防治單純皰疹病毒i型或ii型感染的重組減毒活疫苗和制備方法

專利名稱：防治單純皰疹病毒i型或ii型感染的重組減毒活疫苗和制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種能夠防治單純皰疹病毒I型或單純 皰疹病毒II型感染所致疾病的基因重組減毒活疫苗和制備方法。
背景技術：
單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是一種經皮膚和粘膜密切接觸傳播 的病毒，包括單純皰疹病毒I型(簡稱HSV-1)和單純皰疹病毒II型(簡稱HSV-2)，兩種 病毒具有83%以上的共同基因特征，50%以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可 高達80%以上，并長期潛伏于感覺神經節內，雖然大多數HSV-I感染者沒有明顯癥狀，但 少數感染者可產生終生的反復發作的面口皰疹、致盲性很高的眼內眼炎以及致命性的皰疹 性肺炎和皰疹腦炎。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，占生殖器皰疹原發感染的90%以 上。II單純皰疹病毒感染人類后主要引起生殖系統原發性和復發性皰疹，可以終生潛伏在 神經節內，在機體免疫力降低時復發。孕婦感染HSV-II型病毒后易發生流產，也可致胎兒 先天畸形或智力低下。新生兒在分娩時感染可導致高熱、呼吸困難或中樞神經系統病變，其 中60% -70%的新生兒可能死亡。此外，有研究表明，生殖器皰疹可將艾滋病感染風險增加 2-3倍，并促進艾滋病病毒的傳播。研究表明安全套并不能有效預防皰疹病毒感染，世界范 圍內生殖器皰疹發病率在逐年上升，據美國最新統計數據顯示，美國成人生殖器皰疹患病 率已經上升到了 16%以上，在紐約已經上升至25%以上，目前并無單純皰疹病毒感染，尤 其是復發性感染的特效治療方法，抗病毒藥物常規用藥雖能緩解一些臨床癥狀，但不能徹 底清除體內潛伏的病毒，也不能減少復發次數，因此迫切需要開發能有效防治單純皰疹病 毒感染的疫苗。近數十年來世界各國HSV疫苗的研究結果表明，傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗免 疫原性弱，僅能誘導體液免疫應答，細胞免疫誘導效果較差；新型DNA疫苗雖能同時誘導體 液和細胞免疫，但是其轉染效率較低，經粘膜免疫誘導有效的粘膜免疫應答能力更低。而在 單純皰疹病毒的免疫應答過程中，細胞免疫和粘膜免疫發揮著更大的作用，但上述幾類疫 苗均不能有效誘導細胞免疫和粘膜免疫應答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應用的 疫苗上市，單純皰疹病毒疫苗基本上都處于臨床前或臨床研究階段。病毒減毒活疫苗是最為經典的疫苗形式，這種類型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰質 炎疫苗等在人類抵抗感染性疾病的歷史上發揮了不可替代的作用，為人類的健康做出了不 可磨滅的貢獻。減毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一 樣的感染和復制特性，但沒有致病作用，此類疫苗可以有效地誘導機體產生全面的免疫應 答，相對于其它種類的疫苗而言，免疫原性強，保護效果好。傳統的減毒活疫苗主要是通過連續培養篩選得到的，但這種方法耗時費力，用這 種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。近年來，研究者開始采用現代分子生物 學技術，將HSV基因組的特定基因進行敲除以獲得重組株。本發明則是利用現代分子生物學技術，以Genebank中的HSV-I和HSV-2基因組參考序列(HSV-I登錄號NC_001806，HSV-2 登錄號NC_001798)為藍本，通過聯合敲除多個基因，篩選出了 HSV-I型和HSV-2型重組減 毒株，它們的致病能力均發生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-I和HSV-2感染所
致疾病。

發明內容
本發明的目的是提供能夠預防和治療單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II感染 所致疾病的重組減毒活疫苗及所述疫苗的制備方法。本發明涉及的單純皰疹病毒I型重組株或單純皰疹病毒II型重組株，均由野生型 HSV-I或野生HSV-I經過重組、篩選和純化得來的。所采用的技術方案是取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分 離鑒定出野生型HSV-I和HSV-2 ；擴大培養后提取病毒完整基因組；和含有熒光表達基因及 擬定敲除的HSV基因左右兩側700bp至2000bp的同源側翼序列的穿梭載體共同轉染Vero 細胞；在熒光顯微鏡下使用一種或者聯合使用多種熒光蛋白基因作為標記挑選出重組病 毒，經過空斑純化后可獲得所需要的重組減毒活疫苗。可以獲得一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組中 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-1 重組株。可以獲得一種其上所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，在于聯合敲除 了其基因組中的UL43到UL4之間的基因片段和其它復制或感染非必需基因片段的HSV-I 重組株；所述其它復制或感染非必需基因片段是指US9、US10、US11、US12基因，UL55、UL56 到左側RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因或三者的任意組合。可以獲得一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組中 的US2、US3、US4和US5基因的HSV-I重組株。可以獲得一種如上所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，在于聯合敲除 了其基因組中的US2、US3、US4、US5基因和其它復制或感染非必需基因片段的HSV-I重組 株；所述其它復制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USll、US12基因，UL55、UL56到左 側RL2、RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意組合。可以獲得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組 中的 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-2 重組株。可以獲得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在于聯合敲 除了其基因組中的UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因和其它復制或感染非必需基因片段 的HSV-2重組株所述其它復制或感染非必需基因片段是US9、US10、US11、US12基因，UL55 UL56到左側RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因，或者上述三者的任意組合。可以獲得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組 中的US2、US3、US4和US5基因的HSV-2重組株。可以獲得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在于聯合敲 除了其基因組中的US2、US3、US4、US5基因和其它復制或感染非必需基因片段的HSV-2重 組株；所述其它復制或感染非必需基因片段是US9、US10、USll、US12基因，UL55、UL56到左 側RL2和RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意組合。
