專利名稱：肝細胞核因子1α治療人體惡性實體瘤的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、細胞生物學以及醫學領域。具體地，本發明涉及利用肝細胞核因子1 α Ofepatocyte Nuclear Factor-I α，HNFl α )誘導人體惡性實體瘤細胞發生分化，從而應用于實體腫瘤治療的方法和用途。
背景技術：
惡性實體瘤的治療是目前臨床的難點之一，尤其對于手術無法切除的惡性實體瘤，臨床尚缺乏有效的治療手段。選擇與腫瘤細胞發生發展密切相關的關鍵蛋白、分子和基因進行特異性靶向調控是惡性實體瘤治療的核心問題之一。腫瘤誘導分化治療(differentiation therapy)是近20年來腫瘤臨床治療方面的重要突破。誘導分化治療是通過誘導分化方法促進腫瘤細胞向成熟階段分化，恢復正常的細胞表型和功能并抑制惡性腫瘤細胞的增殖。誘導分化治療打破了腫瘤發展不可逆的傳統認識，有力的推動了整個癌癥研究領域的發展。我國學者曾率先運用全反式維甲酸誘導分化治療急性早幼粒細胞性白血病，取得了較好的療效。然而，盡管白血病的分化治療取得了很大進展，但惡性實體瘤的分化治療仍然是腫瘤治療研究領域的難題。迄今為止，對于諸如肝癌、胃癌、腸癌、腎癌以及胰腺癌等人體惡性實體腫瘤的誘導分化治療仍未見明確報道。迄今實驗表明，全反式維甲酸對惡性實體瘤的分化無明顯作用。選擇合適的藥物或相關物質進行特異性靶向調控是腫瘤誘導分化治療的難點。有研究利用藥物或蛋白體外調控實體腫瘤的分化狀態，但效果有限。體內實驗大多提示上述方法在誘導腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤組織壞死方面有一定的作用，但是很難實現顯著調控或逆轉實體瘤低分化程度。在眾多候選物質中篩選出有效的誘導腫瘤分化的試劑是非常困難的，也是收效甚微的。因此，選擇出與腫瘤細胞誘導分化密切相關的關鍵蛋白、分子和基因進行特異性靶向調控是腫瘤誘導分化治療的核心問題之一。近年來，隨著人類基因組計劃研究的不斷深入，為人們利用基因技術手段調控甚至改變細胞重要基因的表達以改變其表型、分化狀態和生物學功能創造了條件。然而，雖然已經證實有一些物質或基因在體外實驗中可改善腫瘤細胞的某些生物性特性(如增殖及克隆形成能力降低、部分正常細胞功能基因表達上調)，一些物質甚至證實了可降低癌細胞在動物體內的成瘤作用，但是往往發現這些物質對正常細胞也有影響(副作用)，并不能特異性地在體內誘導實體腫瘤發生分化。本發明人曾研究了全反式維甲酸、生長抑素、腫瘤壞死因子以及三氧化二砷等物質體外對肝癌細胞株分化的調控作用，均未篩選出有明確分化治療作用的藥物或蛋白，同時體內研究也發現這些物質不能有效地誘導實體腫瘤發生分化。因此，本領域迫切需要開發與惡性實體瘤細胞誘導分化密切相關的特定蛋白或基因，能夠作為特異性調控的靶標，從而有效地誘導分化實體瘤。
發明內容
本發明的目的在于提供一種與惡性實體瘤細胞誘導分化密切相關的特定的基因-HNFl α基因及其編碼產物HNFl α蛋白，以及HNFl α基因/蛋白在誘導分化實體瘤中的用途。本發明的另一個目的在于提供一種通過HNFl α基因/蛋白分化誘導惡性實體瘤從而治療腫瘤的方法。在本發明的第一方面，提供了一種肝細胞核因子1 α (Hepatocyte NuclearFactor-I α，HNFl α )基因和/或蛋白的用途，它們被用于制備誘導惡性實體瘤細胞分化的誘導分化試劑或組合物。本發明還提供肝細胞核因子1 α (Hepatocyte Nuclear Factor-I α，HNFl α )基因和/或蛋白的用途，它們被用于制備使惡性實體瘤的腫瘤細胞阻滯于G2/M期的組合物。在另一優選例中，所述的組合物是藥物組合物。在另一優選例中，所述的藥物組合物含有(a)HNFl α蛋白、HNFl α編碼序列或含所述編碼序列的表達載體以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。在另一優選例中，所述的表達載體包括病毒載體和非病毒載體。較佳地，所述的非病毒載體為脂質體。在另一優選例中，所述的實體瘤選自肝癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺腫瘤。在另一優選例中，所述的藥物組合物還用于體內抑制實體瘤的形成。在另一優選例中，所述的肝細胞核因子1 α是人的肝細胞核因子1 α。在另一優選例中，所述的藥物組合物的劑型為注射劑。在另一優選例中，所述的藥物組合物還含有化療劑。在本發明的第二方面，提供了一種誘導或促進哺乳動物中實體瘤分化的方法，它包括步驟給需要治療的哺乳動物對象施用肝細胞核因子Ia蛋白、其編碼序列或含所述編碼序列的表達載體。在另一優選例中，所述的哺乳動物是人。
圖1. Real-time RT-PCR檢測人肝腫瘤細胞株HNFl α基因表達。圖2. Real-time RT-PCR檢測人肝癌及癌旁組織HNFl α基因表達。圖3.免疫組化檢測人肝癌及癌旁組織HNFl α蛋白表達(I 癌旁組織HNFl α表達高于肝癌組織；II 肝癌及癌旁組織HNFl α表達相當；III癌旁組織HNFl α表達低于肝癌組織)。圖4.免疫組化檢測大鼠DEN誘導肝癌模型過程中HNFl α基因表達逐步下調。圖 5. RT-PCR 獲得 HNFlacDNA 片段。圖6.體外連接獲得穿梭質粒pAdTrack-CMV-HNFlaBglII、kpnI酶切鑒定。圖7. Pac I酶切鑒定重組腺病毒質粒pAdHNFl α。圖8.酶切鑒定重組腺病毒質粒pAdHNFl α。
