專利名稱：一種乙型腦炎疫苗制劑的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種乙型腦炎疫苗制劑的生產方法，具體涉及一種利用鋁佐劑原位吸附技術生產滅活病毒乙型腦炎疫苗制劑的方法。
背景技術：
目前，國內滅活病毒乙型腦炎疫苗制劑的生產工藝多采用凍干制劑或鋁佐劑表面吸附，國外也有關于鋁佐劑表面吸附的報道。但是，這些方法制備出的乙型腦炎疫苗產品的免疫效果均還有待提高，同時還存在陽轉率提高的情況下，發熱率也同時提高的缺陷，嚴重地影響了滅活病毒乙型腦炎疫苗產品的推廣和使用。
發明內容
因此，本發明的目的在于提供一種利用鋁佐劑原位吸附技術生產乙型腦炎疫苗制劑的方法。與無佐劑制品和表面吸附制品相比，該方法生產的乙型腦炎疫苗制劑成功地解決了陽轉率和發熱率之間的矛盾；同時疫苗的免疫持久性明顯延長。用于實現上述目的的技術方案如下一種乙型腦炎疫苗制劑的生產方法，該生產方法包括以下步驟向滅活和純化的乙型腦炎病毒培養液中加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度達到0. 05mol/L,然后在攪拌下加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3 溶液進行反應并保持體系的PH為7. 0，直至反應產物中的Al (OH) 3濃度為2. 0 2. 5mg/ml。上述生產方法還可以包括以lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋反應產物。優選地，反應產物被稀釋至Al (OH)3濃度為0. 5 0. 75mg/ml, NaCl濃度為0. 14 0. 16mol/L。上述生產方法還可以包括向稀釋后的反應產物加入添加劑。優選地，添加劑包括 1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。在上述生產方法中，所述滅活和純化的乙型腦炎病毒培養液的蛋白濃度可以為 30 80 μ g/ml。在上述生產方法中，所述乙型腦炎疫苗制劑的抗原量可以為5 IOyg/劑，補結抗原量為1 4 1 8。其中，補結抗原即是用補體結合反應測得的抗原量，可溶性抗原， 如蛋白質、多糖、類脂、病毒等或者顆粒性抗原，與相應抗體結合后，其抗原抗體復合物可以結合補體，但這一反應肉眼不能覺察，如再加入紅細胞和溶血素，即可根據是否出現溶血反應來判定反應系統中是否存在相對應的抗原和抗體，此反應即為補體結合反應。本發明還提供了上述生產方法制備的乙型腦炎疫苗制劑。與現有技術相比，本發明的生產方法采用鋁佐劑原位吸附技術因而具有以下顯著的優點1、鋁佐劑原位吸附制品的中和抗體效價明顯提高。小鼠一針和二針免疫中和抗體效價的檢測結果表明，鋁佐劑原位吸附制品的中和抗體水平大大高于無佐劑制品，免疫效果持久。人體臨床試驗結果表明，與市場上的對照產品相比，鋁佐劑原位吸附制品能夠明顯增強免疫反應，陽轉率、中和抗體滴度和免疫持久性均大大提高。2、有效地解決了陽轉率和發熱率之間的矛盾。無佐劑乙腦疫苗和鋁佐劑表面吸附乙腦疫苗都存在抗原量和發熱率之間的矛盾， 增加抗原量有利于提高陽轉率，但同樣發熱率也會有大幅度提高。現有產品通常以降低陽轉率和中和抗體滴度為代價來控制發熱率。鋁佐劑原位吸附解決了陽轉率和發熱率之間的矛盾。表面吸附是預先生成氫氧化鋁，再用氫氧化鋁吸附抗原。吸附均發生在佐劑表面。與此不同的是，原位吸附氫氧化鋁的生成過程與吸附過程同時進行，吸附過程中不斷生成的鋁佐劑將抗原緊緊包裹在內部。這種疫苗經免疫進入人體后，鋁佐劑還具有緩釋抗原作用， 因而在保證陽轉率和中和抗體滴度大幅提高的情況下還能有效降低發熱反應的發生率。3、原位吸附有利于提高產品的穩定性，延長貨架期。國內外現有的鋁佐劑表面吸附制品都存在容易解吸附、穩定性差、貨架期短以及效力降低等缺點，而且解吸附的抗原容易成團使發熱率升高。現有制品的有效期一般為 18 M個月，而鋁佐劑原位吸附的制品穩定性更好，貨架期延長，有效期可以穩定保持在 36個月以上。4、免疫持久性延長有利于加強對免疫人群的保護作用。現在的免疫程序為基礎免疫注射兩針，1年后加強免疫1次。臨床研究結果表明， 現有的乙腦疫苗產品基礎免疫六個月后人群中和抗體陽性率降至40%以下，本發明的方法生產的疫苗基礎免疫六個月后人群中和抗體的陽性率能維持在90%以上。證明本發明的方法生產的疫苗免疫持久性大大延長。按照流行病學普遍規律，人群中和抗體陽性率維持在 60%以上，才能產生足夠的保護屏障，完全控制疾病流行。因此，本發明的方法生產的疫苗有利于加強對免疫人群的保護作用。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1 本發明生產的制劑與已有制劑的抗體陽轉率的統計結果比較；圖2 本發明生產的制劑與已有制劑的中和抗體滴度比較；圖3 本發明生產的制劑與已有制劑的免疫持久性(6個月)比較。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。實施例11、VERO種子細胞的復蘇1. 1VER0細胞株的來源VERO細胞原始來源為ATCC (編號為F-12313)，經傳代擴增建立了主細胞庫和工作細胞庫，并保存于液氮中。主細胞為129代；工作細胞為133代，凍存密度為4X106/ml。1. 2VERO種子細胞的復蘇取液氮罐內保存工作庫細胞一支，39°C溫水迅速融化后，將細胞懸液按約IXlO5/cm2接種密度轉入175cm2方瓶中，逐步滴加培養基(含10% (體積/體積)胎牛血清的M199 培養基(M199干粉培養基組成成分見GIBCO培養基手冊)至60mL，37°C和5% CO2培養箱