用類似的方法在上述重組株的基礎上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一 步減低的重組株。作用在小鼠身上可證明，上述的重組株病毒致病能力均有不同程度的減弱，可以 保護小鼠免受致死量單純皰疹病毒I型或II型的攻擊；作用在豚鼠身上證明重組株可以預 防和治療豚鼠生殖器皰疹。上述重組株可以作為重組單純皰疹病毒減毒活疫苗以防治單純 皰疹病毒感染所致相關疾病。本發明用以構建同源重組穿梭質粒的pShuttle-CMV質粒購自Stragene公司，序 列和物理圖譜見該公司的產品目錄。本發明所用熒光標記基因是綠色熒光蛋白表達盒和紅色熒光蛋白表達盒。本發明的有益效果相比傳統疫苗而言，本發明制備的減毒活疫苗均是經過基因 工程重組后的減毒活疫苗，不易發生毒力回復，其它生物學特性和野生型單純皰疹病毒相 似，但進入機體后僅能刺激機體產生免疫應答而無致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保 留了單純皰疹病毒I型或II型的大部分抗原，具有較高的免疫原性，能很好地模擬野生型 HSV-I或HSV-2，有效地誘導機體粘膜和體液免疫應答，構建機體抵抗皰疹感染的第一道防 線，降低人群發病率；激發細胞免疫應答，構建機體的第二道防線，有可能清除已感染病毒， 控制皰疹的復發和傳播。


圖1重組單純皰疹病毒減毒活疫苗的構建策略示意圖；圖2重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSHOlL結構示意圖；圖3重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSHOILS結構示意圖；圖4重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSH01S1結構示意圖；圖5重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSH01SS結構示意圖；圖6重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02L結構示意圖；圖7重組單純皰疹病毒減毒11型活疫苗JSH02LS結構示意圖；圖8重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02S1結構示意圖；圖9重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02SS結構示意圖；圖10重組單純皰疹病毒減毒I I型活疫苗JSH02LR結構示意圖；圖11重組單純皰疹病毒減毒11型活疫苗JSH02RS結構示意圖。
具體實施例方式本發明技術方案中單純皰疹病毒I型或II型重組減毒活疫苗的總體構建策略參 見附圖1。提取野生型HSV-I和HSV-2完整基因組；構建含有綠色或紅色熒光表達基因及 擬定敲除的HSV基因左右兩側700bp至2000bp的側翼序列的同源重組穿梭載體，二者共同 轉染Vero細胞，在熒光顯微鏡下挑選表現相應顏色熒光的重組病毒，經過空斑純化后可獲 得敲除了 HSV-I或HSV-2重組減毒活疫苗。其中敲除了HSV-I UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因的 HSV-1 重組株，命名為 JSHOlL ；敲除了HSV-I UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-1 重組株，命名為JSHOlLS。
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敲除了HSV-1US2、US3、US4、US5 基因的 HSV-1 重組株，命名為 JSHOlS ；敲除了HSV-1US2、US3、US4、US5 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-I 重組株，命 名為 JSH01SS。敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因的 HSV-2 重組株，命名為 JSH02L ；敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-2 重組株，命名為JSH02LS。敲除了HSV-2US2、US3、US4、US5 基因的 HSV-2 重組株，命名為 JSH02S ；敲除了HSV-2US2、US3、US4、US5 和 US9、US10、US11 US12 基因的 HSV-2 重組株，命 名為 JSH02SS。用類似的方法在上述重組株的基礎上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一 步減低的重組株。實施例1重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL構建1.分離野生型HSV-I和HSV-2(1)取臨床HSV感染的病人皰疹液和分泌物，加入ImlPBS緩沖液后用0. 45微米濾
器過濾ο(2)取一個六孔板，每孔傳2 X IO5個Vero細胞，在5個孔內每孔加入200微升病 毒過濾液，一個孔留作對照。(3)放入37°C二氧化碳培養箱中培養48-72小時后觀察孔內細胞病變效應(CPE)。(4)待六孔板孔內細胞出現完全CPE后將培養基和細胞一起收入離心管中。(5)將離心管在37°C -負80°C下凍融3次，5000轉離心10分鐘后將上清轉入2ml EP管中，放入負80°C冰箱中備用。(6)自EP管中取200微升病毒液，利用HSV分型鑒定引物分型，分離一株HSV-I和 一株 HSV-2。2.提取HSV-I基因組(1)感染前一天，胰酶消化并計數vero細胞，每個IOcm平皿接種3 X IO6細胞，補 足IOmL含血清正常細胞生長培養液。(2)感染當天，確認細胞達到80-90%融合。加原始HSV-I病毒粗體液100微升 (如果已知滴度則按MOI = 10)到細胞中，蝸旋平皿輕輕混勻。(3)在37°C C02培養箱培養，直到80-90%的細胞出現圓縮(一般感染后2_3天)。(4)用吸管輕輕吹打平皿，將細胞和培養基一起轉移至無菌15mL離心管中， 于-80°C 30分鐘，然后在37°C水浴15分鐘解凍。重復此步驟三次，3000轉離心15min。(5)收集上清液于-80°C保存。(6)0. 45微米過濾后加保護劑保存于-80°C。若需要長期保存，則加入10%甘油， 置于-80°C。HSV-I在4°C保存時滴度下降比較快，所以HSV-I應該分裝保存在一 80°C，每 次使用時取出實驗所需量，一次用完，無需反復凍溶，既能保證每次使用的滴度，又能大大 降低HSV-I被污染的機率。(7)取300微升病毒液加入700微升高純水，加入10微升蛋白酶K、10%的SDS50 微升(使終濃度分別稀釋為蛋白酶K的100倍稀釋、SDS的50倍稀釋)混勻。37°C水浴過 夜。
