專利名稱：用于控制蜂中的瓦螨的組合物的制作方法
用于控制蜂中的瓦螨的組合物發明領域和背景
本發明涉及用于控制蜂中的瓦螨{Varroa mite)侵染的組合物。蜜蜂，即意大利蜜蜂(Apis mellifera)為農作物的有效授粉所必需，因此對世界農業而言為關鍵性的。蜜蜂亦產生經濟上重要的產物，包括蜂蜜和蜂蠟。蜜蜂易感染許多寄生蟲和病原體，包括外寄生螨、狄斯瓦螨(Varroa destructor)。蜜蜂的蜂群崩潰失調病(Colony Collapse Disorder, CO))對摧毀美國和世界農業造成威脅。實際上，2006-2007年冬天在美國最近爆發的CXD中，估計240萬蜜蜂蜂巢的25%或更多因為CXD而消失。估計23%的美國養蜂運作在2006-2007年冬天受CXD所累，影響了平均45%的養蜂人運作。在2007-2008年冬天，USDA-ARS的CXD行動小組估計，總計來自商業運作的全部蜂巢的36%被CXD破壞。
CXD通過自一群其成年蜂群體的迅速消失來表征，通常在距蜂群一定距離處發現死亡的成年蜂。在崩潰末期，蜂王僅由少量新形成的成年蜂照料。崩潰的蜂群常常具有大量封蓋的幼蜂和食物儲備。CCD現象首先在2006年報道；然而，養蜂人早在2004年就注意到與CCD—致的獨特的蜂群衰退。已假定多種因素作為原因，所述因素為例如螨和傳染劑、天氣模式、電磁(蜂窩天線)輻射、殺蟲劑、營養不良和應激。迄今為止，CCD的控制已集中在瓦螨控制、環境衛生和移除受影響的蜂巢，針對機會性感染(例如小孢子蟲(Nosema)')進行處理和改善營養。至今仍未開發有效的預防措施。瓦螨寄生于蛹和成年蜂中并且在蛹的撫幼室中繁殖。螨使用它們的嘴刺穿外骨骼并且以蜂的血淋巴為食。這些外骨骼中的傷口部位隱匿細菌感染，例如蜂房球菌(Melissococcus pluton),其導致歐洲幼蟲腐臭病(European foulbrood)。此外，因為它們的寄生作用，懷疑瓦螨充當許多蜜蜂病原體的載體，所述病原體包括羽翼畸形病毒(DWV)、克什米爾蜜蜂病毒(KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王臺病毒(BQCV)，并且瓦螨可減弱其宿主的免疫系統，使得它們易受感染的攻擊。如果不加以治療，瓦螨侵染典型地導致群體水平的死亡率。治療瓦螨侵染的現行方法被證明無效，因為螨形成對現有殺螨劑的抗性。此外，使用這類殺螨劑可能將有害的化學品引入旨在用于人消費的蜂蜜中。美國專利申請20090118214教導了 dsRNA用于預防和治療蜜蜂中的病毒感染中的用途。發明概沭
本發明某些實施方案的一個方面提供了一種分離的核酸劑，所述核酸劑包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列。本發明某些實施方案的一個方面提供了一種核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼本發明的分離的核酸劑的核酸序列。本發明某些實施方案的一個方面提供了一種蜂可攝取的組合物，所述組合物包含至少一種核酸劑，所述核酸劑包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列。本發明某些實施方案的一個方面提供了預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法，所述方法包括給蜂施用有效量的至少一種包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列的核酸劑，從而預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染。本發明某些實施方案的一個方面提供了預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法，所述方法包括給蜂施用有效量的本發明的核酸構建體，從而預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染。本發明某些實施方案的一個方面提供了降低蜜蜂對蜂群崩潰失調病(CCD)的易感性的方法，所述方法包括給蜜蜂施用有效量的至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)，所述至少一種dsRNA包含與狄斯瓦螨mRNA的至少21個核苷酸互補且能夠誘導狄斯瓦螨特異性mRNA降解的序列。根據本發明的某些實施方案，所述核酸序列與狄斯瓦螨特異性RNA的至少21個核苷酸互補且能夠誘導狄斯瓦螨RNA降解。
根據本發明的某些實施方案，所述核酸劑選自dsRNA、反義RNA和核酶。根據本發明的某些實施方案，dsRNA選自siRNA、shRNA和miRNA。根據本發明的某些實施方案，所述基因產物為編碼選自以下的多肽的mRNA :ATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α -微管蛋白。根據本發明的某些實施方案，所述至少一種核酸劑包含至少五種核酸劑，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少五種核酸劑的每一種都靶定不同的基因。根據本發明的某些實施方案，所述至少一種核酸劑包含至少六種核酸劑，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α -微管蛋白，所述至少六種核酸劑的每一種都用于靶定不同的基因。根據本發明的某些實施方案，所述核酸劑如SEQ ID No: I、13、27、30和39所述。根據本發明的某些實施方案，所述核酸劑如SEQ ID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36 和 39 所述。根據本發明的某些實施方案，所述核酸序列長度大于15個堿基對。根據本發明的某些實施方案，所述核酸序列長度為19-25個堿基對。根據本發明的某些實施方案，所述核酸序列長度大于30個堿基對。根據本發明的某些實施方案，所述組合物呈固體形式。根據本發明的某些實施方案，所述組合物呈液體形式。根據本發明的某些實施方案，所述組合物包含蛋白質。根據本發明的某些實施方案，所述蛋白質呈花粉和/或大豆餅的形式。根據本發明的某些實施方案，所述液體為蔗糖溶液。根據本發明的某些實施方案，所述液體為玉米糖漿溶液。 根據本發明的某些實施方案，所述液體進一步包含碳水化合物或糖補充劑。根據本發明的某些實施方案，所述蜂為蜜蜂。根據本發明的某些實施方案，所述蜜蜂為采集蜂。根據本發明的某些實施方案，所述蜜蜂為蜂巢蜂(hive bee)。根據本發明的某些實施方案，所述蜜蜂為蜂群的蜂，且其中所述施用降低蜂群體對蜂群崩潰失調病的易感性。根據本發明的某些實施方案，所述施用通過飼喂來實現。根據本發明的某些實施方案，所述飼喂包括提供液體的蜂可攝取的組合物。根據本發明的某些實施方案，所述飼喂包括提供固體的蜂可攝取的組合物。根據本發明的某些實施方案，狄斯瓦螨mRNA編碼選自以下的多肽NADH脫氫酶亞基2、ATP合成酶亞基8、ATP合成酶亞基6、鈉通道和細胞色素氧化酶亞基I。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和/或科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的意義。雖然與本文所述方法和材料類似或等同的方法和材料可用于實踐或測試本發明的實施方案，但示例性的方法和/或材料描述于下文。在沖突的情況下，以本專利說明書(包括定義)為準。此外，所述材料、方法和實施例僅為說 明性的而不意圖其為必要限制。附圖
簡沭
僅作為實例參考附圖在此描述本發明的某些實施方案。現在詳細地具體參考附圖，強調的是，所示細節是作為實例并且以闡述性地討論本發明的實施方案為目的。在這點上，帶有附圖的描述使得本發明的實施方案可如何實施對本領域技術人員顯而易見。在附圖中
圖I為用于dsRNA轉入瓦螨的各種實驗的時程的示意圖。圖2A-E為狹線印跡分析(Slot blot analysis)已攝取的蜂(圖2A)、通過成年蜂喂養的幼蟲(圖2B)、蛹(圖2C)和新形成蜂(圖2D)中dsRNA-GFP存在情況的結果的照片。dsRNA-GFP和來源于其的siRNA的存在情況通過RNA印跡來分析(圖2E)。D=給蜂巢施用dsRNA-GFP之后的天數。圖3為舉例說明在頂行所示的天數(時間如圖I所示)從瓦螨提取的RNA的RT-PCR分析結果的照片。綠色數字(頂行)表示已將其放置在已攝取dsRNA-GFP的蜂上的瓦螨個體，而黑色數字表示來自放置在對照蜂上的瓦螨的RNA。+ =陽性對照(攜帶GFP的質粒)。圖4為舉例說明使用針對調亡抑制劑蛋白(IAP ;序列27)的引物的瓦 兩RNA的RT-PCR的照片。M :大小標記。泳道1-3 :來自用序列27的dsRNA處理的蜂巢的瓦螨的模板RNA。泳道4 :來自對照蜂巢的瓦螨的模板RNA。泳道5 :陽性對照(攜帶IAP的質粒)。泳道6:陰性對照(無模板)。圖5為舉例說明在對照蜂巢中以及在用dsRNA混合物I (最小)和用dsRNA混合物II (最大)處理的蜂巢中每只蜂(成年蜂加上封蓋房內的幼蟲)的瓦螨計數的條形圖。發明實施方案描述
