專利名稱：曼氏裂頭蚴病小鼠動物模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物技術領域，尤其是涉及一種曼氏裂頭蚴病小鼠動物模型的建 立方法。
背景技術：
衛生部于200廣2004年在全國進行的人體重要寄生蟲病現狀調查發現，我國寄生 蟲病的流行趨勢出現了新的變化，食源性寄生蟲病及人獸共患寄生蟲病的感染率明顯上 升。曼氏裂頭蚴病正是這樣一種食源性人獸共患寄生蟲病，其發病率正在逐年升高，成為影 響我國食品安全和人民健康的主要因素之一。曼氏裂頭蚴(sparganum mansoni)為曼氏迭宮絳蟲mansoni、飽彌 蟲，可侵入人體引起曼氏裂頭蚴病。曼氏迭宮絳蟲的生活史中需要3個宿主，終宿主主要是 貓和犬，第一中間宿主是劍水蚤，第二中間宿主主要是蛙。人可以作為曼氏迭宮絳蟲的第二 中間宿主甚至終宿主。人感染曼氏裂頭蚴的途徑主要有用蛙肉或蛇貼敷皮膚傷口，裂頭蚴 從傷口侵入；生吞蝌蚪、生食或半生食蛙、蛇及其他轉續宿主的肉等；飲用生水時或游泳時 誤吞被感染的第一中間宿主劍水蚤。曼氏裂頭蚴侵入人體后，其生存期可長達12年，甚至 有最長存活30余年的報道。曼氏裂頭蚴寄生部位多變，侵入人體后可引起幼蟲移行癥，致病的嚴重程度因移 行和寄居部位不同而異，裂頭蚴侵入皮膚黏膜組織可形成皮下包塊，也可侵入腹腔內臟器、 穿過橫隔侵犯胸腔，最嚴重的危害是侵入眼部和中樞神經系統，可致殘疾甚至危及生命。由 于裂頭蚴病缺乏特異性臨床表現，誤診誤治較為普遍。曼氏裂頭蚴病的致病機理、裂頭蚴在 體內的移行路徑是否存在一定規律、宿主感染后的免疫特點以及免疫病理損害等均尚不十 分清楚。病原學檢查發現裂頭蚴是確診曼氏裂頭蚴病的主要依據，但由于人體的感染度通 常較低，有時僅感染1條裂頭蚴，尤其是蟲體寄生在中樞神經系統或其他深部臟器時，病原 學檢查難以查見蟲體，風險大且漏檢率高，故病原學診斷存在著很大的局限性。血清學檢測 方法是較理想且具有廣闊前景的診斷技術，可以彌補病原學診斷的不足，但是，如何長期獲 得大量生物學性質穩定的特異性診斷抗原，是制約血清學診斷技術研究的瓶頸。對于曼氏裂頭蚴病患者的治療，目前主要采用手術摘除蟲體或局部應用40%的酒 精和2%普魯卡因2 4mL局部封閉殺蟲，但對于深部臟器及腦部等不宜手術的曼氏裂頭蚴 病，目前尚無滿意的治療方法。吡喹酮及阿苯達唑等藥物已被應用于曼氏裂頭蚴病的治療， 但口服藥物治療的效果還存在疑問，療效尚不明確。對曼氏裂頭蚴病的致病機理、免疫特點、血清學診斷、臨床治療等方面的深入研 究，均需要穩定的裂頭蚴病動物模型和大量生物學性質穩定的標準化蟲種資源。目前使用 的曼氏裂頭蚴蟲種主要采集自第二中間宿主蛙或蝌蚪體內，由于受到季節性因素的限制， 不能隨時獲得曼氏裂頭蚴活蟲體，這使得曼氏裂頭蚴病的研究進度受到了嚴重阻礙。因此， 迫切需要建立一種穩定的曼氏裂頭蚴病動物模型，為曼氏裂頭蚴病的研究提供穩定的疾病模型和標準化的蟲種資源。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可廣泛應用于生物醫學技術領域的曼氏裂頭蚴病小 鼠動物模型的建立方法，用以規范曼氏裂頭蚴蟲種資源的保藏方法和活體保種操作技術， 保證保藏蟲種生物學性狀的穩定性，為科研、教學、檢疫及診斷抗原的生產提供標準化的蟲 種資源。為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案
本發明所述的曼氏裂頭蚴病小鼠動物模型的建立方法，包括下述步驟 第一步，模式動物選取選擇2月齡的健康SPF級昆明小鼠進行接種，雌雄不限，接種前 禁食1天；
第二步，曼氏裂頭蚴的采集將從自然感染曼氏裂頭蚴的動物體內取出的曼氏裂頭蚴 用滅菌生理鹽水清洗后浸泡其中；