(8)加入同體積的酚12000rpm離心5min。收集上層液體。一般情況下抽提2_3
次，至無蛋白析出。(9)加入同體積的酚氯仿異戊醇(即500微升氯仿異戊醇、500微升酚)12000rpm 離心5min抽提2-3次，收集上層液體。(10)加入4°C預冷的十分之一體積的乙酸鈉、2. 5倍體積的-20°C預冷的無水乙 醇，-20°C沉淀30min或過夜。(11) 12000rpm 4°C離心 15min。棄上清。(12) lml4°C預冷的 70% 乙醇洗 1-2 遍，12000rpm 4°C離心 5min。(13)棄上清，自然干燥或37°C干燥。3.構建同源重組穿梭載體pShuttle-01L-GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001806的HSV-1基因組UL區UL43 UL47的序列， 分別設計UL43基因的左側側翼序列和UL47基因的右側側翼序列的擴增引物。(2)UL43側翼序列的引物設計在UL43左側翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在UL43 左側翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環 后回收目的條帶。(3) UL47側翼序列的引物設計UL47右側翼序列上游引物5，末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，UL47 右側翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后回 收目的條帶。 (4) PCR擴增GFP表達質粒pLK0_GFP (由本公司自己構建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切UL47側 翼序列PCR產物，回收酶切產物。(7)分兩步將步驟(5)和(6)中回收的產物克隆至pShuttle-CMV載體上后即構建 成功 pShuttle-01L-GFP。4.同源重組生產HSV-I重組株JSHOlL(1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-OlL-GFP質粒。(2)用脂質體2000將HSV-I基因組和pShuttle-01L_GFP質粒共轉染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH01L，參見附圖2。(6)用Vero細胞增殖后用TCID50法測定滴度實驗操作
(6. 1)收集一瓶Vero細胞，計數。(6. 2)用 DMEM 2%準備 20ml 105/ml 細胞。(6. 3)用12道排槍在2塊96孔板中每孔加入IOOul細胞懸液。(6. 4)稀釋病毒液，在第1管中加入0. 9ml DMEM 2%，其余加入1. 8ml。(6. 5)在第1管中再加入0. Iml病毒保存液。(6. 6)換用新槍頭，上下吸打5次混勻。(6. 7)從第1管中吸取0. 2ml加入第2管中。(6.8)反復稀釋至最高稀釋度。(6. 9)用同一管病毒保存液進行第2輪稀釋。(6. 10)最后8個稀釋液加入96孔板，每孔0. 1ml，每個稀釋度10孔，2孔為陰性對 照。陰性對照孔中加入0. Iml DMEM 2%監測細胞存活情況。加樣時從最高稀釋度開始。(6. 11)37 °C 培養 10 天。(6. 12) 10天后倒置顯微鏡下觀察，計算每一排中出現CPE的孔數。只要有一小點 或是一些細胞出現CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較。(6. 13)計算每一排中出現陽性的孔數。如果陰性對照中無任何CPE且細胞生長良 好，最低稀釋度100%陽性而最高稀釋度100%陰性，則本測試即為有效。按照下述公式計 算滴度=T = 101+d(S-0. 5) IU/ml，其中d = LoglO稀釋倍數，S =從第一次稀釋起的陽性比 率之和，2次平行實驗得到的滴度值應相差< 10°_7。實施例2重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL的致病能力減低1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增后測定滴度，滴度約為1 X 109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL 用Vero細胞擴增后滴度約為1 X IO9IU/ ml ；普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-30共30個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、正常劑量組和高劑量組三組。2.實驗操作經鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰疹病毒I型20微升，正常劑量組給予20 微升JSH01L，高劑量組給予100微升JSH01L，觀察小鼠情況。3.結果對組組小鼠在滴鼻后第5天開始出現死亡情況，第13天后全部死亡，死 亡率為100% ；正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，這說明和野生型相比，JSHOlL幾乎沒 有致病能力。實施例3活疫苗JSHOlL對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增HSV-I后測定滴度，滴度約為 lX109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL 用Vero細胞擴增后滴度約為1 X IO9IU/ ml ；正常細胞裂解液培養皿中正常培養的Vero細胞刮下后在-80°C和37°C反復凍融后過濾。普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-30共30個阿拉伯數字，按隨機化原則分為15只/組，分為 陰性組和陽性組共兩組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量=IO7TCID5tl重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-1 進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(1)小鼠隨機分組后陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于50微升正常細胞裂解液；陽 性組同樣方法給于50微升JSH01L，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-I 病毒(含 IO8IU)。