本發明在其某些實施方案中，涉及用于降低蜂對于瓦螨侵染的易感性的方法和組合物。在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，要理解的是，本發明不必限于其在以下描述中所述或通過實施例所例示的細節中的應用。本發明能夠有其它實施方案或者以多種方式實踐或實施。蜂易感大量的病毒感染。通過減量調節特定的病毒基因產物來治療這類感染已顯示在消除蜂中病毒誘導的感染方面成功(參見美國專利申請20090118214)。
本發明人現提出通過減量調節特定的瓦螨基因產物來治療蜂中瓦螨侵染。瓦螨寄生于蛹和成年蜂中并在蛹的撫幼室中繁殖。螨使用它們的嘴刺穿外骨骼并且以蜂的血淋巴為食。本發明人意外地發現，施用給蜂以治療瓦螨侵染的多核苷酸劑出現在蜂的血淋巴中，從而變為螨可獲取的。本發明人已顯示，可成功地將dsRNA轉移至瓦螨(圖2A-E)，所述dsRNA可用來減量調節瓦螨中特定基因的表達(圖4)和進一步地，針對減量調節靶定特定基因可引起瓦螨數量上的減少(圖5)。 因此，本發明的一個方面提供了預防或治療蜂的狄斯瓦螨侵染的方法，所述方法包括給蜂施用有效量的包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列的核酸劑，從而預防或治療蜂的狄斯瓦螨侵染。本文所用的術語“蜂”是指成年蜂及其蛹單元二者。根據一個實施方案，所述蜂在蜂巢中。成年蜂定義為膜翅目中蜜蜂總科的數種有翅、軀體多毛通常有刺的昆蟲中的任一種(包括獨居種和群居種二者)，以及通過用于收集花蜜和花粉的吸吮和咀嚼口器來表征。示例性蜂種包括但不限于蜜蜂屬(Apis)、熊蜂屬(Bombus)、無刺蜂屬(Trigona)、壁蜂屬(Osmia)等。在一個實施方案中，蜂包括但不限于大黃蜂(Bombus terrestris)、蜜蜂(意大利蜜蜂)(包括采集蜂和蜂巢蜂)和中華蜜蜂(Apis cerana)。根據一個實施方案，所述蜂為蜂群的一部分。術語“蜂群”是指這樣的一群蜂，其包含幾十到典型地數萬的蜂，所述蜂在筑巢、收集食物和養育幼蜂方面合作。蜂群一般地具有單個蜂王，剩余的蜂為“工蜂”(雌性)或“雄峰”(雄性)。蜂群的社群結構由蜂王和工蜂維持并且依賴于有效的溝通系統。工蜂階級內的勞動分工主要取決于蜂的年齡，但也隨蜂群的需求而改變。繁殖和蜂群蜂數取決于蜂王、食物儲備的量和工蜂隊伍的大小。還可將蜜蜂細分成“蜂巢蜂”類(通常用于工蜂生命的第一部分，這期間“蜂巢蜂”在蜂巢內執行任務)和“采集蜂”類(所述蜂生命的后半部分，這期間“采集蜂”從蜂巢外定位并收集花粉和花蜜，并將花蜜或花粉帶入蜂巢用于消耗和儲存)。根據本發明的此方面，將本發明的試劑用于防止狄斯瓦螨作為蜂或其幼蟲上的寄生蟲生存。短語“狄斯瓦螨”是指攻擊蜜蜂(中華蜜蜂和意大利蜜蜂)的外寄生螨。所述螨可處于成蟲期，以蜂為食；或處于幼蟲期，在蜜蜂撫幼室內。如所提及的，本發明的試劑能夠減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達。本文所用的短語“基因產物”是指RNA分子或蛋白質。根據一個實施方案，所述狄斯瓦螨基因產物為螨生存力所必需的產物。這類基因產物的減量調節將典型地導致瓦螨死亡。根據另一個實施方案，所述狄斯瓦螨基因產物為螨繁殖所必需的產物。這類基因產物的減量調節將典型地導致防止瓦螨的繁殖以及最終根除瓦螨群體。根據又另一個實施方案，所述狄斯瓦螨基因產物為在蜂中產生致病性癥狀所必需的產物。根據本發明的此方面可減量調節的示例性基因產物包括但不限于NADH脫氫酶；亞基2- Genbank檢索號NC_004454 ；ATP合成酶；亞基8_NC_004454 ；ATP合成酶；亞基6_NC_004454 ;鈉通道基因-Genbank檢索號FJ216963 ;細胞色素氧化酶亞基I- Genbank檢索號EF025469。要理解的是，在本發明的試劑能夠減量調節狄斯瓦螨的基因產物表達的同時，優選的是，它們在其它動物(例如蜂)中在較小程度上調節所述基因產物的表達。因此，本發明的試劑必須能夠區分螨基因和蜂基因，以比后者更大的程度減量調節前者。根據另一個實施方案，本發明的試劑無論如何都不會減量調節蜂基因。這可通過靶定在螨中差異表達而在蜂中不表達的基因(例如螨鈉通道基因-FJ216963)來實現。備選地，可使本發明的試劑靶定在螨和蜂中均表達的基因的螨特異性序列。根據一個實施方案，本發明的試劑靶定螨基因的以下區段，其至少為100個堿基長且不攜帶與任何蜂基因組序列或人基因組序列完全同源的長于19個堿基的任何序列。在下文中提供這類基因區段的實例
SEQ ID NO: I:與ATP酶亞基A (區段I)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 2:與ATP酶 亞基A (區段2)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 3:與ATP酶亞基A (區段3)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 4:與ATP酶亞基A (區段4)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 5:與ATP酶亞基A (區段5)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 6:與ATP酶亞基A (區段6)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 7:與ATP酶亞基A (區段7)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 8:與ATP酶亞基A (區段8)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 9:與ATP酶亞基A (區段9)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 10 與RNA聚合酶I (區段I)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 11 :與RNA聚合酶I (區段2)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 12:與RNA聚合酶I (區段3)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 13:與RNA聚合酶III (區段I)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 14 :與RNA聚合酶III (區段2)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 15:與RNA聚合酶III (區段3)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 16 :與RNA聚合酶III (區段4)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO:17:與RNA聚合酶III (區段5)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 18:與RNA聚合酶III (區段6)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 19 :與RNA聚合酶III (區段7)同源的瓦螨基因；SEQID NO: 20:與RNA聚合酶III (區段8)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 21:與RNA聚合酶III (區段9)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 22 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段I)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 23 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段2)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 24 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段3)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 25 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段4)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 26 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段5)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO:27 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段6)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 28 