中培養。2、在175cm2方瓶中培養一級種子細胞復蘇的細胞培養3 4天生長成致密單層，使用0.25% (g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1 4(體積/體積)的接種比例將細胞懸液分到新培養瓶中，加入適當量的培養液(601111)，371、5(%0)2培養箱中培養3 4天后以1 4(體積/體積)比例再放大培養一次。3、在2L轉瓶中培養二級種子細胞3. 1培養基M199 培養基 9. 55g/L,NaHCO3 1. 8g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。3. 2轉瓶培養選擇2L轉瓶和四層轉瓶機，保持接種密度為1.0 2.0X105/cm2，加入500 600ml培養基，設置溫度為37°C，轉速為每分鐘1/8轉，培養3 4天。4、在14L生物反應器中培養三級種子細胞4. 1培養液M199 培養基 9. 55g/L,NaHCO3 2. 2g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。4. 2反應器選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動物細胞培養罐，罐體積為14L，工作體積為10L。4. 3微載體選擇Cytodex 1 微載體(GE 公司)，用量為 5. Og/L。4. 4上罐接種將轉瓶中培養3 4天的VERO細胞經消化后，轉移至藍蓋瓶中，吹打分散均勻，一并接入14L生物反應器，添加培養基至10L。4. 5參數控制攪拌轉速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。4. 6灌流控制接種12小時后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養5 6天。5、在75L生物反應器中培養四級種子細胞5. 1 培養基同 4. 1.5. 2反應器的選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動物細胞培養罐，罐體積為75L，工作體積為50L。5. 3微載體使用方法及用量同4. 35. 4轉罐接種將14L生物反應器中培養5 6天的細胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應后，通過管道將細胞連同微載體一并轉入75L生物反應器，定容至50L。5. 5參數控制攪拌轉速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。5. 6灌流控制接種12小時后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養5 6天。6、在300L生物反應器大規模培養VERO細胞和制備病毒液6. 1培養基和維持液配方培養基同4. 1.維持液:M199培養基 9. 55g/L，NaHCO3 2. 2g/L，蔗糖 1. Og/L，人血白蛋白 0. lg/L。6. 2反應器的選擇選擇比歐或Sartorius哺乳動物細胞培養罐，罐體積為300L，工作體積為210L。6. 3微載體用量同4. 36. 4 轉罐將75L生物反應器中培養5 6天的細胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應后，通過管道將細胞連同微載體一并轉入300L生物反應器，定容至210L。6. 5培養參數同4. 5。6. 6灌流控制接種M小時后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養5 6天。7、接種乙腦P3株病毒培養7. 1接毒方法暫停控制參數，沉降微載體和細胞，抽掉上清培養液，更換為維持液，待參數穩定后按照MOI為0.01接種病毒。7. 2參數控制攪拌轉速35 40轉/分(RPM) ；pH -J. 5 7. 6 ；DO 40 50%飽和度；溫度 33. 5 34. 5°C。7. 3以連續灌流方式收獲病毒培養液接毒12小時后開始灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，從接毒48小時起開始收獲病毒液，連續收獲8天。8、病毒收獲液的澄清過濾和超濾濃縮8. 1澄清過濾選擇膜面積為1平方米(20英寸)的Iym和0.5μπι的聚醚砜濾芯串聯，先經Ιμπι 濾膜再經0. 45 μ m濾膜過濾。8. 2超濾濃縮8. 2. 1緩沖液選擇選擇pH7. 2-8. 0無菌磷酸緩沖液沖洗平衡好超濾系統。8. 2. 2設備選擇使用Millipore公司的0. 5平方米PELLIC0N 2超濾系統，安裝2塊PELLIC0N 2超濾膜包，截留分子量為300KD的濾膜。8. 2. 3操作參數設定進液口壓力為10 20psi，回流口壓力為5 10psi，2 4小時內完成80 120L病毒液的收獲；樣品濃縮20 40倍，得到2 6L濃縮液。9、病毒滅活9. 1滅活試劑的準備先將β -丙內酯用注射用水稀釋成40倍的母液，經0. 22 μ m膜過濾除菌。9. 2滅活操作將預稀釋的β-丙內酯母液加入濃縮液中至終濃度為1/4000，2 8°C下放置滅活，24小時后在37°C下水解2小時。10、分子篩層析10. 1緩沖液選擇pH7. 5 8. 5的磷酸緩沖液。