2)小鼠腹腔內注射HSV-10. lml。3)觀察小鼠情況結果小鼠攻毒后陰性組死亡情況。攻毒后第5d開始出現死亡情況，第13后全部 死亡，陽性組存活。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量單純皰疹病毒I型攻擊。實施例4重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOILS構建JSHOILS的構建策略和方法類似實施例1，具體詳述如下1.構建舊9、舊10、舊11、舊12基因聯合敲除的把￥-1敲除株幾!1015。(1)構建同源重組穿梭載體pShuttle-01-RED。1. 1)參考NCBI上登錄號為NC_001806的HSV-1基因組的US區US9 US12的序 列，分別設計US9基因的左側側翼序列和US12基因的右側側翼序列的擴增引物。1. 2)US9側翼序列的引物設計在US9左側翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US9左 側翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后 回收目的條帶。1. 3) US12側翼序列的引物設計US12右側翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US12 右側翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后回 收目的條帶。1. 4)用 BglII 和 BamHI 雙酶切 pDsredl-cl，連接，轉化，得 pDsredbb 質粒。1. 5)用AseI和MluI切pDsredbb質粒，電泳回收1. 5kb片段1. 6)用NotI和PmeI酶切US9側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切US12側 翼序列PCR產物，回收酶切產物。1. 7)將步驟1. 5)和1. 6)中回收的產物分兩步克隆至pShuttIe-CMV載體后即構 建成功 pShuttle-01-RED。(2)同源重組生產HSV-I敲除株JSHOlS2. 1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-Ol-RED質粒。2. 2)用脂質體2000將HSV-I基因組和pShuttle-01-RED質粒共轉染至vero細胞。2. 3)在倒置熒光顯微鏡下將紅色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。2. 4)將EP管在_80°C -37°C反復凍融三次。2. 5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯 微鏡下挑出紅色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I重組株JSH01S。2. 6)用Vero細胞擴增JSHOlS后提取基因組備用。2.聯合應用紅色和綠色熒光標記構建HSV-I重組減毒活疫苗JSH01LS—一同源重 組生產HSV-I敲除株JSHOILS(1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-OlL-GFP質粒。(2)用脂質體2000將表達紅色熒光JSHOlS基因組和pShuttle-OlL-GFP質粒共轉 染至vero細胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將同時表現紅色和綠色熒光的CPE處的細胞吸出，轉移 至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C -37°C反復凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I重組株JSH01LS，參見附圖3。實施例5重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01LS的致病能力減低1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增HSV-I后測定滴度，滴度約為 lX109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01LS 用Vero細胞擴增后滴度約為1 X IO9IU/ ml ；普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-30共30個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、正常劑量組和高劑量組三組。2.實驗操作 經鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰疹病毒I型20微升，正常劑量組給予20 微升JSH01LS，高劑量組給予100微升JSH01LS，觀察小鼠情況。3.結果對照組小鼠在滴鼻后第5天開始出現死亡情況，第13天后全部死亡，死 亡率為100% ；正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，死亡率是0，這說明和野生型相比， JSHOILS幾乎沒有致病能力。實施例6活疫苗JSH01LS對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增HSV-I后測定滴度，滴度約為 lX109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01LS 用Vero細胞擴增后滴度約為IX IO9IU/ ml ；正常細胞裂解液培養皿中正常培養的Vero細胞刮下后在-80°C和37°C反復凍融后過濾。普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-30共30個阿拉伯數字，按隨機化原則分為15只/組，分為 陰性組和陽性組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量107TCID50重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-I 進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(1)小鼠隨機分組后，陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于50微升正常細胞裂解液； 陽性組同樣方法給于50微升JSH01LS，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-1 病毒(含 IO8IU)。2)小鼠腹腔內注射HSV-10. lml。3)觀察小鼠情況4.結果小鼠攻毒后陰性組死亡情況。攻毒后第5天開始出現死亡情況，第13后 全部死亡，死亡率為100% ；陽性組全部存活，死亡率是0。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗 可抵抗致死量病毒攻擊。