圖 9. AdHNFl α 分別感染 H印(A、B)、Huh7 (C、D)、MHCC_H(E、F)；及 MHCC-L (G、H) 細胞3d后GFP表達。圖10. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞3d后western blot檢測HNFl α蛋白表達。圖11. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞3d后HNFl α蛋白表達定量分析。圖12. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞3d后免疫熒光檢測HNFl α蛋白表達定位。圖13. AdHNFl α感染人肝腫瘤細胞株后HNFl α基因和肝細胞相關功能基因mRNA 表達定量分析圖14. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞株3d后細胞凋亡變化。圖15. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞株3d后細胞周期變化。圖 16. Real-time RT-PCR 及 western blot 檢測 AdHNFl α 感染肝腫瘤細胞株 3d 對細胞周期相關蛋白的影響。圖17.外源導入HNFl α對不同人肝腫瘤細胞株細胞增殖能力的影響。圖18.外源導入HNFl α對不同人肝腫瘤細胞株細胞克隆形成的影響。圖19. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞IfepIBB后體內接種成瘤實驗。圖20. AdHNFl α感染肝腫瘤細胞Huh7后體內接種成瘤實驗。圖21. AdHNFl α瘤內注射基因治療皮下成瘤模型。圖22. HNFl α基因治療肝腫瘤細胞肝臟原位注射致實驗性肝腫瘤模型。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次發現了 HNFl α基因/蛋白可有效地在體內誘導或促進惡性實體瘤向正常細胞分化。實驗表明，HNFl α不僅對腫瘤細胞凋亡有影響，更可對實體瘤細胞的分化產生誘導或促進作用(細胞形態變化、肝細胞相關功能基因表達明顯上調及體內對腫瘤的預防、干預和治療作用)。因此HNFl α作為首次被證實的可有效地在體內誘導或促進惡性實體瘤向正常細胞分化的關鍵基因/蛋白，具有潛在的應用前景。 本發明人在此基礎上完成了本發明。如本文所用，術語“基因/蛋白”指基因和/或蛋白。如本文所用，術語“HNFIa蛋白”、“HNFl α多肽”、“本發明多肽”、“本發明蛋白”可互換使用，都指肝細胞核因子la (Hepatocyte NuclearFactor-I α )蛋白。它們可包括含有或不含起始甲硫氨酸(Met)的HNFl α。狹義上，所述術語指人的HNFl α ；廣義上，所述術語不僅包括人的HNFl α，還包括其他哺乳動物的HNFl α，尤其是靈長類動物的HNFl α，如猿或猴的HNFl α。該術語還包括HNFl α蛋白的活性片段、活性衍生物和類似物。本發明多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如， 細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然 HNFla蛋白(如人HNFl α)相同的生物學功能或活性的多肽。這些多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。例如，在本發明中，術語“人HNFla多肽”指具有野生型HNFl α序列的多肽。該術語還包括具有與人HNFl α蛋白相同的誘導實體瘤分化功能的、野生型序列的變異形式。 這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地 1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。同樣，該術語還包括人HNFl α蛋白的活性片段和活性衍生物。本發明還包括人HNFl α蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HNFl α多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，“人HNFl α蛋白保守性變異多肽”指與野生型氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。表 權利要求
1.一種肝細胞核因子 1 α Ofepatocyte Nuclear Factor-I α，HNFl α )基因和 / 或蛋白的用途，其特征在于，用于制備誘導惡性實體瘤細胞分化的誘導分化試劑或組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物含有(a)HNFla蛋白、 HNFla編碼序列或含所述編碼序列的表達載體以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的表達載體包括病毒載體和非病毒載體。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的實體瘤選自肝癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺腫瘤。
6.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還用于體內抑制實體瘤的形成。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝細胞核因子Ia是人的肝細胞核因子1 a。
8.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物的劑型為注射劑。
9.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還含有化療劑。
10.一種誘導或促進哺乳動物中實體瘤分化的方法，其特征在于，它包括步驟給需要治療的哺乳動物對象施用肝細胞核因子Ia蛋白、其編碼序列或含所述編碼序列的表達載體。
全文摘要
本發明涉及肝細胞核因子1α治療人體惡性實體瘤。具體地，本發明涉及利用肝細胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α，HNF1α)誘導人體惡性實體瘤細胞發生分化，從而應用于惡性實體腫瘤治療的方法和用途。本發明的研究表明，通過調控惡性實體腫瘤細胞HNF1α基因表達，可有效地對腫瘤細胞的產生誘導分化作用，從而提供了一種腫瘤誘導分化治療的新手段。
文檔編號A61K48/00GK102475893SQ20101055904
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月25日 優先權日2010年11月25日
發明者尹川, 曾欣, 林勇, 謝渭芬, 陳岳祥 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學