專利名稱：一種分子標記、免疫保護性能增強的結核桿菌弱毒疫苗及構建方法
技術領域：
本發明提供了一種分子標記、免疫保護性能增強的結核桿菌弱毒疫苗，本發明還 公開了上述疫苗的構建方法，屬于分子生物學技術與免疫疫苗生產技術領域。
背景技術：
近幾年，結核病發病率，與死亡人數趨年攀升。該病唯一的弱毒活疫苗(以下簡 稱BCG)是用牛結核桿菌在其不適培養基上連續培養200多代而成。在這個過程中，BCG的 親本株大部分毒力基因發生了鈍化，使BCG毒力相對減弱，但是，同時也把BCG的保護性基 因失去了活力，致使BCG的保護性能低下(成年人僅有30% )。牛結核病的檢測，在我國主要靠血清學變態反應(GB/T 18645-2002)，該檢測方法 人為操作因素大，主要靠眼觀，主觀因素較多，誤差較高。BCG的一個缺陷是接種BCG后的人與動物，使用現有的檢測方法很難從野毒感染 的人與動物中區分開。對流行病學調查，疫源的布控帶來了嚴重的干擾。所以，研制出高保 護性的BCG，建立起能區分野毒感染與接種BCG的檢測方法，具有重要的現實意義。
發明內容
本發明提供了一種分子標記、免疫保護性能增強結核桿菌弱毒疫苗，是對BCG加 以分子標記，拯救出的BCG免疫保護性30KD基因的活性，增加其免疫保護性。本發明還公開了該疫苗的構建方法，克隆出結核桿菌的與BCG差異免疫性基因， 并表達出差異免疫原性蛋白，以差異免疫原性蛋白為抗原，建立起結核病快速診斷免疫膠 體金檢測方法。本發明的分子標記、高免疫保護性的結核桿菌弱毒疫苗，特征在于該疫苗是將結核桿菌外分泌免疫保護基因30KD替換其親本株BCG的MPT64基因， 對其加以MPT64基因分子標記。本發明結核桿菌弱毒疫苗的構建方法，包括以下步驟以結核桿菌的弱毒疫苗株BCG為起始材料，以PCR的方法從標準結核桿菌毒株的 基因組中擴增出要改造的目的基因MPT64的引導序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改 造；把經改造的引導序列克隆到pBluescript SK+上而成重組質粒；用同樣的方法得到結 核桿菌免疫保護性基因30KD的引導序列，克隆到T載體上，進行基因改造，并把它連接到 pBluescript SK+ 重組質粒； 用電轉化法把這兩個自殺性質粒依次轉入結核桿菌BCG中，轉入受體菌細胞內的 超螺旋的自殺質粒便會被線性化，插入受菌體BCG的基因組中，線性化的質粒與MPT64基因 發生置換，即得疫苗。本發明的具體構建方法主要包括以下步驟(1)以結核桿菌弱毒疫苗基因組為模板，設計引物，用PCR的方法，擴增出分子標記目標基因與免疫保護基因的同源重組引導序列，而后克隆到T載體上對目標基因改造；(2)用⑴得到的基因片段構建成同源重組載體(自殺性質粒)；(3)使步驟⑵得到的重組載體轉化到BCG中去，得到本發明的BCG基因突變；本發明用PCR的方法擴增出MPT64基因，連接到到pET_28a上，轉化到大腸桿菌 BL21中，用IPTG誘導、高效表達出帶有His-tag標簽的融合蛋白MPT64蛋白。本發明的積極效果在于使用基因定向改造的技術，定向的改造已經沉默的BCG 免疫保護性基因，以提高BCG的免疫保護性。提供的結核桿菌弱毒疫苗具有分子標記、免疫 保護性能增強的特點，用血清學檢測方法就能區分感染的人與動物是疫苗接種還是野生菌 感染；該疫苗免疫保護性能較親本株強。這對結核桿菌病監測、診斷、凈化和控制具有重要 意義，具有廣泛的應用實踐價值。