實施例7重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01S1的構建1.構建同源重組穿梭載體pShuttle-01S-GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001806的HSV-I基因組US區US2 US5的序列，分 別設計US2基因的左側側翼序列和US5基因的右側側翼序列的擴增引物。(2) US2側翼序列的弓丨物設計在US2左側翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US2左 側翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后 回收目的條帶。(3)US5側翼序列的引物設計US5右側翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US5右 側翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后回收 目的條帶。(4) PCR擴增GFP表達質粒pLK0_GFP (由本公司自己構建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切US2側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切US5側翼 序列PCR產物，回收酶切產物。(7)分兩步將1. 5)和1. 6)步驟中回收的產物克隆至pShuttle_CMV載體上即構建 成功 pShuttle-01 S-GFP。2.同源重組生產HSV-I敲除株JSH01S1(1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-OlS-GFP質粒。
(2)用脂質體2000將HSV-I基因組和pShuttle-OlS-GFP質粒共轉染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C -37°C反復凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH01S1，參見附圖4。實施例8重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01S1的復制感染能力減低1.實驗材料野生型HSV-I，JSHOlSi, Vero細胞，六孔板。2.實驗方法六孔板內每孔傳入5 X IO5個Vero細胞，培養24小時，按感染復數 (MOI) 0. 1和1分別用野生型HSV-I和JSH01S1感染六孔板其中四孔，剩余兩個孔做為對照， 觀察病毒感染孔細胞病變效應產生情況。3.結果預期野生型HSV-148小時至72小時左右完全產生CPE，而JSH01S1在6 到7天左右方可產生完全CPE，說明重組株JSH01S1相對于野生型HSV-I而言復制和感染能 力明顯降低。實施例9重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOISl的致病能力減低1.實驗方法和實施例2所用方法相同，經鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰 疹病毒I型20微升，正常劑量組給予20微升JSH01S1，高劑量組給予100微升JSH01S1，觀 察小鼠情況。2.結果預期對照組小鼠在滴鼻后第5天開始出現死亡情況，第13天后全部死 亡，死亡率為100%;正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，死亡率是0，說明和野生型相比， JSHOISl幾乎沒有致病能力。實施例10活疫苗JSH01S1對小鼠的免疫保護實驗1.實驗方法和實施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，預期陰性組攻毒后第5 天開始出現死亡情況，第13后全部死亡，死亡率為100%;陽性組全部存活，死亡率是0。預 期陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例11聯合應用紅色和綠色熒光標記構建重組單純皰疹病毒減毒活疫苗 JSHOISS1.用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取實施例4中構建的pShuttle-01-RED 質粒。2.擴增實施例7所構建的表達綠色熒光的重組型病毒JSH01S1。3.用實施例1中基因組提取方法提表達綠色熒光的重組型病毒JSH01S1的基因組。4.用脂質體2000將JSH01S1基因組和pShuttle_01-RED質粒共轉染至vero細 胞。5.在倒置熒光顯微鏡下將同時表現紅色熒光和綠色熒光的CPE處的細胞吸出，轉 移至含有IML培養基的EP管中。6.將EP管在_80°C -37°C反復凍融三次。7.將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微鏡下挑出同時表現紅色熒光和綠色熒光的空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株 JSHOlSSo參見附圖5。實施例12重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOISS的致病能力減低實驗方法和實施例2所用方法相同，經鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰疹 病毒I型20微升，正常劑量組給予20微升JSH01SS，高劑量組給予100微升JSH01S1，觀察 小鼠情況。結果預期對組組小鼠在滴鼻后第5天開始出現死亡情況，第13天后全部死亡， 死亡率為100% ；正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，死亡率是0，這說明和野生型相比， JSHOISS幾乎沒有致病能力。實施例13活疫苗JSH01SS對小鼠的免疫保護實驗實驗方法和實施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，預期陰性組攻毒后第5天 開始出現死亡情況，第13后全部死亡，死亡率為100%;陽性組全部存活，死亡率是0。預期 陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例14重組單純皰疹病毒II型減毒活疫苗JSH02L構建1.按照實施例1中HSV-I基因組提取方法提取HSV-2基因組。2.構建同源重組穿梭載體pShuttle-02L_GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的UL43-UL47的序列，分別 設計UL43基因的左側側翼序列和UL47基因的右側側翼序列的擴增引物。(2)UL43側翼序列的引物設計在UL43左側翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在UL43 左側翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環 后回收目的條帶。