素和血紅蛋白等干擾物的測試結果
結果顯示該試劑盒與RF陽性血清、血脂、膽紅素和血紅蛋白等干擾物的交叉反應未超過正常人血清樣品的假陽性率。2. 2. 4與國外同類產品比較等試驗資料以本發明試劑盒與北京現代高達生物技術有限責任公司生產的新一代結核抗體 快速診斷試劑盒作比較。對200份陽性血清和230陰性血清進行了比較檢測，結果見下表表16與現代高達結核抗體試劑盒的比較測試結果 真實性和預示值計算分析表17真實性和預示值計算分析 本發明試劑盒與參比品北京現代高達生物技術有限責任公司結核抗體試劑盒的 檢測符合率為94.9%。2. 2. 5臨床考核沈陽市胸科醫院，安徽省肺科醫院和解放軍三零九醫院三家的臨床考核結果如 下表18結核抗體IgG檢測結果
* ()內為試劑盒檢測陽性例數 經沈陽市胸科醫院，安徽省肺科醫院和解放軍三零九醫院三家的臨床考核結果， 本發明試劑盒(膠體金法)已經達到國家規定的質量要求，并與國內外同類產品無統計學 意義上的質量差異。
權利要求
一種編碼結核分枝桿菌38Kd 16Kd CFP10重組融合蛋白的融合基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白，其特征在于它由權利要求1 所述的融合基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的表達載體，其特征在于它是 將權利要求1所述的融合基因按照如圖1所示的構建方式插入到質粒pET-28b上得到的重 組質粒 pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10。
4.一種表達結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的工程菌株，其特征在 于它含有權利要求3所述的表達載體pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其宿主菌為大腸桿菌 (Escherichia coli)。
5.一種結核分枝桿菌抗體IgG酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于它包括權利要求2 所述的38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白和酶標二抗。
6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的 包被量為2. 0 μ g/孔，酶標二抗工作濃度為4. Omg/mL。
7.一種結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒，它包括TB抗原、膠體金標記TB抗原和質控 線包被兔抗TB抗體，其特征在于所述TB抗原和膠體金標記TB抗原均是由根據權利要求 2所述的38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白制得。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于TB抗原噴點濃度為0.25-2. Omg/mL,膠 體金標記TB抗原染色液的工作濃度為OD值50. 0-100. 0，TB抗原噴點量為0. 5-1. 75 μ L/ cm,膠體金標記TB抗原噴點量為0. 5-1. 75 μ L/cm,質控線包被兔抗TB抗體包被濃度為 0. 5-2. Omg/mL,反應膜封閉時間為45-75分鐘，反應膜干燥條件為相對濕度25% -30%下干 燥30-75分鐘，膠體金標記TB抗原墊干燥條件為相對濕度25% -30%下干燥3_5小時，標本 檢測反應時間為15°C 30°C下反應10-30分鐘，溫度低于15°C時標本檢測反應時間40-50 分鐘。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于TB抗原噴點濃度為1.Omg/mL，膠體金 標記TB抗原染色液的工作濃度為OD值80. 0，TB抗原噴點量為1. 0 μ L/cm,膠體金標記TB 抗原噴點量為1. 0 μ L/cm，質控線包被兔抗TB抗體包被濃度為1. Omg/mL,反應膜封閉時間 為60分鐘，反應膜干燥條件為相對濕度25% -30%下干燥60分鐘，膠體金標記TB抗原墊 干燥條件為相對濕度25 % -30 %下干燥4小時，標本檢測反應時間為15 °C 30 °C下反應 25-30分鐘。
10.根據權利要求2所述的結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白在制備單抗、 多抗、檢測試劑盒、蛋白芯片和疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種結核分枝桿菌38Kd-11Kd-CFP10重組融合蛋白及其應用。本發明提供了一種結核分枝桿菌38Kd-11Kd-CFP10重組融合蛋白，還提供了該重組融合蛋白在制備單抗、多抗、檢測試劑盒及蛋白芯片中的應用。采用本發明提供的結核分枝桿菌38Kd-11Kd-CFP10重組融合蛋白制備的結核分枝桿菌診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，很好的滿足了結核(TB)感染臨床診斷的需要。
文檔編號A61P31/06GK101914563SQ20101023098
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者吳雪瓊, 張娟, 董亞俊, 蔣俊 申請人:沈陽市胸科醫院