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段7)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 29 :與凋亡抑制劑(IAP ;區段8)同源的瓦螨基因；SEQID NO: 30 :與FAS凋亡抑制劑(區段I)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 31 :與FAS凋亡抑制劑(區段2)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 32 :與FAS凋亡抑制劑(區段3)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 33 :與α-微管蛋白(區段I)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 34:與0-微管蛋白(區段2)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 35:與α-微管蛋白(區段3)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 36 :與α-微管蛋白(區段4)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 37 :與α-微管蛋白(區段5)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 38 :與α-微管蛋白(區段6)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 39 :與α-微管蛋白(區段7)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 40 與α-微管蛋白(區段8)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 41 與α-微管蛋白(區段9)同源的瓦螨基因；SEQ ID NO: 42 :NADH 脫氫酶；亞基 2 (NC_004454):堿基 709-974 ;SEQ IDNO: 43 :ATP合成酶；亞基8 (NC_004454):第 3545-3643 個堿基；SEQ ID NO: 44 :鈉通道蛋白(AY259834):堿基 3336-3836。要理解的是，可靶定多于一種基因以使對瓦螨的細胞毒性效應最大化。因此，根據一個實施方案，靶定下組基因ATP酶亞基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白(例如使用具有如I、13、27、30和39所述序列的核酸劑)。根據另一個實施方案，靶定下組基因ΑΤΡ酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白。要理解的是，除了減量調節許多基因之外，本發明進一步預期使用若干試劑來減量調節相同的基因(例如，每個都與相同基因的不同區段雜交的若干dsRNA)。因此，例如 當使用下列dsRNA的混合物時，本發明人顯示最大的細胞毒性活性SEQ ID No:l、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39，而當使用下列dsRNA的混合物時，顯示較小的細胞毒性活性SEQ ID No: 1、13、27、30 和 39。可將能夠識別種特異性序列的工具用于此目的——例如BLASTN和其它這類計算機程序。本文所用的術語“減量調節表達”是指直接或間接地引起所需基因轉錄的減少、基因的轉錄產物(例如，RNA)在量、穩定性或可譯性方面的減少和/或由所需基因編碼的多肽翻譯的減少。減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達可如下監測，例如通過直接檢測基因轉錄物(例如，通過PCR)、通過檢測由所述基因或蜂病原體RNA編碼的多肽(例如，通過蛋白質印跡或免疫沉淀)、通過檢測由所述基因編碼的多肽的生物活性(例如，催化活性、配體結合等)或通過監測狄斯瓦螨中的變化(例如，螨的增殖減少、螨的致病力降低、螨的活動力降低等)以及通過測試蜂傳染性/致病性。使用干擾轉錄和/或翻譯的各種試劑(例如RNA沉默劑、核酶、DNA酶和反義物)可在基因組水平和/或轉錄物水平方面實現狄斯瓦螨基因產物的減量調節。根據一個實施方案，減量調節狄斯瓦螨基因產物表達的試劑為多核苷酸劑，例如RNA沉默劑。根據此實施方案，所述多核苷酸劑長度大于15個堿基對。本文所用的短語“RNA沉默”是指由RNA分子介導的一組調節機制[例如，RNA干擾(RNAi)、轉錄基因沉默(TGS)、轉錄后基因沉默(PTGS)、壓抑、共抑制和翻譯阻遏]，其導致相應的蛋白質編碼基因或蜂病原體RNA序列表達的抑制或“沉默”。已在許多類型的生物體中觀察到RNA沉默，所述生物體包括植物、動物和真菌。本文所用的術語“RNA沉默劑”是指能夠抑制或“沉默”靶基因表達的RNA。在某些實施方案中，RNA沉默劑能夠通過轉錄后沉默機制來阻止mRNA分子的完整加工(例如，完全翻譯和/或表達)。RNA沉默劑包括非編碼RNA分子，例如包含配對鏈的RNA雙鏈體，以及自其可產生這類小的非編碼RNA的前體RNA。示例性RNA沉默劑包括dsRNA，例如siRNA、miRNA和shRNA。在一個實施方案中，RNA沉默劑能夠誘導RNA干擾。在另一個實施方案中，RNA沉默劑能夠介導翻譯阻遏。RNA干擾是指動物中由短干擾RNA (siRNA)介導的序列特異性轉錄后基因沉默的過程。相應過程在植物中通常被稱為轉錄后基因沉默或RNA沉默，而在真菌中還被稱為壓抑。認為轉錄后基因沉默的過程為進化上保守的細胞防御機制，其用來阻止外源基因的表達，且通常由不同的區系和門共享。經由細胞應答的對外源基因表達的這類防護，可響應于雙鏈RNA (dsRNA)的產生而進化，所述雙鏈RNA來源于病毒感染或來源于轉座子元件到宿主基因組中的隨機整合，所述細胞應答特異地破壞同源的單鏈RNA或病毒基因組RNA。細胞中長dsRNA的存在刺激被稱為切酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切酶涉及將dsRNA加工成被稱為短干擾RNA (siRNA)的短片段dsRNA。來源于切酶活性的短干擾RNA典型地為約21-約23個核苷酸長并包含約19個堿基對的雙鏈體。RNAi應答也以內切核酸酶復合體(通常被稱為RNA誘導的沉默復合體(RISC))為特征，所述復合體介導具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈RNA的切割。靶RNA的切割發生在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的區的中部。根據一個實施方案，所述dsRNA長于30 bp。使用長dsRNA可提供許多優勢，因為細胞可選擇最佳沉默序列，這減少測試眾多siRNA的需要；長dsRNA允許沉默文庫具有與 siRNA可能所需的復雜性相比更小的復雜性；和，或許最重要地，當用作治療劑時，長dsRNA可防止病毒逃逸突變。多項研究表明，長dsRNA可用來沉默基因表達，而不誘導應激反應或引起顯著
的脫祀效應-參見例如[Strat 等，Nucleic Acids Research, 2006,卷 34，期 13
3803 - 3810 ；Bhargava A 等，Brain Res. Protoc. 2004; 13:115 - 125 ；Diallo M.等，Oligonucleotides. 2003;13:381 - 392 ;Paddison P.J.等，Proc. Natl Acad. Sci.USA. 2002; 99:1443 - 1448 ;Tran N.等，FEBS Lett. 2004;573:127 - 134]。減量調節瓦螨基因產物的另一種方法為通過引入小抑制性RNA (siRNA)。術語“ siRNA”是指誘導RNA干擾(RNAi)途徑的小抑制性RNA雙鏈體(一般18_30個堿基對、19-25個堿基對)。雖然近來已描述與21聚體相比，相同位置上長度為25-30個堿基的化學合成RNA雙鏈體效力具有多達100倍增加，但仍典型地將siRNA化學合成為21聚體，其具有中心的19 bp雙鏈體區和末端上對稱的2-堿基3’突出端。觀察到在觸發RNAi中使用較長的RNA獲得增加的效力，推測其起因于給切酶提供底物(27聚體)而不是產物(21聚體)，這改善了 siRNA雙鏈體進入RISC的速率或效率。已發現3’突出端的位置影響siRNA的效力，以及在反義鏈上具有3’突出端的不對稱雙鏈體一般比在有義鏈上具有3’突出端的不對稱雙鏈體更有效(Rose等，2005)。這可歸因于不對稱鏈加載入RISC中，因為當靶定反義轉錄物時觀察到相反的功效模式。可連接雙鏈干擾RNA (例如，siRNA)的鏈，以形成發夾或莖環結構(例如，shRNA)。因此，如所提及的，本發明的RNA沉默劑也可為短發夾RNA (shRNA)。本文所用的術語“shRNA”是指具有莖環結構的RNA劑，其包含互補序列的第一區和第二區，互補性程度和區的定向足以使區之間形成堿基配對，第一區和第二區通過環區連接，所述環起因于在環區內的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對。