一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測試劑盒的制作方法

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測的并聯探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法。

背景技術：

在過去的幾十年，抗生素廣泛用于各種感染性疾病的治療，但也正是由于抗生素的廣泛使用，導致新的抗生素耐藥形式不斷出現。糞腸球菌、結核分枝桿菌、銅綠假單胞菌對臨床上使用的100多種抗生素具有耐藥性，成為目前威脅人類生命的重要的細菌殺手。糖肽類抗生素(G1ycopeptides，Dalbahepides)即D-丙氨酰-D-丙氨酸結合性并具有七肽結構的一類抗生素，對包括主要病原菌如凝固酶陽性或陰性葡萄球菌、各組鏈球菌、腸球菌(包括糞腸球菌和屎腸球菌)、棒桿菌、厭氧球菌和單核細胞增生利斯特氏菌在內的幾乎所有的革蘭氏陽性菌都具有活性，在臨床上常用于由革蘭氏陽性菌尤其是葡萄球菌、腸球菌和肺炎鏈球菌所致嚴重感染性疾病的治療，代表著治療這些嚴重感染性疾病的最后防線。

自1988年報道糖肽類抗菌藥物耐藥的腸球菌以來，在全球范圍內的醫院中常出現。現已發現主要耐藥基因VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS和VanX 7個基因型。糖肽類抗生素耐藥基因可由轉座子、質粒攜帶，通過細菌間的接合作用來傳遞，使腸球菌中糖肽耐藥率不斷增加，而且許多萬古霉素耐藥性腸球菌還對其它抗生素(如β-內酰胺類和氨基糖苷類抗生素)耐藥，給萬古霉素耐藥性腸球菌感染的臨床治療造成很大的困難。另一方面，已發現一些甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌臨床分離株對萬古霉素和替考拉寧的敏感性減弱，在牛鏈球菌臨床分離株中發現了可轉移性vanB耐藥決定子，在環狀芽孢桿菌臨床分離株中發現存在vanA基因簇，說明糖肽耐藥基因不僅在腸球菌間傳播，而且可傳遞至腸球菌外的其它細菌，給未來的抗感染治療帶來了極大的威脅，對研制和開發高效準確的糖肽耐藥基因的檢測在臨床輔助治療具有重要的意義。

生物芯片技術是九十年代發展起來的一項新興生物技術。按照檢測對象來分類，可以分為基因芯片和蛋白質芯片等兩大類。與蛋白質芯片相比，基因芯片利用的是核苷酸鏈之間的互補作用，特異性強，性好。本發明所提供的糖肽類抗生素耐藥基因芯片與傳統的細菌藥敏性檢測方法相比，直接針對病原體糖肽類抗生素耐藥基因進行檢測，其檢測通量大、所需樣本量少、靈敏度高、準確性高和特異性好等優勢。

技術實現要素：

本發明目的是提供一種特異性好、結果準確、假陽性率低、檢測效率高的糖肽類抗生素耐藥基因檢測的并聯探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法。

本發明實現其目的技術方案為：

一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測并聯探針，包括探針1~23，其對應的序列如SEQ ID NO.1~23所示。

一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測芯片，包括固體相和權利要求1所述的探針組。

作為優選地，所述固相載體為氨基修飾的玻璃基片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。

一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測試劑盒，包括前述的基因芯片。

在上述糖肽類抗生素耐藥基因檢測試劑盒中，還包括糖肽類抗生素耐藥靶基因擴增引物對，引物序列如SEQ ID NO.24~39所示。

作為優選地，所述引物對的下游引物的5’端含有CY3熒光染料標記。

作為優選地，上述糖肽類抗生素耐藥基因檢測試劑盒，還包括PCR反應體系、雜交緩沖液、洗滌液。

在上述技術方案中，20 μL 的PCR反應體系包括：50~150 ng/μL的擴增模板 2 μL，Premix Taq 10 μL，濃度為8~12 μM的上、下游引物各1 μL，雙蒸水6 μL。

一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測方法，使用前述的糖肽類抗生素耐藥基因檢測試劑盒進行檢測，當檢測對象的三個探針顯示的檢測結果一致時可以判斷樣品是否感染糖肽類抗生素耐藥基因；當檢測對象的三個探針顯示的檢測結果不一致時，不能判斷該待測樣品為陽性或陰性，建議使用該檢測試劑盒重新檢測或者使用現有其它檢測方法進一步驗證。