圖1、在基因打靶引誘序列上，用PCR方法從ABCG基因組中擴贈出30KD在內的基 因片段電泳圖。圖2、MPT64在大腸桿菌中得到表達，并純化，第1電泳道是Marker，2是少量鹽洗 脫，3、4、5是依次純化的蛋白電泳圖。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發明。本領域技術人員可以理解 到，在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明的任何平行改變和改動都將落入本 發明的待批權利要求范圍內。實施例1一、同源重組載體(自殺性質粒)的構建1材料與方法1.1菌株、質粒、載體 結核桿菌標準毒株、DH5a、T_sacB，pBluescript SK+本研 究室保存；pMD18-T simple vector 購自 TakaRa 公司。1.2試劑 限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I (Klenow大片段)，大 腸桿菌 DNA 聚合酶 I，LA-Taq DNA polymerase、Ikbp DNA Ladder Marker、質粒 DNA 提取試 劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產品。1.3PCR 擴增1. 3. 1含有MPT64基因同源重組指導序列的擴增 根據MPT64基因的序列以及 pMD18-Tsimple vector和pBluescript SK II (+)載體特點，設計引物從結核桿菌的基因組 中擴增目標基因。1. 3. 2含有結核桿菌30KD基因同源重組指導序列的擴增 設計引物。從結核桿 菌BCG的基因組中擴增。1. 3. 3sacB基因的擴增 分別設計5'端含有限制性內切酶BamH I的上游引物 與含有Sal I酶切位點的下游引物。以質粒PIP279為模板，擴增sacB基因。1.4自殺性質粒的構建1.4. 1含有MPT64基因同源序列自殺質粒的構建 把1. 4. 1中的擴增出的長
4度的基因片段(其中包含MPT64基因)，與pMDIS-T相連得到重組質粒。把1. 4. 4擴增 出sacB基因片段與pMDIS-T相連而成重組質粒pSacB。再用限制性內切酶分別消化質粒 pBluescriptSK II (+)與上述重組質料，并把MPT64片段與線性化的pBluescript SK II (+) 相連而成重組質粒pBlueScript-MPT64。再用限制性內切酶BamH I與Sal I分別消化重組 質粒pBluescript-MPT64與pSacB，并把sacB基因片段與連接到線性化的pBK_MPT64而成 最終自殺質粒。1. 4. 2含有結核桿菌30KD基因同源序列自殺性質粒pBBs的構建把1. 4. 2中的擴 增出的的基因片段(其中包含結核桿菌30KD基因)，與pMDIS-T相連得到重組質粒p-30KD。 并把的P-30KD用內切酶消化它，凝膠回收目標片段，使之與用消化過的pBluescript SK II (+)相連而成重組質粒PB-30KD。再用限制性內切酶分別消化重組質粒pB結核桿菌 30KD與pSacB，并把sacB基因片段與線性化的pB_30KD相連而成自殺質粒。2 結果從結核桿菌BCG株基因組擴增出含有MPT64基因在內的基因片段，凝膠純化后待 用；從結核桿菌基因組擴增出含有結核桿菌30KD在內的基因片段，凝膠純化后待用；從質 SpSP-Luc NF+擴增出1700bp大小的Luc NF+基因片段，凝膠純化后待用；從質粒pIP279 擴增出1400bp大小sacB的基因片段，凝膠純化后待用。它們經瓊脂糖電泳驗證，均可觀察 到與理論值大小相符條帶。幾個主要的重組質粒酶切電泳鑒定pBb26經XhoI單酶切，電泳帶與預期值相符； P-30KD經Xba I單酶切，電泳與預期值相符；pBK_MPT64單酶切，在12000bp左右有一條帶，