(3)UL47側翼序列的引物設計UL47右側翼序列上游引物5，末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，UL47 右側翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后回 收目的條帶。(4) PCR擴增GFP表達質粒pLK0_GFP (由本公司自己構建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切UL47側 翼序列PCR產物，回收酶切產物。(7)分兩步將步驟2. 5)和2. 6)中回收的產物克隆至pShuttle-CMV載體即構建成 功 pShuttle-02-GFP。3.同源重組生產HSV-2敲除株JSH02L(1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02L_GFP質粒。(2)用脂質體2000將HSV-2基因組和pShuttle-02L_GFP質粒共轉染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH02L(圖6)。(6)用Vero細胞增殖后用TCID5tl法測定滴度。實施例15應用綠色和紅色熒光標記構建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LSJSH02LS的構建策略和方法類似先前的JSH01LS的構建方法，具體詳述如下1.構建US9、US10、US11和US12基因聯合敲除的HSV-2重組株JSH02S。(1)構建同源重組穿梭載體pShuttle-02-RED。1. 1)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的US區US9-US12的序列， 分別設計US9基因的左側側翼序列和US12基因的右側側翼序列的擴增引物。1. 2)US9側翼序列的引物設計在US9左側翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US9左 側翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后 回收目的條帶。1. 3) US12側翼序列的引物設計US12右側翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US12 右側翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后回 收目的條帶。1. 4)用 BglII 和 BamHI 雙酶切 pDsredl-cl，連接，轉化，得 pDsredbb 質粒。1. 5)用AseI和MluI切pDsredbb質粒，電泳回收1. 5kb片段1. 6)用NotI和PmeI酶切US9側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切US12側 翼序列PCR產物，回收酶切產物。1. 7)分兩步將1. 5)和1. 6)步驟中回收的產物克隆至pShuttle-CMV載體后即構 建成功 pShuttle-012-RED。(2)同源重組生產HSV-2敲除株JSH02S2. 1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02L-RED質粒。2. 2)用脂質體2000將HSV-2基因組和pShuttle_02L-RED質粒共轉染至vero細 胞。2. 3)在倒置熒光顯微鏡下將紅色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。2. 4)將EP管在_80°C -37°C反復凍融三次。2. 5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯 微鏡下挑出紅色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02S。2. 6)用Vero細胞擴增JSH02S后提取基因組備用。2.構建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LS——同源重組生產HSV-2敲除株JSH02LS(1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02L_GFP質粒。(2)用脂質體2000將JSH02S基因組和pShuttle-02L_GFP質粒共轉染至vero細 胞。
(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02LS，參見附圖7。實施例16重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02S1的構建1.構建同源重組穿梭載體pShuttle-02S_GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的US2-US5的序列，分別設 計US2基因的左側側翼序列和US5基因的右側側翼序列的擴增引物。(2)US2側翼序列的引物設計在US2左側翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US2左 側翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后 回收目的條帶。(3)US5側翼序列的引物設計US5右側翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US5右 側翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環后回收 目的條帶。(4) PCR擴增GFP表達質粒pLK0_GFP (由本公司自己構建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切US2側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切US5側翼 序列PCR產物，回收酶切產物。(7)將上述步驟(5)和(6)中回收的產物分兩步克隆至pShuttle-CMV載體后即構 建成功 pShuttle-02S-GFP。2.同源重組生產HSV-2敲除株JSH02S1(1)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02S_GFP質粒。(2)用脂質體2000將HSV-2基因組和pShuttle-02S_GFP質粒共轉染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在-80°C -37°C反復凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02S1，參見附圖8。實施例17聯合應用綠色和紅色熒光標記構建重組單純皰疹病毒減毒活疫苗 JSH02SS1.用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02-RED質粒。2.提取實施例16中構建的重組病毒JSH02S1基因組，用脂質體2000將JSH02S1 基因組和pShuttle-02-RED質粒共轉染至vero細胞。