環中核苷酸的數目為在3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11之間并包含其端值的數字。環中的某些核苷酸可涉及與環中其它核苷酸的堿基對相互作用。可用來形成環的寡核苷酸序列的實例包括5’-UUCAAGAGA-3’ (SEQ ID NO: 4 ;Brummelkamp, T. R.等，(2002) Science 296:550)和 5’-UUUGUGUAG-3’ (SEQ ID NO: 5 ；Castanotto, D.等，(2002) RNA 8:1454)。本領域技術人員要認識的是，產生的單鏈寡核苷酸形成莖環或發夾結構，所述結構包含能夠與RNAi機構相互作用的雙鏈區。根據另一個實施方案，所述RNA沉默劑可為miRNA。miRNA為從編碼各種大小的初級轉錄物的基因制備的小RNA。已在動物和植物二者中鑒定它們。初級轉錄物(稱為“初miRNA (pri-miRNA)”)通過多個溶核步驟加工成較短的前體miRNA或“前miRNA”。所述前miRNA以折疊形式存在使得最終的(成熟的)miRNA以雙鏈體存在，兩條鏈被稱為miRNA (最后將與靶標堿基配對的鏈)。前miRNA為自前體移出miRNA雙鏈體的切酶形式的底物，在移出miRNA雙鏈體后，類似于siRNA，可將所述雙鏈體帶入RISC復合體。已表明的是，miRNA可轉基因表達以及可通過表達前體形式而不是完整的初級形式來起作用(Parizotto 等，(2004) Genes & Development 18:2237-2242 和 Guo 等，(2005) PlantCell 17:1376-1386)。與siRNA不同的是，miRNA以僅部分互補性與轉錄序列結合(Zeng等，2002，Molec. Cell 9:1327-1333)并且阻遏翻譯而不影響穩態RNA水平(Lee等，1993，Cell75:843-854 ;Wightman 等，1993，Cell 75:855-862)。miRNA 和 siRNA 二者均通過切酶加 工并與RNA誘導的沉默復合體的組分締合(Hutvagner等，2001，Science 293:834-838 ；Grishok 等，2001，Cell 106: 23-34 ;Ketting 等，2001，Genes Dev. 15:2654-2659 ；Williams 等，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6889-6894 ;Hammond 等，2001，Science 293:1146-1150 ;Mourlatos 等，2002，Genes Dev. 16:720-728)。近期報道(Hutvagner 等，2002，Sciencexpress 297:2056-2060)假定，經由與 siRNA 途徑相對的miRNA途徑的基因調節僅由與靶轉錄物的互補性程度確定。推測的是，類似于miRNA，與mRNA靶標僅具有部分同一性的siRNA以翻譯阻遏中起作用而不是觸發RNA降解。在本發明的一個實施方案中，適于與本發明一起使用的RNA沉默劑的合成可如下實現。首先，在AUG起始密碼子的下游針對AA二核苷酸序列掃描瓦螨靶mRNA。把每個AA和3’相鄰的19個核苷酸的出現記錄為潛在的siRNA靶位點。由于非翻譯區(UTR)在調節蛋白結合位點中更豐富，因此優選地siRNA祀位點選自可讀框。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合體可能干擾siRNA內切核酸酶復合體的結合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。但要理解的是，指向非翻譯區的siRNA也可有效，如對GAPDH所表明的，其中指向5’ UTR的siRNA介導了在細胞GAPDH mRNA上約90%的減少并完全廢止蛋白質水平(wwwdotambiondotcom/techlib/tn/91/912dothtml)。其次，使用任何序列比對軟件將潛在的靶位點與適當的基因組數據庫(例如，人、蜂、小鼠、大鼠等)相比較，所述軟件為例如可獲自NCBI服務器的BLAST軟件(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)。濾除對其它編碼序列表現出顯著同源性的推定靶位點。挑選出合格的靶序列作為用于siRNA合成的模板。優選的序列為包含低G/C含量的序列，因為已證明與G/C含量高于55%的序列相比，這些序列在介導基因沉默方面更有效。優選沿著靶基因或序列的長度選擇數個靶位點用于評價。為了更好地評價所選siRNA，優選結合使用陰性對照。優選陰性對照siRNA包含與siRNA相同的核苷酸組成，但缺少與基因組的顯著同源性。因此，優選使用雜亂的siRNA核苷酸序列，前提是其對任何其它基因或蜂病原體靶序列不顯示任何顯著同源性。
例如，可用于本發明此方面的siRNA為靶定螨特異性基因的siRNA。在SEQ ID NO:45-47中提供了示例性siRNA。SEQ ID NO: 45 attttattcaattaaagtattSEQ ID NO: 46 atacctcaaatgtatccttcaSEQ ID NO: 47 ggccaatcccgattccggcga
要理解的是，本發明的RNA沉默劑不需要限于僅含RNA的那些分子，而是進一步包含化學修飾的核苷酸和非核苷酸。在某些實施方案中，本文提供的RNA沉默劑可與細胞滲透肽功能上相關。本文所用的“細胞滲透肽”為包含以下短(約12-30個殘基)氨基酸序列或功能性基序的肽，所述短氨基酸序列或功能性基序賦予與轉運透膜復合體穿過細胞的質膜和/或核膜相關的能量獨立性(即，非內吞性)易位特性。優選用于本發明的透膜復合體的細胞滲透肽包含至少一個非功能性半胱氨酸殘基，其為游離的或被衍生以與已針對這類鍵合修飾的雙鏈核糖核酸形成二硫鍵。賦予這類特性的代表性氨基酸基序列舉在美國專利第6，348，185號中，其 內容通過引用明確地結合于本文中。優選本發明的細胞滲透肽包括但不限于penetratin、transportan、plsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS 和 MAP。能夠減量調節瓦螨基因產物的另一種試劑為能夠特異性切割蜂病原體多肽的mRNA轉錄物或DNA序列的DNA酶分子。DNA酶為單鏈多核苷酸，其能夠切割單鏈和雙鏈靶序列二者(Breaker, R. R.和 Joyce, G. Chemistry and Biology 1995; 2:655 ；Santoro,S. ff. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997; 943:4262)。已提出用于 DNA 酶的一般模型(“10-23”模型)。“10-23” DNA酶具有15個脫氧核糖核苷酸的催化域，由各自7-9個脫氧核糖核苷酸的兩個底物識別域的側接。這種DNA酶類型可有效地在嘌呤嘧唳連接處切割其底物 RNA (Santoro, S. ff. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA199 ;關于 DNA 酶的綜述參見 Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)]。減量調節瓦螨基因產物也可通過使用反義多核苷酸來完成，所述反義多核苷酸能夠特異性地與編碼瓦螨基因產物的mRNA轉錄物雜交。在考慮對反義方法重要的兩個方面的同時，必須實現可用來有效地減量調節瓦螨基因產物的反義分子的設計。第一方面為遞送寡核苷酸進入適當細胞的細胞質，而第二方面為寡核苷酸的設計，所述寡核苷酸以抑制其翻譯的方式與細胞內指定的mRNA或RNA靶序列特異性結合。先前技術教導了許多遞送策略，其可用來有效遞送寡核苷酸進入多種細胞類型[參見例如 Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998) ;Kronenwett 等，Blood 91: 852-62(1998) ;Rajur 等，Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997) ;Lavigne 等，Biochem BiophysRes Commun 237: 566-71 (1997)和Aoki 等，(1997) Biochem Biophys Res Commun 231:540-5 (1997)]。此外，也可得到用于鑒定對其靶mRNA具有最高預測結合親和力的那些序列的算法，其基于解釋在靶mRNA和寡核苷酸二者中結構改變的能量學的熱力學循環[參見例如Walton 等，Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)]。這類算法已成功地用來在細胞中實施反義方法。例如，由Walton等開發的算法使科學家能夠成功地設計用于兔β_球蛋白(RBG)和小鼠腫瘤壞死因子-a (TNF α )轉錄物的反義寡核苷酸。同一研究小組最近報道，如通過動態PCR技術所評價，合理選擇的寡核苷酸在細胞培養中對三種模型靶mRNA (人乳酸脫氫酶A和B以及大鼠gpl30)的反義活性，證明在幾乎所有情況中有效，所述情況包括在具有磷酸二酯和硫代磷酸寡核苷酸化學物質的兩種細胞類型中對三種不同靶標進行的測試。