10. 2填料選擇GE公司的kphacryl S-300層析填料，裝柱高度為20 60cm。10. 3層析操作首先使用2倍柱體積的緩沖液平衡層析柱，流速為20 50cm/小時，上樣樣品體積為8% 12%的柱體積，收獲第一峰(波長^Onm，紫外檢測器)。11、離子交換膜層析11. 1緩沖液的選擇緩沖液A :pH7. 5 8. 5磷酸緩沖液，緩沖液B :pH7. 5 8. O磷酸緩沖液加 500mmol/L 氯化鈉。11. 2離子交換膜的選擇Sartorius公司的Sartobind Q離子交換層析膜11. 3層析操作先用10倍體積的緩沖液A平衡層析膜，上樣經分子篩層析純化后的抗原樣品，用緩沖液A(體積比為100^-0%)和緩沖液B(體積比0% 100% )形成線性梯度洗脫， 收集NaCl濃度為70mM至250mM之間的洗脫液為純化后原液；12、鋁佐劑原位吸附抗原方法12. 1試劑準備lmol/L 的 NaOH 溶液，lmol/L ρΗ8· 5 的磷酸鹽緩沖溶液，0. 2mol/L 的 AlCl3 溶液， lmol/L的NaCl溶液，過濾除菌。12. 2吸附方法將純化后的抗原過濾除菌后，加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度為0. 05mol/L,然后攪拌加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液，反應過程中保持體系PH為7. 0左右，反應體系中的Al (OH)3量為2. 0 2. 5mg/ml時為止。12. 3 稀釋用lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋至抗原量為5 10 μ g/劑，補結抗原為 1 4 1 8，八1(0!1)3含量為0.5 0.7511^/1111，妝(1濃度為0.14 0.1611101/1。
12. 4加入添加劑1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。12. 5半成品檢測無菌試驗。實施例21、鋁佐劑原位吸附制劑的中和抗體效價1. 1小鼠一針免疫中和抗體的效價結果比較比較無佐劑制品和鋁佐劑原位吸附制品一針免疫小鼠后的中和抗體效價，免疫2 周、4周和6周后的血清中和抗體效價檢測結果表明鋁佐劑制品和無佐劑制品的免疫原性存在很大差異，無佐劑制品免疫后中和抗體的高峰水平出現在注射后2周，4周開始下降。 鋁佐劑原位吸附制品的中和抗體高峰水平出現在注射后6周，且鋁佐劑制品的平均中和抗體水大大高于無佐劑制品(見表3)。表3小鼠一針免疫中和抗體效價的比較
權利要求
1.一種乙型腦炎疫苗制劑的生產方法，該生產方法包括以下步驟向滅活和純化的乙型腦炎病毒培養液中加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度達到0. 05mol/L,然后在攪拌下加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液進行反應并保持體系的PH為7. 0，直至反應產物中的Al (OH)3濃度為2. 0 2. 5mg/ml。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述生產方法還包括以lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋反應產物。
3.根據權利要求2所述的生產方法，其特征在于，所述反應產物被稀釋至Al(OH) 3濃度為 0. 5 0. 75mg/ml, NaCl 濃度為 0. 14 0. 16mol/L。
4.根據權利要求3所述的生產方法，其特征在于，所述生產方法還包括向稀釋后的反應產物加入添加劑。
5.根據權利要求4所述的生產方法，其特征在于，所述添加劑包括(g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的生產方法，其特征在于，所述滅活和純化的乙型腦炎病毒培養液的蛋白濃度為30 80 μ g/ml。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的生產方法，其特征在于，所述乙型腦炎疫苗制劑的抗原量為5 IOyg/劑，補結抗原量為1 4 1 8。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的生產方法制備的乙型腦炎疫苗制劑。
全文摘要
本發明提供一種乙型腦炎疫苗制劑的生產方法，該生產方法包括以下步驟向滅活和純化的乙型腦炎病毒培養液中加入1mol/L pH8.5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度達到0.05mol/L，然后在攪拌下加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl3溶液進行反應并保持體系的pH為7.0，直至反應產物中的Al(OH)3濃度為2.0～2.5mg/ml。與無佐劑制品和表面吸附制品相比，該方法生產的乙型腦炎疫苗免疫持久性明顯延長，同時解決了陽轉率和發熱率之間的矛盾。
文檔編號A61P31/14GK102327607SQ201010264210
公開日2012年1月25日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者劉鈿蓮, 艾文, 馬書智 申請人:麗珠集團疫苗工程股份有限公司