3.在倒置熒光顯微鏡下將同時表現紅色和綠色熒光的CPE處的細胞吸出，轉移至 含有IML培養基的EP管中。4.將EP管在_80°C -37°C反復凍融三次。5.將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯 微鏡下挑出同時表現紅色和綠色熒光的空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株 JSH02SS，參見附圖9。實施例18重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02S1和JSH02SS的復制感染能力減 低實驗材料野生型HSV-2，JSH02S1, JSH02SS, Vero細胞，六孔板。實驗方法六孔板內每孔傳入5X IO5個Vero細胞，培養24小時，按感染復數 (MOI)O. 1和1分別用野生型HSV-2、JSH02S1和JSH02SS感染孔內細胞，觀察病毒感染孔細 胞病變效應產生情況。結果預期野生型HSV-2 48小時至72小時左右完全產生CPE，而JSH02S1和 JSH02SS在6到7天左右方可產生完全CPE，說明重組株JSH02S1和JSH02SS相對于野生型 HSV-2而言復制和感染能力明顯降低。實施例19重組單純皰疹病毒II型活疫苗的致病性減弱1、實驗材料 野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2后測定滴度，滴度約為 lX107IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS 用Vero細 胞擴增后將滴度均調整約為IX 107IU/ml ；普通級別實驗小白鼠50只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-50共50個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 組。2、實驗操作經腹腔注射途徑給予對照組野生型單純皰疹病毒II型200微升，其它組分別給予 200 微升 JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS，觀察小鼠情況。3、結果預期對組的小鼠在滴鼻后第5天開始出現死亡情況，第13天后全部死亡， 其它組小鼠存活，JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS的致病性均減弱。實施例20重組單純皰疹病毒II型活疫苗對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒II型和重組單純皰疹病毒減毒活疫苗同上述實施例。正常細胞裂解液培養皿中正常培養的Vero細胞刮下后在-80°C和37°C反復凍融 后過濾。普通級別實驗小白鼠50只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-50共50個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組，分為 陰性組、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量106TCID50重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-2 進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。
3.操作步驟(1)小鼠隨機分組后，陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于50微升正常細胞裂解液， 其它組分別給于50微升JSH02L、JSHOlLS, JSHOISl和JSH01SS JSH02L，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-2 病毒(含 IO6IU)。2)小鼠腹腔內注射HSV-20. Iml。3)觀察小鼠情況4、結果陰性對照組小鼠攻毒后第5天開始出現死亡情況，第13后全部死亡，其它 組全部存活。其它組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例21重組單純皰疹病毒II型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫保護實驗1、實驗材料野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2后測定滴度，滴 度約為1 X 107IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS 用Vero細胞擴增后將滴度均調整約為IX 107IU/ml ；普通級別實驗豚鼠50只，雌性，體重275 土 5g，每一只都在其身體的不同部位做 好標記，在將相應標記轉化為1-50共50個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 組。2、免疫及攻毒方案免疫劑量=IO5TCID5tl重組活疫苗；途徑鼻腔滴注，在0周實施初次免疫，2周(14 天)以后進行加強免疫一次，再過兩周以后，即第5周(35天)用野生型HSV-2進行攻擊試 驗，計算豚鼠外陰皮損累計積分，確定保護效果。3、操作步驟(1)第0周，初次免疫豚鼠隨機分組后陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于50微升 細胞裂解液；陽性組同樣方法分別給于50微升JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS，觀察 豚鼠情況。(2)第2周，加強免疫陰性對照組經鼻腔滴注途徑給于100微升細胞裂解液；陽 性組同樣方法給于100微升JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS，觀察豚鼠情況。(3)第5周，攻毒實驗；1)用棉簽蘸生理鹽水擦洗豚鼠外陰。2)用ImL注射器配上灌胃針頭吸取0. 2mlHSV_2病毒(含IO6IU)。3)將針頭伸入陰道內陰道穹隆后將病毒液注入，緩慢退出。4)用明膠海棉塞住陰道維持病毒液體24h。豚鼠出現癥狀紅腫、起皰、潰瘍、結痂。評分標準0無癥狀0.5，僅輕微紅腫；1.0，紅腫明顯，無水皰；1. 5，單個小水皰(彡2mm)；2. 0，單個大水皰(> 2mm)；2. 5，多個小水皰和/或陰道潰瘍(出血)；