此外，也發表了用于使用體外系統設計和預測特異性寡核苷酸效力的數種方法(Matveeva 等，Nature Biotechnology 16: 1374-1375 (1998)]。能夠減量調節瓦螨基因產物的另一種試劑為能夠特異性切割編碼瓦螨基因產物的mRNA轉錄物的核酶分子。核酶通過切割編碼目的蛋白質的mRNA而逐漸地用于序列特異性抑制基因表達[Welch 等，Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。設計切割任何特異性革E RNA (包括病毒RNA)的核酶的可能性，已使它們成為在基礎研究和治療應用二者中均有價值的工 具。減量調節細胞中瓦螨基因產物的表達的另一種方法為經由三鏈結構寡核苷酸(TFO)。近期研究已顯示，可設計可以序列特異性方式識別和結合到雙鏈螺旋DNA的多嘌呤/多嘧啶區的TF0。這些識別規則由Maher III，L. J.等，Science, 1989;245:725-730 ；Moser, H. Ε·等，Science, 1987;238:645-630 ;Beal, P.A.等，Science, 1992;251:1360-1363 ；Cooney, M.等，Science, 1988; 241:456-459 ;和Hogan, Μ. E.等，EP Publication 375408概述。寡核苷酸的修飾(例如引入嵌入劑和骨架取代)和結合條件(PH和陽離子濃度)的優化幫助克服對TFO活性的內在阻礙(例如電荷排斥和不穩定性)，以及近期已顯示，可將合成的寡核苷酸靶定特定序列(關于最新綜述參見 Seidman 和 Glazer, J Clin Invest 2003;112:487-94)。一般而言，三鏈結構寡核苷酸具有序列對應性
寡核苷酸 3’ -AGGT
雙鏈體5’ -AGCT
雙鏈體3’ -TCGA
然而已顯示，A-AT和G-GC三鏈體具有最大的三股螺旋穩定性(Reither和Jeltsch,BMC Biochem, 2002年9月12日，Epub)。同一作者表明，根據A-AT和G-GC規則設計的TFO不形成非特異性三鏈體，表明三鏈體形式的確為序列特異性的。三鏈結構寡核苷酸長度優選為至少15、更優選25、再更優選30或更多個核苷酸，最多50或100 bp。用TFO轉染細胞(例如，經由陽離子脂質體)以及與靶DNA形成三股螺旋結構，誘導空間和功能改變，阻斷轉錄起始和延伸，允許在內源性DNA中引入所需的序列改變并引起基因表達的特異性減量調節。設計、合成和施用有效TFO的詳述可在美國專利申請號2003 017068和20030096980 (Froehler 等)、2002 0128218 和 2002 0123476 (Emanuele 等)以及美國專利號5，721，138 (Lawn)中找到。本發明的多核苷酸減量調節劑可根據本領域已知的任何多核苷酸合成方法生成，所述方法為例如酶促合成或固相合成。用于進行固相合成的儀器和試劑可從例如AppliedBiosystems商購。也可使用任何其它用于這類合成的方法；多核苷酸的實際合成完全在本領域技術人員的能力之內并且可經由已建立的方法利用固相化學(例如氰乙基亞磷酰胺，接著脫保護、脫鹽和通過例如自動化的基于三苯甲基的方法(trityl-on method)或HPLC來純化)來完成，所述方法詳述于例如“分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning: A laboratory Manual) ” Sambrook 等，(1989);“分子生物學中的現行方案(Current Protocols in Molecular Biology)，，卷 I-III , Ausubel, R. M.編輯(1994)；Ausubel 等，“分子生物學中的現行方案(Current Protocols in Molecular Biology)”,John Wiley 和 Sons, Baltimore, Maryland (1989) ；Perbal, “分子克隆的實踐指南(APractical Guide to Molecular Cloning)”， John Wiley & Sons, New York (1988)以及“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) ”Gait, M. J.編輯(1984)。本發明的多核苷酸劑可包含由以3’-5’磷酸二酯鍵結合的嘌呤和嘧啶堿基組成的雜環核苷。優選使用的多核苷酸劑為在骨架、核苷間鍵或堿基中修飾的多核苷酸劑，如在下文中所概述。根據本發明的此方面有用的優選多核苷酸劑的具體實例包括包含經修飾的骨架或非天然核苷間鍵的多核苷酸劑。具有經修飾的骨架的多核苷酸劑包括在骨架中保留磷原子的多核苷酸劑，如在美國專利第4，469, 863 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，196 ；5，188，897 ;5，264，423 ;5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ；5，405，939 ;5，453, 496 ;5，455, 233 ;5，466，677 ;5，476, 925 ;5，519，126 ;5，536, 821 ；5，541，306 ;5，550，111 ;5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 和 5，625，050 號中所公開。優選的經修飾的多核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’ -烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’ -5’鍵合的硼烷磷酸 酯(boranophosphates)、這些的2’-5’連接類似物，以及具有反極性的那些,其中核苷單元的相鄰對為3’-5’與5’-3’或2’-5’與5’-2’連接的。也可使用多種鹽、混合鹽和游離酸形式。或者，其中不包含磷原子的經修飾的多核苷酸骨架具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵、或者一種或多種短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2組分部分的其它骨架，如在美國專利第 5，034，506 ;5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ；5，235，033 ;5，264，562 ;5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ；5，489，677 ;5，541，307 ;5，561，225 ;5，596，086 ;5，602, 240 ;5，610, 289 ;5，602, 240 ；5，608，046 ;5，610，289 ;5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 和5，677，439號中所公開。根據本發明可使用的其它多核苷酸劑為在糖和核苷間鍵二者中均修飾的多核苷酸劑，即，用新基團取代核苷酸單元的置換。維持堿基單元用于與適當多核苷酸靶標互補。這類多核苷酸模擬物的實例包括肽核酸(PM)。PNA多核苷酸是指其中用含酰胺骨架特別是氨乙基甘氨酸骨架置換糖骨架的多核苷酸。將堿基保留并直接或間接地與骨架酰胺部分的氮雜氮原子結合。教導制備PNA化合物的美國專利包括但不限于，美國專利第5，539，082 ;5，714，331和5，719，262號，其每個通過引用結合于本文中。可用于本發明的其它骨架修飾在美國專利第6，303，374號中公開。本發明的多核苷酸劑也可包含堿基修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。經修飾的堿基包括但不限于其它合成的和天然的堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶 、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。另外的堿基包括在美國專利第3，687，808中公開的那些、在聚合物科學與工程的簡明百科全書(The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering), 858-859 頁，Kroschwitz, J.I.,編輯 John Wiley & Sons, 1990 中公開的那些、由 Englisch 等，Angewandte Chemie,International Edition, 1991, 30, 613 公開的那些以及由 Sanghvi, Y. S·，第 15 章，反義研究與應用(Antisense Research and Applications), 289-302 頁，Crooke, S.T.和Lebleu，B.，編輯，CRC Press, 1993公開的那些。這類堿基對增強本發明寡聚化合物的結合親和力特別有用。這些包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代增加核苷酸雙鏈體穩定性0.6-1. 