與預期值相符。二、結核桿菌分子標記、免疫保護基因疫苗株Δ BCG的構建1. 1試劑 螢光素酶檢測系統購自Promega公司，其它試劑同上。1. 27Η10培養基 按照說明書配制后，高壓滅菌后備用。1. 3電轉化1. 3. 1感受態的制備 取240mL對數生長前中期(0D_ = 0. 15)結核桿菌液體 培養物放入預冷的250mL離心管中，迅速將培養物置于冰水混和物中40min，不時的緩慢搖 勻保證內容物充分冷卻。然后4°C 1200Xg離心15min，回收細胞，倒去培養液，用冰冷10% 的丙三醇重懸沉淀，以IOOOXg離心15min洗滌細胞3次。最后用3mL 10%的丙三醇重懸 沉淀制成感受態。1. 3. 2電轉化操作步驟 取0. 5 μ g自殺質粒加入100 μ L上述制作的結核桿菌 電轉感受態中混勻，加入電擊杯中，WE = 13kv/cm電擊，然后立即加入37°C預熱的ImL的 培養基中。放入生化培養培養48h。取出200mL涂布于含有篩選標記的瓊脂平板上，12d后 篩選出重組子，挑選出單菌落，進一步培養鑒定。1. 4同源重組子的篩選1.4. 1單交換子的篩選 把電轉化受體菌涂布在含有篩選標記(Amp 100mg/L， Kan50mg/L)的瓊脂平板上，因同源重組載體上帶有篩選標記基因，所以很容易的篩選出單 交換子。1. 4. 2雙交換子的篩選 將獲得的同源重組單交換子液體培養3d，適當稀釋， 涂布于添加5%蔗糖的肝湯培養基平板上，37°C培養12d。所得細菌命名為Δ BCG菌株一即
5為改造的BCG菌株。2 結果2. IPCR法法驗證同源載體插入BCG染色體上與Δ BCG雙交換子正確性，用PCR方 法分別從BCG、同源載體插入后的BCG、A BCG的基因組中分別擴增出不同片段。2. 2PCR方法驗證改造后的結核桿菌30KD基因在Δ BCG雙交換子的正確性用PCR 方法分別從BCG基因組中擴贈出包含結核桿菌30KD在內的基因片段。證實Δ BCG基因改 造成功見圖1。三、結核桿菌ΜΡΤ64蛋白基因的克隆、表達及純化結核桿菌ΜΡΤ64蛋白是一種具有強免疫原性的分泌蛋白。它由細胞內向外釋放， 具有可溶性，相對于固定的外膜蛋白易于檢測。本發明克隆了結核桿菌的ΜΡΤ64蛋白基因， 并進行了表達，表達產物通過親和層析進行了純化。1材料與方法1.1 材料1. 1. 1菌株與、質粒、載體結核桿菌BCG、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21和pET28a+本研究室保存。1. 1. 2限制性內切酶及其它試劑限制性內切酶 NdeI、EcoRI、SacI、Hind III、Sal I 和 T4DNA 連接酶均購自 TaKaRa 公司。DNA回收試劑盒同第一章；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體購自鼎國生物公司； RNase購于華美生物工程公司；IPTG及TMB購自Sigma公司；PVDF膜為Millipore公司 產品；丙烯酸胺、雙甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker購自TaKaRa公司；結核桿菌陽性 牛血清本室研制，辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG購自鼎國生物公司；金屬鰲合層析介質 Sepharose-4-B _ 自 Pharmacia ^W]。1.1. 4主要試劑的配制1.1.4. 1SDS-PAGE 試劑30% (w/v) AcrylamidelOOmL 稱取 29g Acrylamide Ig BIS 置于 IOOmL 燒杯中， 加入約80mL的去離子水后，加熱使之溶解，加去離子水將溶液定容至IOOmL,用0. 45 μ m過 濾膜過濾除雜質，于棕色瓶中4°C保存。1. 5mol/L(pH8. 0) Tris-HCl 緩沖液18. 17g Tris 加入 90mol/L dH20 使之溶解，用 濃HCl調pH值至8. 0，最后加dH20定容至IOOmL ；1. Omol/L(pH 6. 