第三步，曼氏裂頭蚴的接種將浸泡在無菌生理鹽水中的曼氏裂頭蚴或剪取的帶有頸 節的頭節吸入灌胃器的吸頭內，一手固定小鼠，另一手持灌胃器從小鼠的一側口角插入口 中，沿咽后壁慢慢將吸頭插入食管，將吸頭內的裂頭蚴和生理鹽水一起注入小鼠食管；
第四步，感染動物的標準化飼養小鼠被接種后，置于小鼠飼養籠具中，并將其放置在 動物房中按照實驗動物管理條例進行標準化飼養； 第五步，曼氏裂頭蚴的轉種
1)選擇2月齡健康SPF級昆明小鼠，雌雄不限，轉種前禁食1天；
2)將第四步中飼養一定時期的曼氏裂頭蚴保種小鼠按照實驗動物管理條例剖殺，分離 出曼氏裂頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗后并浸泡在其中；
3)按照上述第三步的接種方法，采用灌胃法進行轉種；
4)小鼠被轉種曼氏裂頭蚴后，置于小鼠飼養籠具中，放置在動物房中按照實驗動物管 理條例進行標準化飼養；
第六步，曼氏裂頭蚴的再次轉種
視保種實驗動物數量多少或健康狀況，根據研究需要將飼養一定時期后的曼氏裂頭蚴 感染小鼠在3 12個月進行一次新的復壯轉種保藏；再次轉種步驟如前所述，如此反復，即 可建立穩定的曼氏裂頭蚴小鼠動物模型，保證曼氏裂頭蚴蟲種的延續。本發明的優點在于規范了曼氏裂頭蚴蟲種資源的保藏方法和活體保種操作技術， 為曼氏裂頭蚴病的免疫特點、免疫病理損傷、診斷和治療等研究提供了穩定的疾病動物模 型，為科研、教學、檢疫及診斷抗原生產單位提供了生物學性狀穩定的標準化蟲種資源，尤 其是使曼氏裂頭蚴病的特異性診斷抗原一排泄分泌(excretory-secretory，ES)抗原的 長期大批量制備成為現實，而ES抗原作為曼氏裂頭蚴病診斷抗原時可顯著提高診斷的特 異性，避免了以往使用曼氏裂頭蚴粗抗原進行診斷時交叉反應率高的現象；采用灌胃法將 曼氏裂頭蚴接種及轉種到鼠體內，操作方法簡便，且以小鼠作為模式動物有利于實驗動物 的標準化飼養管理，易于掌握和推廣使用；本發明所用實驗動物為SPF級昆明小鼠，該小鼠 為曼氏迭宮絳蟲的轉續宿主，對曼氏裂頭蚴的感染較為敏感，且飼養簡單，易于標準化。
具體實施例方式
本發明所述的曼氏裂頭蚴病小鼠動物模型的建立方法，它包括下述步驟
第一步，模式動物選取選擇2月齡的健康SPF級昆明小鼠進行接種，雌雄不限，接種前 禁食1天；
第二步，曼氏裂頭蚴的采集從自然界捕捉野生青蛙或蝌蚪(主要是澤蛙或黑斑蛙等)， 將從自然感染曼氏裂頭蚴的青蛙或蝌蚪體內取出的曼氏裂頭蚴用滅菌生理鹽水清洗3次 后浸泡在滅菌的生理鹽水中；
第三步，曼氏裂頭蚴的接種將浸泡在無菌生理鹽水中的曼氏裂頭蚴完整蟲體或剪取 的帶有頸節的頭節(剩余蟲體可用于制作抗原等)吸入灌胃器的吸頭內，一手固定小鼠，另 一手持灌胃器從小鼠的一側口角插入口中，沿咽后壁慢慢將吸頭插入食管，將吸頭內的裂 頭蚴和生理鹽水一起注入小鼠食管；在注入曼氏裂頭蚴后先將被灌胃小鼠置于一未使用的 空白籠具中，仔細觀察3min以上，確定小鼠沒有將曼氏裂頭蚴吐出則可認為接種成功；
第四步，感染動物的標準化飼養小鼠被接種后，置于小鼠飼養籠具中，籠具外貼置詳 細標簽指示牌，標簽指示牌標注內容須包括接種的蟲種名稱、蟲種來源、接種日期、小鼠種 系及級別、小鼠性別及出生日期、小鼠實驗分組及編號、管理人員姓名等重要信息，之后將 其置于動物房中按照實驗動物管理條例進行飼養。灌胃后1周內每天觀察保種動物狀況， 如沒有出現保種動物死亡，說明曼氏裂頭蚴保種成功；
第五步，曼氏裂頭蚴的轉種
1)選擇2月齡健康SPF級昆明小鼠，雌雄不限，轉種前禁食1天；
2)將第四步中飼養1個月以上(一般不超過1年)的曼氏裂頭蚴保種小鼠按照實驗動 物管理條例剖殺，分離出曼氏裂頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗后并浸泡在其中；