2°C [Sanghvi YS等(1993)反義研究和應用(Antisense Research and Applications), CRC Press, Boca Raton 276-278],并且為目前優選的堿基取代，甚至更特別地當與2’ -O-甲氧乙基糖修飾組合時。合成之后，可任選純化本發明的多核苷酸劑。例如，可通過用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、層析或其組合從混合物中純化多核苷酸。或者，多核苷酸可在不純化或經最小程度的純化的情況下使用，以避免因樣品加工的損失。可干燥所述多核苷酸用于儲存或將其溶于水溶液中。所述溶液可含有緩沖液或鹽以促進雙鏈體鏈的退火和/或穩定。要理解的是，可提供本發明的多核苷酸劑本身，或將其提供為包含編碼所述多核苷酸劑的核酸序列的核酸構建體。典型地，如下文所詳述，所述核酸構建體包含在宿主細胞中有功能的啟動子序列。在可操作地連接的啟動子序列的控制下，本發明的多核苷酸序列可進一步被附加序列側接，所述附加序列有利地影響其轉錄和/或所得轉錄物的穩定性。這類序列一般位于啟動子上游和/或表達構建體的3’末端下游。用于提及調節序列和結構核苷酸序列的術語“可操作地連接的”，意為調節序列引起連接的結構核苷酸序列的調節表達。“調節序列”或“控制元件”是指這樣的核苷酸序列，其位于結構核苷酸序列的上游、之內或下游，且影響轉錄的時機和水平或量、RNA加工或穩定性或者相關結構核苷酸序列的翻譯。調節序列可包含啟動子、翻譯前導序列、內含子、增強子、莖環結構、阻遏物結合序列、終止序列、暫停序列、多聚腺苷酸化識別序列等。要理解的是，可以許多種方式將所述核酸劑遞送給瓦螨。根據一個實施方案，將所述核酸劑直接遞送給螨(例如，通過噴淋受侵染的蜂巢)。所述核酸劑或編碼所述核酸劑的構建體可通過擴散進入螨體內。在此實施方案中，核酸構建體的啟動子典型地在螨細胞中有效。要理解的是，由于瓦螨使用它們的嘴刺穿蜂外骨骼并且以蜂的血淋巴為食，因此本發明預期將本發明的多核苷酸劑遞送給蜂，籍此其變為存在于蜂的血淋巴中，從而變為螨可獲取的。因此，根據另一個實施方案，將所述核酸劑間接遞送給螨(例如，通過蜂)。在此實施方案中，核酸構建體的啟動子典型地在蜂細胞中有效。根據一個實施方案，通過噴淋將所述核酸劑遞送給蜂。所述核酸劑或編碼所述核 酸劑的構建體可通過擴散進入蜂體內。根據另一個實施方案，經由其食物將所述核酸劑遞送給蜂。本發明人認為，攝取本發明的核酸劑之后，所述試劑將存在于蜂的血淋巴中，籍此其變為瓦螨可獲取的。因此本發明的多核苷酸可體外合成并添加到食物中。例如可通過向基因區段的末端加入兩個相對的啟動子(例如T7啟動子；SEQ ID NO: 48和49)來合成雙鏈RNA，其中將SEQ ID NO: 48置于緊靠基因的5’而將SEQ ID NO: 49置于緊靠基因區段的3’。然后可用T7 RNA聚合酶體外轉錄所述dsRNA。用于合成本發明實施方案的dsRNA的示例性序列在SEQ ID NO: 50_93中提供。如本文所詳述的，蜂飼喂在養蜂人中是通常作法，以提供營養和其它需要(例如，補充的需要)。蜂典型地以蜂蜜和花粉為食，但是已知其也攝取非天然飼料。可喂給蜂多種食料，包括但不限于Wheast (在酪農農干酪上生長的乳品酵母)、大豆粉、酵母(例如釀酒酵母(brewer’s yeast)、圓酵母(torula yeast))和單獨或組合地飼喂的酵母產物以及作為蜂巢內的干混合物或濕餅或者作為蜂巢外敞開的飼養器中的干混合物飼喂的大豆粉。糖或糖漿也可使用。向喂食給蜂的補充物中添加10-12%的花粉改善適口性。添加25-30%的花粉改善蜂用于生命活動所需的必需營養物的質和量。蔗糖或甜菜糖、異構化玉米糖漿和50型糖漿為蜜蜂的天然飲食中蜂蜜的良好代用品。后兩者可僅作為液體供應給蜂。可通過例如下列方法中的任一種在蜂巢內將液體飼料供應給蜂靠摩擦擰緊蓋子的桶(friction-top pail)、育卵室內的蜂房、柜式飼養器、boardman飼養器等。可通過在倒置的內罩上放置一或兩磅來飼喂干糖。供水必須為蜂一直都可獲取的。在一個實施方案中，設想了其中存在漂浮的支持物(例如木片、軟木塞或塑料海綿)的盤或托盤。蜂的補充飼料的詳述可在例如由Standifer等1977，標題為“蜜蜂群體的補充喂食(SupplementalFeeding of Honey Bee Colonies) ” 的 USDA 出版物(USDA, Agriculture InformationBulletin No. 413)中找到。要理解的是，瓦螨在蜂的外骨骼中產生傷口部位。這類傷口部位隱匿有細菌感染，例如蜂房球菌，其導致歐洲幼蟲腐臭病。此外，因為它們的寄生作用，懷疑瓦螨充當許多蜜蜂病原體(包括羽翼畸形病毒(DWV)、克什米爾蜜蜂病毒(KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王臺病毒(BQCV))的載體，并且瓦螨可減弱其宿主的免疫系統，使得它們易受感染的攻擊。因此，通過殺死螨(或防止其繁殖)，本發明的試劑可用來預防和/或治療細菌感染(例如蜂房球菌感染)以及由以上命名的病毒引起的病毒感染。由于認為瓦螨侵染和病毒感染為蜂群崩潰失調病(CXD)的原因，因此本試劑也可用來防止或減少蜂群體對CCD的易 感性。要理解的是，除了飼喂寡核苷酸和/或多核苷酸用來減少蜂病原體感染和侵染之夕卜，實行適當的環境衛生(例如，制止受侵染蜂巢的再使用)可增加治療和預防感染的有效性。預期的是，在自本申請成熟的專利壽命期間，將開發許多用于減量調節基因產物表達的相關方法，意圖術語“減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達”的范圍先驗地包含所有這類新技術。本文所用的術語“約”是指±10%。術語“包括”、“包括的”、“包含”、“包含的”、“具有”及其變化意為“包括但不限于”。此術語包含術語“由……組成”和“基本由……組成”。短語“基本由……組成”意為，僅當附加的成分和/或步驟未實質上改變所要求保護的組合物或方法的基本特征和新特征時，所述組合物或方法可包含附加的成分和/或步驟。除非文段另有明確指示，否則本文所用的單數形式“一”、“一個”和“所述”也包括復數所指。例如，術語“化合物”或“至少一種化合物”可包含多種化合物，包括其混合物。本文所用的術語“方法”是指完成給定任務的方式、手段、技術和程序，包括但不限于化學、藥理學、生物學、生物化學和醫學領域的從業者已知的或從所述從業者已知的方式、手段、技術和程序容易地開發的那些方式、手段、技術和程序。本文所用的術語“治療”包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉病況的行進，基本上改善病況的臨床或美學癥狀或者基本上防止出現病況的臨床或美學癥狀。要理解的是，在單獨的實施方案的文段中因清楚目的而描述的本發明的某些特征，也可在單個實施方案中以組合提供。反之，在單個實施方案的文段中因簡明目的而描述的本發明的多個特征，也可單獨地或以任何適宜的子組合提供，或者適宜的話提供在本發明的任何其它描述的實施方案中。除非實施方案在不具備那些要素時無法實施，否則不認為在多個實施方案的文段中描述的某些特征為那些實施方案的必不可少的特征。如上文中所描述和如所附權利要求部分所要求保護的本發明的多個實施方案和方面在下列實施例中找到實驗支持。
實施例現對以下實施例進行引用，其連同下列描述以非限制性方式舉例說明本發明的某些實施方案。一般而言，本文所用的術語和本發明中所使用的實驗室程序包括分子技術、生物化學技術、微生物學技術和重組DNA技術。在文獻中充分解釋了這類技術。參見，例如“分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning: A laboratory Manual)，，Sambrook 等，(1989)；“分子生物學中的現行方案(Current Protocols in Molecular Biology) ” I-III 卷Ausubel, R. Μ·，編輯(1994) ；Ausubel等，“分子生物學中的現行方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)”， John Wiley 和 Sons， Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, “分子克隆的實踐指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，John Wiley & Sons, New York (1988) ;Watson 等，“重組 DNA(Recombinant DNA) ”，Scientific American Books, New York; Birren 等(編輯)“基因組分析實驗室手冊系列(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)，，1-4 卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York (1998);如在美國專利第 4，666，828 ;4，683，202 ;4，801，531 ;5，192，659和5，272，057號中所述的方法；“細胞生物學實驗室手冊(CellBiology: A Laboratory Handbook)”，I-III 卷 Cellis，J. E.，編輯(1994); “動物細胞