8)Tris-HCl 緩沖液2. Ilg Tris加入90mL dH20使之溶解，濃HCl 調PH值至6. 8，最后加dH20定容至IOOmL ；10% SDS 稱取電泳級SDS 10g，加入90mL dH20使之溶解，調pH值至7. 2，最后加 dH20 定容至 IOOmL ；10% (w/v)過硫酸胺ImL 稱取IOOg過硫酸胺，加入ImL的去離子水后，充分攪拌 溶解，于4°C保存，不宜久放；IOX 電極緩沖液:3g Tris、14. 4g 甘氨酸、Ig SDS, dH20 定容至 IOOOmL ；2 X SDS上樣緩沖液2. OmL甘油、ImL 2_巰基乙醇、0.6g SDSU. OmL 溴酚藍、 2. 5mL 1. Omol/L pH 6. 8Tris-HCl, dH20 定容至 IOmL ；考馬斯亮藍R-250染色液稱取Ig考馬斯亮藍R-250，置于IOOOmL燒杯中，加入
6250mL的異丙醇，IOOmL冰醋酸，650mL去離子水后，充分攪拌溶解，過濾除去顆粒物質后，室
溫保存；脫色液量取50mL的乙醇、IOOmL冰醋酸、850mL去離子水，置于IOOOmL燒杯中，充
分混合后待用。1. 1. 4. 2ffestern blot 檢測試劑轉移緩沖液甘氨酸2. 9g、Tris base 5. 8g、SDS 0. 37g、甲醇 200mL,調 ρΗ8· 3 加 水至 IOOOmL ；封閉液含3% BSA 的 TBS ；洗滌液TBST(0. 05%Tween-20)稱取8. 8g NaCl，加入于800mL去離子水，充分溶 解后，加入 20mL pH 8. 01. 0mol/LTris-HCl,0. 5mL Tween20，定容至 1000mL。1.1. 5 培養基LB液體培養基在950ml dH20中加入細菌培養用胰蛋白胨10g，細菌培養用酵母 提取物5g，NaCl 10g，完全溶解后用5mol/L NaOH調節pH值至7. 0，加入去離子水至總體積 為1L，121°C高壓下蒸汽滅菌20min，4°C保存。LB固體培養基在IL LB液體培養基中加入 30g的瓊脂粉，高壓滅菌。1. 2 方法1. 2. 1目的基因的擴增與克隆根據MPT64基因的序列以及pMD18-T simple vector和pET28a+表達載體的特點 分別設計兩端含有限制性內切酶Nde I.Sal I酶切位點的引物用PCR的方法從BCG基因組中擴增出MPT64基因片段。回收PCR產物，與pMD18_T simple vector相連構建重組質粒pMDMPT64，重組質粒pMDMPT64送上海生工生物公司進行 測序。1. 2. 2重組表達質粒pETMPT64的構建、表達質粒轉入BL21表達菌用限制性內切酶 Nde I與Sal I同時消化pMDMPT64與pET28a+，分別凝膠回收純化MPT64與pET28a+基因 片段。用T4連接酶使之聯接，構建重組質粒PETMPT64。將質粒快速轉化受體菌，用涂布棒均勻涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。 37 °C孵箱過夜培養。1. 2. 3融合蛋白MPT64_His的表達。取單個轉化菌落接種到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培養液中。加入IPTG 至終濃度lmmol/L進行誘導，37°C繼續震蕩培養。4h后，收集菌體。1. 2. 4ffestern-blot 免疫鑒定把硝酸纖維素濾膜漂浮于一盤去離子水中，借毛細作用使之從下往上濕潤后，將 之浸沒于水中，浸泡5min以上以驅除留于濾膜上的氣泡。把PVDF膜放在濾紙上，要保證精 確對齊，而且在3mm濾紙與硝酸纖維素濾膜之間并不留有氣泡。將陰極放于濾紙上，石墨一 邊朝下。接電源(將陽極導線接于底部石墨電極)。按0. lmL/cm2的量加入第一抗體。將濾膜平放在平緩搖動的搖床上，于4°C溫育 2h。用50mlTBST洗滌3次，每次lOmin。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體 (1 5000稀釋)，于室溫平緩搖動2h。用50mlTBST洗滌4次，每次lOmin。加入0. 4mlTMB 顯色至目的條帶清晰，加蒸餾水終止反應。1.2. 7親和層析純化重組蛋白