3)按照上述第三步的接種方法，采用灌胃法進行轉種，轉種時可以使用完整蟲體，最好 使用帶頸節的頭節；因為有時候完整蟲體較大，沒有只用帶頸節的頭節轉種起來方便，同時 為了獲得蟲體抗原，有時候在轉種之前就把除帶頸節的頭節之外的蟲體已剪下來了 ；
4)小鼠被轉種曼氏裂頭蚴后，置于小鼠飼養籠具中，籠具外貼置標簽指示牌，標簽指示 牌標注內容須包括轉種的蟲種名稱、轉種日期、轉種次數、小鼠種系及級別、小鼠性別及出 生日期、小鼠實驗分組及編號、管理人員姓名等重要信息，之后將其放置在動物房中按照實 驗動物管理條例進行標準化飼養；
第六步，曼氏裂頭蚴的再次轉種
曼氏裂頭蚴在感染小鼠動物模型體內每月可增長;T5cm左右，一般視保種實驗動物數 量多少或健康狀況，根據研究需要將飼養一定時期后的曼氏裂頭蚴感染小鼠在;Γ12個月 進行一次新的復壯轉種保藏；再次轉種步驟如前所述，如此反復，即可建立穩定的曼氏裂頭 蚴小鼠動物模型，保證曼氏裂頭蚴蟲種的延續，同時可獲得大量曼氏裂頭蚴活蟲體，并可長 期為曼氏裂頭蚴病研究提供穩定的疾病模型。
權利要求
一種曼氏裂頭蚴病小鼠動物模型的建立方法，其特征在于它包括下述步驟第一步，模式動物選取選擇2月齡的健康SPF級昆明小鼠進行接種，雌雄不限，接種前禁食1天；第二步，曼氏裂頭蚴的采集將從自然感染曼氏裂頭蚴的動物體內取出的曼氏裂頭蚴用滅菌生理鹽水清洗后浸泡其中；第三步，曼氏裂頭蚴的接種將浸泡在無菌生理鹽水中的曼氏裂頭蚴或剪取的帶有頸節的頭節吸入灌胃器的吸頭內，一手固定小鼠，另一手持灌胃器從小鼠的一側口角插入口中，沿咽后壁慢慢將吸頭插入食管，將吸頭內的裂頭蚴和生理鹽水一起注入小鼠食管；第四步，感染動物的標準化飼養小鼠被接種后，置于小鼠飼養籠具中，并將其放置在動物房中按照實驗動物管理條例進行標準化飼養；第五步，曼氏裂頭蚴的轉種1)選擇2月齡健康SPF級昆明小鼠，雌雄不限，轉種前禁食1天；2)將第四步中飼養一定時期的曼氏裂頭蚴保種小鼠按照實驗動物管理條例剖殺，分離出曼氏裂頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗后并浸泡在其中；3)按照上述第三步的接種方法，采用灌胃法進行轉種；4)小鼠被轉種曼氏裂頭蚴后，置于小鼠飼養籠具中，放置在動物房中按照實驗動物管理條例進行標準化飼養；第六步，曼氏裂頭蚴的再次轉種視保種實驗動物數量多少或健康狀況，根據研究需要將飼養一定時期后的曼氏裂頭蚴感染小鼠在3~12個月進行一次新的復壯轉種保藏；再次轉種步驟如前所述，如此反復，即可建立穩定的曼氏裂頭蚴小鼠動物模型，保證曼氏裂頭蚴蟲種的延續。
全文摘要
本發明公開了一種曼氏裂頭蚴病小鼠動物模型的建立方法，包括將從自然感染曼氏裂頭蚴的動物體內取出的蟲體用滅菌生理鹽水清洗浸泡；采用灌胃法將蟲體注入健康小鼠食管進行接種；將接種小鼠飼養一定時期后再采用灌胃法將其進行轉種，并對轉種小鼠進行標準化飼養，然后根據需要，將飼養一定時期后的感染小鼠在3~12個月進行一次新的復壯轉種保藏；如此即可建立穩定的曼氏裂頭蚴小鼠動物模型。本發明規范了曼氏裂頭蚴蟲種資源的保藏方法和活體保種操作技術，為曼氏裂頭蚴病的免疫特點、免疫病理損傷、診斷和治療等研究提供了穩定的疾病動物模型，為科研、教學、檢疫及診斷抗原生產單位提供了生物學性狀穩定的標準化蟲種資源。
文檔編號A61K49/00GK101926307SQ201010283149
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月16日 優先權日2010年9月16日
發明者姜鵬, 崔晶, 李楠, 王中全, 王書偉, 王燁 申請人:鄭州大學