3.0，多個大水皰；3. 5，嚴重外陰腫脹；4.0，多個小/大疤融合；4. 5，后肢癱瘓；5.0，外陰潰瘍，后肢癱瘓4、實驗結果預期攻毒后陰性對照組發病情況攻毒后3天全部出現初發感染癥狀，大約6 7 天，豚鼠皮損程度最嚴重，逐漸減輕，第10天后基本消失。中間偶有豚鼠病重死亡。初次發 病后13天后出現復發感染，整體評分較大；各陽性組預期偶有豚鼠出現輕微紅腫癥狀，無 其它明顯癥狀，整體評分較小。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可預防生殖器皰疹。實施例22重組單純皰疹病毒II型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫治療實驗1、實驗材料同上述實施例2、實驗方法用HSV-2病毒攻擊豚鼠后第5天，將豚鼠隨機分為5組，分別經鼻腔 途徑給予JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS各50微升；第一次免疫治療后的14天，同 途徑和劑量進行第二次免疫治療，兩周后再免疫一次，待豚鼠初發感染癥狀消退后用紫外 燈照射豚鼠外陰10分鐘以誘發復發感染，觀察豚鼠復發情況，計算皮損指數。3、實驗結果預期給藥后對照組復發癥狀明顯，評分較大，各陽性組復發癥狀輕 微，評分較小，本疫苗在豚鼠身上對復發型生殖器皰疹有一定的治療作用，可以減輕復發癥 狀。實施例23致病性進一步減低的重組單純皰疹病毒I型和II型活疫苗的構建用構建JSHlSS和JSH02SS類似的方法進一步敲除重組單純皰疹病毒I型或II型 基因組上其他復制或感染非必需的US9到US12之間的基因片段(US9、US10、USll和US12 基因)，UL55到左側RLl基因之間的基因片段(包含UL55、UL56、RL2和RLl基因)，US2到 US5之間的基因片段(包含US2、US3、US4、US5基因)，UL43到UL47基因之間的基因片段 (包含UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因)或其任意組合基因片段，以構建致病性進一 步減低的重組單純皰疹病毒I型或II型活疫苗，設計欲敲除基因片段兩側的側翼序列的引 物，擴增出約700bp至2000bp左右的側翼序列，將700bp至2000bp左右的側翼序列和空斑 篩選標記基因克隆至pShuttle-CMV載體，使空斑篩選標記基因位于兩側側翼序列之間，和 野生型或重組型重組單純皰疹病毒I型或II型基因組共轉染至Vero細胞中，進行同源重 組，空斑純化篩選出重組致病性進一步減低的重組單純皰疹病毒減毒活疫苗如JSH02LR，參 見附圖10和JSH2RS，參見附圖11等。
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權利要求
一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因。
2.一種如權利要求1所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯合 敲除了其基因組中的UL43到UL47的基因片段和其它復制或感染非必需基因片段；所述其它復制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到 左側RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因或三者的任意組合。
3.一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的US2、 US3、US4 禾口 US5 基因。
4.一種如權利要求3所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯合 敲除了其基因組中的US2、US3、US4、US5基因和其它復制或感染非必需基因片段；所述其它復制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到 左側RL2、RL1基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意組合。
5.一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的 UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因。
6.一種如權利要求5所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯 合敲除了其基因組中的UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因和其它復制或感染非必需基因片 段所述其它復制或感染非必需基因片段是US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到左 側RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因，或者上述三者的任意組合。
7.—種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的 US2、US3、US4 禾口 US5 基因。
8.—種如權利要求7所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯合 敲除了其基因組中的舊2、舊3、舊4、到舊5基因和其它復制或感染非必需基因片段；所述其它復制或感染非必需基因片段是US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到左 側RL2和RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46到UL47基因，或者上述三者的任意組合。
9.一種如權利要求1、2、3、4所述的單純皰疹病毒I型或者如權利要求5、6、7、8所述的 單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗的制備方法，其特征在于步驟一取皰疹患者的水泡液，分離鑒定出野生型單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒 II型；步驟二 擴大培養后提取病毒完整基因組，設計引物擴增出擬定敲除的基因片段的左 右兩側700bp至2000bp的同源側翼序列；步驟三將步驟二所述同源側翼序列和熒光蛋白基因克隆至PShuttle-CMV載體，使熒 光蛋白基因位于同源側翼序列之間，再和野生型或重組型單純皰疹病毒I型或II型基因組 共轉染至Vero細胞中，進行同源重組；步驟四在熒光顯微鏡下使用一種或者聯合使用多種熒光蛋白基因作為標記挑選出重 組病毒；經過空斑純化后可獲得單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫田ο
全文摘要
本發明提供一種防治單純皰疹病毒I型或II型感染的重組減毒活疫苗和制備方法，該重組減毒活疫苗在于敲除了其基因組中UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因；該方法包括分離鑒定出野生型單純皰疹病毒；擴大培養后提取病毒完整基因組，設計引物擴增出擬定敲除的基因片段的同源側翼序列；將同源側翼序列和熒光蛋白基因克隆至pShuttle-CMV載體，進行同源重組；使用熒光蛋白基因作為標記挑選出重組病毒；經過空斑純化后可獲得單純皰疹病毒基因重組減毒活疫苗。本發明制備的減毒活疫苗均是經過基因工程重組后的減毒活疫苗，不易發生毒力回復，其它生物學特性和野生型單純皰疹病毒相似。
文檔編號A61P31/22GK101926992SQ20101025360
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月16日 優先權日2010年8月16日
發明者劉景偉 申請人:鄭州金森生物科技工程有限公司