1. 2. 7. 1菌體的裂解每克菌(濕重)加入3ml 裂解緩沖液(pH7. 920mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L imidazole，0. 5mmol/L NaCl)，重懸細菌沉淀。按每毫升裂解緩沖液加入10 μ 1 MgSO4 (Imo 1/ L)，10 μ IDnase (2mg/mL)，2 μ 1 PMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三種試劑，冰上孵育 30min 5000轉離心15min收集沉淀，按每克菌濕重加入5ml結合緩沖液的比例，將沉淀用結 合緩沖液重懸，-70°C放置過夜。將-70°C放置的菌液冰上融化后，超聲破碎菌體。5000rpm, 4°C離心15min，收集上清。-70°C保存或立即用于純化。樣品的吸附與洗滌將待純化的樣品加到金屬鰲合的柱中，并以最佳流速讓其流 過柱床。用洗滌緩沖液洗柱，一直到流出樣品的紫外監測值為基線水平。2結果MPT64在大腸桿菌中得到表達，并純化。純化的蛋白質量見圖2。實驗例1Δ BCG分子標記功能的驗證Δ BCG分子標記功能是本發明的主要目的所在，為了進一步驗證本發明的正確 性，設計實驗，驗證本發明。用結核桿菌與ABCG接種小鼠實驗，初步建立了這一診斷方法。1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 菌株結核桿菌本研究室保存；Δ BCG見上述。1. 1. 2ELISA 試劑配制:(1)包被液碳酸鹽緩沖液Na2CO3 (無水碳酸鈉)1. 6g，NaHCO3 (碳酸氫鈉)2. 9g，加去離子水至1000mL。(2)洗滌液pH9· 2磷酸鹽緩沖液(Tween-2O)Na2HPO4 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g, KH2PO4 0. 2g, NaCl 18g，吐溫-20 0. 5mL 加去離子 水至IOOOmL(3)甲液 0. lmol/L 檸檬酸 4. 2g/200mL，乙液 0. 2mol/L Na2HPO4 · 12H20 14. 3g/200mL，取甲液24. 3mL與乙液25. 7mL混合，臨用前加20mg鄰苯胺(OPD)，加過氧化氫 (H2O2) 0. 02mL。(4)終止液2mol/L H2SO4溶液取分析純濃硫酸IlOmL,加去離子水至100mL。1.1. 3實驗動物昆明鼠購自長春市生物制品所1.2 方法1. 2. 1結核桿菌接種小鼠前的處理用PBS洗6次，然后用生理鹽水稀釋到5000株/mL。1.2. 2實驗小鼠的接種把布魯菌結核桿菌與Δ BCG培養到對數生長期，用生理鹽水洗滌三次；用生理鹽 水稀釋到目的濃度；對小鼠采用腹腔注射。1. 2. 3被檢動物血清的制備對用結核桿菌與Δ BCG免疫14天的小鼠斷尾采血，血樣在37°C放置3個小時后， 取上清即為制備血清。