作為優選地，PCR擴增反應程序為95℃ 5 min；95℃10 s、55℃ 30 s、72℃30 s、30個循環；72℃ 10 min。

本發明的有益效果是：每個耐藥基因設計3條高特異性的探針，當3條探針的檢測結果均為陽性時才判斷該項指標為陽性，能極大的提高產品的準確性和精確性，減少其它方法容易出現的假陽性問題；本發明通過PCR技術對病原體糖肽類抗生素耐藥基因組進行擴增，檢測的特異性高，擴增產物與生物芯片上的寡核苷酸探針進行雜交，通過CY3標記的PCR反向擴增引物檢測雜交結果。操作簡單、結果易讀，滿足醫療等現場檢測需求，為臨床醫生快速診斷患者是否被感染糖肽類抗生素耐藥基因提供了便捷、快速和準確的理論依據，具有廣闊的臨床應用市場潛力。

附圖說明

圖 1 檢測糖肽類抗生素耐藥基因的基因芯片示意圖。

圖2待測樣品糖肽類抗生素耐藥基因擴增后PCR產物電泳條帶圖；Marker DL2000 （TAKARA）。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J. 薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實施例用于說明本發明，但不用于限制本發明的范圍。

實施例1目的片段引物與探針設計

查找NCBI數據庫中糖肽類抗生素耐藥基因的基因序列VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS和VanX，使用芯片探針設計軟件（ArrayDesigner4.2）針對每個耐藥基因設計3條探針，另設計16sRNA基因的探針作為陽性質控探針（PC）與隨機合成一段探針作為陰性質控探針（NC），對應探針序列如SEQ ID NO .1~23所示。

使用NCBI在線設計軟件（Primer-BLAST）設計VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS和VanX基因的PCR擴增引物，同時設計16sRNA基因的擴增引物。為了使芯片結果更為直觀，在反向擴增引物（R）5’端用CY3熒光染料進行標記，對應的引物序列如SEQ ID NO .24~39所示。

實施例2 芯片的制備

將實施例1中的并聯探針按照表1的順序點樣到氨基修飾的玻璃基片上，得到含有探針的基因芯片（如圖1所示）。探針濃度為30 μM，每個點0.2 μL，然后80℃孵育1.5 h。

實施例3 檢測方法

1、待測樣品基因組提取

使用細菌基因組DNA提取試劑盒，按照操作說明書的步驟提取待測樣品的基因組作為擴增模板。

2、PCR擴增目的片段

經過大量實驗摸索，確定Van檢測的靶基因PCR擴增體系和PCR反應程序。將每個Van基因VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX和16SrRNA擴增的引物，分別配制PCR擴增緩沖液體系，總體積為20 μL的PCR擴增體系中含有試劑分別為：Premix LATaq 10μL、F引物（10μM）1 μL、F引物（10 μM）1 μL、擴增模板2 μL、雙蒸水6 μL。

PCR反應程序為：95℃ 5 min；95℃10 s、55℃ 30 s、72℃30 s、30個循環；72℃ 10 min。

3、PCR產物與芯片雜交

按照如下步驟操作：

a. 在實施例2中制備好的基因芯片上，將待測樣品的VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX和16SrRNA的PCR擴增產物混勻并點樣到芯片的檢測槽中，VanA引物的PCR產物分別點到VanA-1、VanA-2、VanA-3探針上，VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX引物的PCR產物分別對應點到探針上，16sRNA引物的PCR產物分別點到陽性質控探針（PC）與陰性質控探針(NC)。具體步驟為：PCR產物95℃解鏈5分鐘，迅速置于冰上，PCR產物與雜交緩沖液（50%甲酰胺，10×SSC，0.2%SDS）等體積混合，每孔點10 μL混合液，在濕盒中，于60℃雜交孵育2小時；

b. 取出孵育后的基因芯片，用洗滌液（0.3×SSC緩沖液）清洗3次；

c.將芯片放入激光共聚焦檢測儀（GenePix）在650 nm處掃描芯片；軟件分析熒光信號強度值，給出結果。

實施例4 檢測待測樣品

從第三軍醫大學獲取糖肽類抗生素耐藥細菌感染的樣本5份（膝關節積液），無糖肽類抗生素耐藥基因感染樣本1份（對照組）。按照實施例1和3中的引物和方法分別提取待測樣品的基因組，進行PCR擴增后，使用實施例2中的基因芯片進行檢測。PCR擴增后的產物電泳條帶表明本發明設計的擴增引物特異性高，能特異、靈敏地擴增出目標基因（如圖2所示）。

