一種新型乙型肝炎動物模型的建立方法與用途
【專利摘要】本發明涉及轉染HBV基因的HepG2.2.15細胞分泌的病毒液誘發的乙型肝炎動物模型的制備方法，特別是一種易于獲得和調控的誘導劑及簡單的操作程序，產生與人類疾病更具有相似性的乙型肝炎疾病模型及其在乙肝發病機制研究和抗肝炎藥物評價中的應用。
【專利說明】一種新型乙型肝炎動物模型的建立方法與用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物疾病模型的制備方法，特別是一種簡單的誘導劑及簡單的操作程序，產生與人類疾病更具有相似性的乙型肝炎疾病模型及其在乙肝發病機制研究和抗肝炎藥物評價中的應用。
【背景技術】
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)感染是嚴重的公共健康問題。我國是HBV感染高發流行區，約有7億人曾經感染HBV，其中慢性感染人數高達1.2億，占全球HBV感染總數的1/3左右。15%~35%的慢性乙肝患者因肝硬化、肝癌等終末期肝病而死亡。全球53%的肝癌與HBV感染密切相關。盡管HBV感染是肝癌發生的最主要病因，但HBV慢性感染機制至今仍未完全闡明。缺乏合適的HBV感染疾病模型是阻礙HBV基礎研究進展的主要瓶頸，其根本原因在于HBV感染宿主的種屬范圍極窄，除人類之外，只有黑猩猩感染HBV模型得到公認，但因其為瀕危珍稀動物而不適用于實驗研究而受到限制。因此，建立方便有效的、與人類有較近親緣關系的動物感染人HBV模型，是闡明HBV生物學特性、感染致病機理及建立有效防治措施所亟需。[0003]HBV是一種較為嚴格的嗜肝DNA病毒，其感染有高度的種屬和組織特異性，由于病毒黏附以及DNA轉錄和復制對宿主有嚴格的要求，HBV只感染人類和類人猿。嗜肝DNA病毒科分為哺乳類和禽類兩個屬，前者包括人、毛猴、土撥鼠和地松鼠的嗜肝DNA病毒HBV、WMHBV.WHV和GSHV ;后者包括鴨和蒼鷺的嗜肝DNA病毒DHBV和HHBV。HBV是嗜肝DNA病毒的原型，在基因組結構的相似性和基因序列的同源性等方面與本家族其他成員有程度不同的差別。多年來，鴨感染DHBV模型和土撥鼠感染WHV模型在探索HBV感染人體的機制和研發臨床用藥等方面做出了重要貢獻，但將這兩個動物模型的相關研究結果用于闡釋人類感染HBV的相關事件，均尚存很明顯的屏障。
[0004]樹斷I (Tupaia belangeri)作為小型低等靈長類動物,與人類在生理機能、生化代謝和基因組等方面的相似性遠高于小鼠、大鼠、土撥鼠等常用實驗動物。世界衛生組織多年前就呼吁用樹駒代替大型靈長類動物進行科學實驗，我國近年來也已開始樹駒資源的開發利用和標準化研究。國內外研究表明含HBV的乙肝患者血清確實可以感染樹駒，但由于乙肝患者血清采集不方便且危險性高、難以標化，不利于模型的推廣應用。而轉染HBV的H印G2.2.15細胞是目前抗乙肝藥物藥效評價最常用的細胞模型，它不僅能支持HBV DNA復制，而且還能支持Dane樣顆粒的包裝和分泌，將該細胞培養上清靜脈注射黑猩猩可致典型肝炎。因此，采用IfepG2.2.15細胞培養上清(含病毒顆粒)感染樹駒，建立乙肝模型，具有感染源易于獲得、建模方便、易于標化，且適于普通實驗研究等優點，對乙肝感染機制的深入研究和抗乙肝藥物的評價具有重要意義。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種新型的乙型肝炎動物模型，該模型建模方便，感染源易于獲得，成模率高，易于標化和調控，為乙肝感染機制的研究和抗乙肝藥物評價提供一種與人類疾病更具相似性的、穩定可靠的疾病模型。為此，本發明采取以下技術方案:
[0006]由于HBV感染宿主的種屬范圍極窄，除人類之外，只有黑猩猩感染HBV模型得到公認，但因其為瀕危珍稀動物而不適用于實驗研究而受到限制。目前研究常用的鴨感染DHBV模型和土撥鼠感染WHV模型的相關研究結果用于闡釋人類感染HBV的相關事件，均尚存很明顯的屏障。而本發明采用轉染HBV的H印G2.2.15細胞培養上清(含病毒顆粒)感染樹鼠句建立的乙型肝炎模型，由于感染源易于獲得和調控，能更方便地模擬人類乙型肝炎。
[0007]一種用轉染HBV的H印G2.2.15細胞分泌病毒液誘發，無需特殊裝置，簡單易行，成模率高的乙型肝炎動物模型的建立方法。具體制備方法如下:
[0008]以定量病毒載量的H印G2.2.15細胞培養上清液為感染源，經靜脈注射感染3月齡樹駒，每周注射I次，每只0.5毫升，共接種3次，即可誘發乙型肝炎。[0009]本發明與現有技術相比具有如下優點:(I)采用轉染HBV的H印G2.2.15細胞分泌病毒液作為感染源，由于ifepG2.2.15細胞分泌病毒載量易于調控，能更方便地模擬乙型肝炎；(2)無需特殊裝置，簡單易行，成模率高，易于標化和調控；(3)與人類乙型肝炎具有良好的相關性；(4)適于肝炎發病機制研究和抗肝炎藥物評價研究。
【具體實施方式】
[0010]實施例1:新型乙型肝炎模型的制備及評價
[0011]I準備以下材料:
[0012]1.1實驗動物:樹駒由中國科學院昆明動物研究所提供。
[0013]1.2HepG2.2.15細胞:由HBV基因轉染H印G2肝癌細胞而來。
[0014]2制備方法按如下步驟:
[0015]2.1轉染HBV的H印G2.2.15細胞，采用含10%胎牛血清、青霉素100IU/m及鏈霉素100 μ g/mL的DMEM培養基，在37°C、5% C02條件下常規培養，并用G418進行克隆篩選。吸取細胞培養上清液，離心分離和純化HBV顆粒，采用熒光定量PCR方法測定HBV載量，制備接種病毒液。
[0016]2.2取3月齡樹駒，以定量病毒載量的病毒液為感染源，經靜脈注射途徑感染，每周注射I次，每只0.5毫升，共接種3次，即可形成乙肝模型。
[0017]3評價方法按如下步驟:
[0018]3.1接種后定期采血作HBV感染標志物檢測，用生化分析儀檢測血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶水平；采用ELISA法檢測血清HBV表面抗體和HBV核心抗體表達水平；采用熒光定量PCR方法檢測血清HBV DNA載量。
[0019]3.2取肝組織，采用免疫組化方法檢測HBV表面抗原(HBsAg)和HBV核心抗原(HBcAg)水平；采用原位分子雜交法檢測HBV DNA水平。
[0020]3.3電鏡下觀察樹駒血清中是否存在Dane氏顆粒及HBsAg顆粒。
【權利要求】
1.一種新型乙型肝炎動物模型的建立方法，包括模型的制作程序及模型評價標準，其特征在于采用一種簡單的誘導劑及簡單的操作程序，復制出穩定、可靠的乙型肝炎模型及其在乙肝感染機制研究和抗肝炎藥物評價中的應用。
2.根據權利要求1所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的實驗動物為樹鼠句。
3.根據權利要求1所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的誘導劑為乙肝病毒基因轉染的ifepG2.2.15細胞分泌的病毒顆粒。
4.根據權利要求1或2所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的感染途徑為靜脈注射。
5.根據權利要求1和3所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的誘導劑乙肝病毒基因轉染的H印G2.2.15細胞不僅能支持乙肝病毒DNA復制且支持乙肝病毒顆粒的包裝和分泌。
6.根據權利要求1所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的模型評價標準為小鼠轉氨酶水平升高，乙肝病毒表面抗體和乙肝病毒DNA檢測呈陽性，以及電鏡檢查出現Dane氏顆粒。
7.一種新型乙型肝炎模型的建立方法如權利要求1所述一種簡單的誘導劑及簡單的操作程序，復制出穩定可靠的乙型肝炎模型，其特征在于所述的模型制備方法為每周注射誘導劑I次，0.5毫升/只，共注射3次。
8.根據權利要求1所述的乙型肝炎模型的建立在乙肝感染機制研究和抗肝炎藥物評價中的應用，其特征在于所誘 發的肝炎與人類乙型肝炎在病程特點和肝臟病理改變等方面具有良好的相關性。
【文檔編號】A61K49/00GK103920166SQ201310014446
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月10日 優先權日:2013年1月10日
【發明者】伍義行, 張虹莉, 賈袁媛, 戴靈豪, 沈鈺明 申請人:中國計量學院