1.2. 4檢測方法(I)ELISA檢測按常規方法進行，將純化的目的蛋白稀釋到lOng/mL后包被酶標 板，用被檢動物血清1 300稀釋作為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 1 3000 稀釋作為二抗。同時用標準陰性和標準陽性血清作對照。(2)操作過程用微量移液器向每個孔內加IOOyL包被液稀釋的蛋白樣品，置濕 盒內于37°C恒溫培養箱中lh，然后于4°C冰箱中包被過夜。次日，用洗滌液洗滌二次，甩去 洗滌液，倒置在紗布上輕輕拍扣使孔內的液體充分流出，每次間隔3min。向孔內分別加入 用稀釋液稀釋好的1 100陽性血清、陰性血清0. lmL，置濕盒內于37°C恒溫箱中反應Ih 后，甩去血清，用上面的方法洗滌3次，再加入稀釋好的1 200酶標記兔抗牛IgG 0. ImL, 置于濕盒內于37°C恒溫箱靜置，甩去殘留的酶標記物溶液，以同法洗滌三次。加入底物溶液 ΙΟΟμ L/mL，置濕盒內于37°C恒溫箱中靜置30min，取出后立即向孔內加入0. 02mL終止液， 終止反應。(3)結果判定將培養板放入分光光度計讀取450吸收波的OD值。2結果用MPT64 蛋白區分接種結核桿菌與Δ BCG菌體的小鼠將純化的ΜΡΤ64蛋白作抗原，用ELISA法檢測結核桿菌與Δ BCG接種7d的小鼠血 清中是否含有MPT64蛋白的抗體，很易容區分結核桿菌和Δ BCG接種的小鼠。具體數具見 表1。表1結核桿菌與Δ BCG接種小鼠后ELISA檢測血清結果 實驗例2、Δ BCG免疫保護性鑒定理論上講，Δ BCG的免疫保護性比一般的BCG強。本發明以小鼠為實驗動物，接種 相同劑量的Δ BCG與BCG，而后攻入標準毒株，而后檢測觀察小鼠的臨床癥狀及最小致死數 量，比較分析了它們的免疫保護性強弱。1材料與方法1.1細菌的處理用無菌生鹽水洗三次，再分別稀釋到每mL 5億、1千萬、1百萬個菌。
1. 2接種小鼠的癥狀觀察取1萬Δ BCG與BCG菌體接種的小鼠，14天后，用標準毒株攻毒，分別觀察接種后 2d、5d、8d小鼠的臨床表現和死亡情況，以此分析Δ BCG與BCG免疫保護性。2結果Δ BCG 與其親本株BCG相比，免疫保護性明顯增強。具體數據見下表2。表權利要求
一種分子標記、高免疫保護性的結核桿菌弱毒疫苗，特征在于該疫苗是將結核桿菌外分泌免疫保護基因30KD替換其親本株BCG的MPT64基因，對其加以MPT64基因分子標記。
2.根據權利要求1所述結核桿菌弱毒疫苗的構建方法，包括以下步驟以結核桿菌的弱毒疫苗株BCG為起始材料，以PCR的方法從標準結核桿菌毒株的基 因組中擴增出要改造的目的基因MPT64的引導序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改 造；把經改造的引導序列克隆到pBluescript SK+上而成重組質粒；用同樣的方法得到結 核桿菌免疫保護性基因30KD的引導序列，克隆到T載體上，進行基因改造，并把它連接到 pBluescript SK+ 重組質粒；用電轉化法把這兩個自殺性質粒依次轉入結核桿菌BCG中，轉入受體菌細胞內的超螺 旋的自殺質粒便會被線性化，插入受菌體BCG的基因組中，線性化的質粒與MPT64基因發生 置換，即得疫苗。
全文摘要
本發明提供了一種分子標記、高免疫保護性的結核桿菌弱毒疫苗及制備方法，使用基因定向改造的技術，定向的改造已經沉默的BCG免疫保護性基因，以提高BCG的免疫保護性。提供的結核桿菌弱毒疫苗具有分子標記、免疫保護性能增強的特點，用血清學檢測方法就能區分感染的人與動物是疫苗接種還是野生菌感染；該疫苗免疫保護性能較親本株強。這對結核桿菌病監測、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有廣泛的應用實踐價值。
文檔編號A61K39/04GK101912606SQ201010242139
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月2日 優先權日2010年8月2日
發明者宮鵬濤, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 閆廣謀 申請人:吉林大學