對于細菌感染的樣品，激光共聚焦檢測儀（GenePix）在650 nm處掃描芯片，探針點熒光信號較強（大于20），記為（+），熒光信號較弱（小于5），則記為（-），熒光信號強度難以分辨（5~20）則記為（*）。檢測中同時設計陽性和陰性質控對照，只有當陽性和陰性質控對照的檢測結果同時分為別陽性（+）和陰性（-），才認為該組檢測結果可信。

判斷檢測結果時，當VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX基因的3個探針均顯示陽性時才判斷該樣本帶有該耐藥基因，如果其中某一個或者兩個探針顯示陽性，則應對該檢測樣品重新檢測，3個探針結果須一致才能采信該檢測結果。3個探針檢測結果不一致時，也可使用現有其它技術（比如elisa方法）進一步檢測驗證。檢測結果如表2所示。

表2 樣本檢測結果

結果顯示為陽性質控對照均為陽性（+），陰性質控對照均為陰性（-），說明檢測結果可信。其中5份樣本中均檢測到糖肽類抗生素耐藥基因感染，樣本1被糖肽類抗生素耐藥基因VanA感染，樣本2被糖肽類抗生素耐藥基因VanR感染，樣本3被糖肽類抗生素耐藥基因VanX感染，樣本4被糖肽類抗生素耐藥基因VanX感染，樣本5被糖肽類抗生素耐藥基因VanR感染；對照樣本均未檢測到糖肽類抗生素耐藥基因，與實際臨床樣本信息情況相符。

本發明公開的探針、基因芯片、試劑盒，特異性高、結果非常準確，檢測快速、工作效率高，操作簡單，滿足醫院等的現場檢測需求，為診斷糖肽類抗生素耐藥細菌感染提供可靠的實驗依據。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司

<120> 一種糖肽類抗生素耐藥基因檢測試劑盒

<130> 2017

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttttttt ttttttgacg tgaaaccggg cagagtattg acttc 45

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttttttttt tttttgattt ggtccacctc gccaacagct aacgc 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttttttttt tttttattaa taacccaaaa ggcgggagta gctat 45

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttttttttt tttttttttt gaattgtctg gtatccccta tgtaggc 47

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttttttttt tttttttccg gcacggtcag gttcgtcctt tggcgta 47

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttttttttt tttttgatca aatccggttg agccacggta tcttc 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttttttttt tttttcataa acagaaaata cagccgctat tcgaa 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttttttttt ttttttctgc cttatgtatg aacaaatggc tgctg 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttttttttt tttttggcaa cgactctttg actgtcggtg cttgt 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttttttttt tttttggtgt gaaatatatt tctacccgaa gcatc 45

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttttttttt tttttgtggt gggaacgggc cagataggca aagcg 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttttttttt tttttattat cagccacgaa caaatacaga gaatg 45

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttttttttt tttttatatt ggacatcatg cttcccggca caagc 45

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttttttttt tttttgggtt aacaatcggc gcggatgatt atata 45

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttttttttt tttttgaaaa tgttatcgtc cactccggcc ttgtc 45

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tttttttttt tttttgatgt acttattcag aacgaagata aacaa 45

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tttttttttt tttttggaaa acaggcggtt attcacgccc ccgag 45

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttttttttt tttttgccga acaaagaaaa aatgacgttg ttatg 45

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttttttttt tttttttgaa ggcaaaagaa ctggctgcta cccaa 45

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tttttttttt tttttgcttc aaaatcaagc catagccgcg gcagt 45

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tttttttttt tttttgcggc aaatggaata tcatgcaatg aagcg 45

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tttttttttt tttttccgat agtgaaccag tacc 34

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tttttttttt tttttctatc tagctagcta gctagcta 38

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgatcaagcg gtcaatcagt tcggg 25

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cctctgagca acccccaaac agta 24

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcggttgctc ggaggaacat gatgtgtcg 29

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tatcgccaat gtaatcaggc tgtc 24

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

attcaccgga atacaccgtt tctttag 27

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tcttgatagg ataagccgac cgctgc 26

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tcggcattac tgtttatgga tgtga 25

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ctcctgtctc ctttcaaaat ccaaacag 28

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gtggatgatg aacatgaaat tgccga 26

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

aaccaagtct ggcatcgctg gaagc 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

attcgtgttg tatattcgtt caatg 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaccaagtct ggcatcgctg gaagc 25

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gatgaaatag tacacggtg 19

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggggaaatca aaatagctat t 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gagagtttga tyctggctca g 21

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aaggaggtga tccarccgca 20