培養-基礎技術手冊(Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique)，，，
Freshneyj Wiley-Lissj N. Y. (1994)，第三版；“免疫學中的現行方案(CurrentProtocols in Immunology) ” I-III 卷 Coligan J. Ε·，編輯(1994) ;Stites 等(編輯)，“基礎和臨床免疫學(Basic and Clinical Immunology) ”(第 8 版)，Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ;Mishell和Shiigi (編輯)，“細胞免疫學中所選擇的方法(SelectedMethods in Cellular Immunology) ”，W. H. Freeman 和Co·，New York (1980);在專利和科學文獻中廣泛描述的可用的免疫測定法，參見例如美國專利第3，791，932 ;3，839，153 ；3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ;3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ;3，935，074 ；3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ;4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 和 5，281，521 號；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) ”Gait，M. J.，編輯(1984);“核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization) ”Hames，Β· D.，和 Higgins S. J.，編輯(1985);“轉錄和翻譯(Transcription and Translation) ” Hames，Β· D.，和 Higgins S. J.，編輯(1984)動物細胞培養(Animal Cell Culture)Freshneyj R. I.，編輯(1986)固定化細胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes) ” IRL Press, (1986)分子克隆的實踐指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)，，Perbal，B.，(1984)和“酶學中的方法(Methods in Enzymology) ” 1-317 卷，Academic Press ;“PCR 方案方法和應用的指南(PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications)”，Academic Press,
San Diego, CA (1990) ;Marshak等，“用于蛋白質純化和表征的策略-實驗室課程手冊
(Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory CourseManual)"CSHL Press (1996);其全部通過如同完全地在本文中描述的引用而結合。在此文件的各處提供了其它的一般引用。認為其中的程序為本領域眾所周知的，為了讀者的方便而提供所述程序。其中所包含的全部信息通過引用結合于本文中。實施例I
飼喂瓦螨特異性dsRNA預防瓦議侵染
為了確定攝取的dsRNA對瓦螨侵染的有效性，如圖I所示，與瓦螨接觸前7天和與瓦螨接觸后2天，在飼料中給蜜蜂供應瓦螨特異性dsRNA和對照dsRNA。計算每個實驗蜂巢死亡瓦螨的數量，并收集活瓦螨和死瓦螨樣品用于分子分析。材料和方法
#產^鑛莫#紙效瘦立從當地養蜂場的蜂巢中收集幼年(約2個月大)蜂王連同約200只工蜂。將蜂轉移到用一個小型蜂房裝配的小型蜂巢中，所述小型蜂房預先由規則的蜂巢建立。封蓋全部小型蜂巢并置于控溫房中(30°C)。dsRNA制備:將瓦螨序列克隆到質粒的兩個相對的T7啟動子之間。增殖質粒DNA之后，切取病毒片段(包括T7啟動子)并凝膠純化。這些充當用于T7指導的體外轉錄(MEGAscript , Ambion, Austin TX)的模板。將反應產物進行DNA酶消化，之后進行苯酚提取和乙醇沉淀。將最終制品溶解在無核酸酶的水中。在小型蜂巢中飼喂dsRNA :在M今備鏡g花粉補充餅，且每夜用無菌的培養皿將10 ml 50%蔗糖溶液加入蜂巢中。持續飼喂9天，之后僅將其中蜂王已開始產卵的蜂桌包含在試驗中。建立活躍蜂巢(蜂王產卵)之后，給某些小型蜂巢補充瓦螨特異性(凋亡抑制劑(IAP)基因(SEQ ID NO: 27)或非特異性對照(例如GFP SEQ ID NO: 91) dsRNA，將其加入供應給蜂巢的10 ml 50%蔗糖溶液中，調節至每只蜂每份飼料約I微克dsRNA，假設所有蜂消耗近似相同量的蔗糖溶液。持續dsRNA飼喂6天。
小型蜂巢中的瓦螨侵染.·在活躍蜂巢中飼喂7天后，使某些蜂群與瓦螨群體接觸。其后，再持續dsRNA處理2天。在引入瓦螨群體之后，每天從每個小型蜂巢中收集活蜂和死蜂(幼蟲和成蟲)的樣品，連續32天。將每只收集的蜂冷凍在液氮中并且在分子分析前保藏在-70°C。通過打開蜂巢(無煙)、拆下小型蜂房并從兩邊給小型蜂房拍照來監測蜂群的生活力。每天給蜂巢-蜂房拍照，并監測留下的活蜂的數量。把照片下載到電腦并對每個小型蜂巢計算蜂的總數。為了測試dsRNA毒性，給另一組蜂巢提供瓦螨特異性dsRNA，但不使其與瓦螨群體接觸。兩組蜂巢充當附加的對照未用dsRNA處理并且未接種瓦螨的蜂巢，以及未用dsRNA處理但已接種瓦螨的蜂巢。RT-PCR 分析:
孩麼游運翁..使用TRIREAGENT方法(Sigma, St. Louis MO, USA)從保藏的蜂中提取總RNA0簡言之，將RNA通過經由離心沉淀和分離來提取，之后重懸在RNA安全溶液(RNAsecuresolution)中。實時TiT-ZO ..使用SYBR Green PCR master mix 連同 Taqman 反轉錄酶(AppliedBiosystems, Foster City, CA)將測定量的RNA (100 ng用于病毒表達分析,100 pg用于18S rRNA 內參)進行一步 RT-PCR。實時 RT-PCR 在 GeneAmp PCR System 5700 (AppliedBiosystems)中進行。無反轉錄酶或無模板下進行的反應不應產生任何產物。TPU伊遂分游".·從處理蜂和對照蜂提取總RNA。向RNA中加入甲醛至I. 8%并加熱至65°C。在70V 4°C攪拌下，使RNA (每泳道15 //g)在I. 2%瓊脂糖凝膠上電泳。將先前所述經擴增的瓦螨RNA產物用洋地黃毒苷標記并充當雜交探針。用DIG發光檢測試劑盒(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)進行檢測。通過與電泳 RNA 分子量標記 I(Roche)比較來估計RNA大小。在高嚴格性(0.1 X SSC; 65°C )下進行雜交。蜜蜂中攝入的瓦螨特異性dsRNA的命運為了更好地了解dsRNA-瓦螨保護蜂免受瓦螨侵染的作用機制及其結果，從dsRNA-瓦螨處理的蜂和未處理的對照蜂提取總RNAj^由一組核酸酶進行消化，并在PAGE上分離。結果
通過使用用于GFP的探針的狹線印跡雜交確定了在成年蜂體、蜂幼蟲(通過成年蜂喂養)、蜂蛹中dsRNA的存在情況。通過檢測小RNA的RNA印跡確定了針對siRNA的dsRNA加工(圖 2A-E)。在用dsRNA-GFP飼喂7天的成年蜂和對照(未飼喂)蜂上放置瓦螨個體。在指定時間(圖I)從瓦螨提取RNA并用GFP引物進行RT-PCR。結果示于圖3中。給蜂飼喂凋亡抑制劑(IAP)基因的dsRNA區段(SEQ ID NO: 27)。通過RT-PCR對從該蜂巢收集的瓦螨分析IAP基因的表達(圖4)。實施例2 材料和方法
用對應于瓦螨基因區段的dsRNA的兩種不同的混合物飼喂蜂巢。所有dsRNA對應于不與蜂或人序列同源(不攜帶長于19個堿基的同源序列段)的基因區段。混合物I (最小處理)包含SEQ ID NO: 1、13、27、30和39。混合物II (最大處理)包含SEQ ID NO: I、 4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39。在每個蜂巢中放置三十只瓦螨個體并在兩個月后對每個蜂巢中的瓦螨和蜂計數。每組處理重復3次。結果
在各個蜂巢中未觀察到對蜂巢蜂數的可見損害。圖5顯示了在用瓦螨基因序列的dsRNA處理之后瓦螨群體的減少。實施例3
用于預防瓦螨相關的蜜蜂疾病的瓦螨特異性dsRNA的大規模現場試驗為了確定在實際現場條件下攝入的瓦螨dsRNA對瓦螨侵染的有效性，以及評價對蜂群健康的重要參數的影響，在用瓦螨侵染前5天和在侵染后4天，在飼料中給全尺寸蜂巢樣品中的蜂提供瓦螨特異性dsRNA。材料和方法 昆蟲材料
來自以下處理的五個蜂群遠程對照、僅瓦螨dsRNA、僅瓦螨以及在每個時間點第O天(病毒施用日)、第7天和終點(第42天)的瓦螨特異性dsRNA +瓦螨。重復測試數次。RNA 提取:
使用Tri-Reagent (Sigma, USA)根據制造商提供的方案提取RNA。在上樣至凝膠之前，用DNA酶I處理所有樣品并用上樣緩沖液(90%甲酰胺、O. 05溴酚藍、O. 05% 二甲苯藍)重懸。凝膠電泳和印跡:
使用nanodrop分光光度計測定10 Ug新鮮制備的RNA并在變性環境(凝膠含有7M尿素)中上樣至12%丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺雙丙烯酰胺比率為1:19)。電泳之后使用電印跡方法將樣品轉移至帶正電荷的尼龍膜(Roch，USA)。雜交和信號檢測:
將膜與新鮮制備的瓦螨區段的DNA探針雜交，所述區段取自不對應于瓦螨特異性dsRNA本身的dsRNA的區。使用DIG PCR探針制備試劑盒(Roch，USA)根據制造商方案在42°C在DIG easyhyb溶液(Roch，USA)中進行。用2 X SSC/0. I % SDS洗滌膜兩次，然后針對嚴格性在65 1用0. I X SSC/0. I % SDS洗滌。使用DIG洗滌和封閉試劑盒(WashandBlock Kit) (Roch, USA)根據制造商方案進一步洗滌膜。使用CSPD-star底物(Roch,USA)進行檢測。陽性對照為對應于已雜交序列的21 nt DNA引物。利用在Kodak制造的化學發光器(chemiIuminator)中暴露膜2-12個小時來檢測信號。在不存在瓦螨侵染時，在飼喂瓦螨-dsRNA的蜂巢和對照蜂巢中評價蜂群體健康的基本參數(封蓋幼蜂的數量、蜂巢中蜂的數量、返回的采集蜂以及蜂蜜產量)。雖然已結合其具體實施方案描述本發明，但明顯的是，許多備選、修飾和變化對本領域技術人員而言顯而易見。因此，意圖包括落入所附權利要求的精神和寬廣范圍之內的所有這類備選、修飾和變化。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均在本文中通過引用以其整體結合到本說明書中，引用程度如同具體和單獨地指出各個單獨的出版物、專利或專利申請 通過引用結合于本文中一樣。此外，不應將本申請中任何參考文獻的加入、引用或確認解釋為承認這類參考可作為本發明的先有技術。就使用節標題而言，不應將其解釋為必要限制。
權利要求
1.一種分離的核酸劑，所述核酸劑包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列。
2.權利要求I的分離的核酸劑，其中所述核酸序列與狄斯瓦螨特異性RNA的至少21個核苷酸互補并且能夠誘導所述狄斯瓦螨RNA的降解。
3.權利要求I的分離的核酸劑，其中所述核酸劑選自dsRNA、反義RNA和核酶。
4.權利要求3的分離的核酸劑，其中所述dsRNA選自siRNA、shRNA和miRNA。
5.權利要求I的分離的核酸劑，其中所述基因產物為編碼選自以下的多肽的mRNAATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α -微管蛋白。
6.—種核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼權利要求I的分離的核酸劑的核酸序列。
7.權利要求I的分離的核酸劑，其中所述核酸序列長度大于15個堿基對。
8.權利要求7的分離的核酸劑，其中所述核酸序列長度為19-25個堿基對。
9.權利要求7的分離的核酸劑，其中所述核酸序列長度大于30個堿基對。
10.一種蜂可攝取的組合物，所述組合物包含至少一種核酸劑，所述核酸劑包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列。
11.權利要求10的蜂可攝取的組合物，其中所述至少一種核酸劑包含至少五種核酸齊U，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少五種核酸劑中的每一種都靶定不同的基因。
12.權利要求10的蜂可攝取的組合物，其中所述至少一種核酸劑包含至少六種核酸齊U，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少六種核酸劑中的每一種都用于靶定不同的基因。
13.權利要求11的蜂可攝取的組合物，其中所述核酸劑如SEQID No: 1、13、27、30和39所述。
14.權利要求12的蜂可攝取的組合物，其中所述核酸劑如SEQID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36 和 39 所述。
15.權利要求10的蜂可攝取的組合物，其中所述組合物呈固體形式。
16.權利要求10的蜂可攝取的組合物，其中所述組合物呈液體形式。
17.權利要求10的蜂可攝取的組合物，其中所述組合物包含蛋白質。
18.權利要求17的蜂可攝取的組合物，其中所述蛋白質呈花粉和/或大豆餅的形式。
19.權利要求16的蜂可攝取的組合物，其中所述液體為蔗糖溶液。
20.權利要求16的蜂可攝取的組合物，其中所述液體為玉米糖漿溶液。
21.權利要求16的蜂可攝取的組合物，其中所述液體進一步包含碳水化合物或糖補充劑。
22.一種預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法，所述方法包括給蜂施用有效量的至少一種包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列的核酸劑，從而預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
23.權利要求22的方法，其中所述蜂為蜜蜂。
24.權利要求23的方法，其中所述蜜蜂為采集蜂。
25.權利要求23的方法，其中所述蜜蜂為蜂巢蜂。
26.權利要求23的方法，其中所述蜜蜂為蜂群的蜂，且其中所述施用降低所述蜂群體對蜂群崩潰失調病的易感性。
27.權利要求22的方法，其中所述施用通過飼喂來實現。
28.權利要求27的方法，其中所述飼喂包括提供液體的蜂可攝取的組合物。
29.權利要求27的方法，其中所述飼喂包括提供固體的蜂可攝取的組合物。
30.權利要求23的方法，其中所述至少一種核酸劑包含至少五種核酸劑，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少五種核酸劑中的每一種都靶定不同的基因。
31.權利要求23的方法，其中所述至少一種核酸劑包含至少六種核酸劑，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少六種核酸劑中的每一種都用于靶定不同的基因。
32.權利要求30的方法，其中所述核酸劑如SEQID No: I、13、27、30和39所述。
33.權利要求31的方法，其中所述核酸劑如SEQID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36 和 39 所述。
34.一種預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法，所述方法包括給蜂施用有效量的權利要求6的核酸構建體，從而預防或治療蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
35.一種降低蜜蜂對蜂群崩潰失調病(CCD)的易感性的方法，所述方法包括給蜜蜂施用有效量的至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)，所述至少一種dsRNA包含與狄斯瓦螨mRNA的至少21個核苷酸互補且能夠誘導所述狄斯瓦螨特異性mRNA降解的序列。
36.權利要求35的方法，其中所述狄斯瓦螨mRNA編碼選自以下的多肽ATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II I、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白。
37.權利要求35的方法，其中所述至少一種核酸劑包含至少五種核酸劑，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少五種核酸劑中的每一種都靶定不同的基因。
38.權利要求35的方法，其中所述至少一種核酸劑包含至少六種核酸劑，用于減量調節ATP酶亞基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制劑(IAP)、FAS凋亡抑制劑和α-微管蛋白，所述至少六種核酸劑中的每一種都用于靶定不同的基因。
39.權利要求37的方法，其中所述核酸劑如SEQID No: I、13、27、30和39所述。
40.權利要求38的方法，其中所述核酸劑如SEQID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36 和 39 所述。
全文摘要
本文公開了一種分離的核酸劑，所述核酸劑包含減量調節狄斯瓦螨基因產物的表達的核酸序列。本文亦公開了包含所述核酸劑的組合物及其用途。
文檔編號A61K31/713GK102906263SQ201080056585
公開日2013年1月30日 申請日期2010年10月14日 優先權日2009年10月14日
發明者I.塞拉, S.沙弗, E.毛里, Y.加比安, E.本查諾奇, G.亞登 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司, 比奧羅吉克斯公司