一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統及其制備方法

專利名稱：一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種給藥系統，尤其是涉及一種呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統。本發明同時還涉及上述呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法。
背景技術：
RNA干擾(interfering RNAs, RNAi)是基因治療研究最具應用前景的一個領域。 就生物普遍規律而言，RNAi可使任何一種基因沉默，同時，由于RNAi介導基因沉默的高特異、高效和簡易性，在一些由病原體入侵如病毒感染或基因突變引起的疾病治療方面具有顯見的臨床應用前景。已有研究表明，用SARS冠狀病毒某些結構蛋白基因的siRNA，可抑制感染SARS冠狀病毒恒河猴肺內的病毒復制。另外，利用siRNA特異地抑制癌基因、癌相關基因或突變基因的過度表達，使這些基因保持在靜寂或休眠狀態，有望達到抗腫瘤作用。RNA 干擾也能應用于氣道炎癥性疾病的治療，Shao等研究表明，用siRNA特異性抑制人氣道上皮胞1-!1292中的16 (1可以導致GFR表達的降低并減少氣道上皮黏液的分泌(ShaoMX， NakanagaT,NadelJA. Cigarette smoke induces MUC5ACmucin overproduction via tumor necrosis factor-α -converting enzyme in human airwayepithelial(NCI-H292)cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004, 287 (2) :L420_L427)。然而，siRNA 在體內易被核酸酶降解，因而它的穩定性差、且半衰期短、缺乏靶向性，需要結合載體系統進行基因的遞送。目前常用的基因遞送方法主要分為兩類，即病毒載體和非病毒載體導入技術，其中，病毒載體轉染效率高，是目前體內基因治療的主要工具。然而，盡管病毒載體具有很高的轉染效率，但其存在免疫原性和潛在致瘤性等安全性隱患。非病毒載體主要有脂質體、陽離子高聚物等，但非病毒基因載體因缺少病毒載體天然的基因遞送機制，轉染效率低下，極大地限制了其實際應用。因此，如何將siRNA安全有效運送到病變靶器官，進入靶細胞充分有效發揮RNA干擾作用，成為目前臨床應用siRNA治療的瓶頸問題。殼聚糖是近年來發展起來的一種新型非病毒基因轉運載體，也是唯一的一種天然陽離子多糖。它具有良好的生物相容性，生物可降解性，安全性好。然而，同其他非病毒載體一樣，殼聚糖自身跨越細胞膜屏障能力較低，需要對其進行修飾，以提高其跨膜能力。細胞穿膜肽(cell penetrating ρ印tide，CPP)是一類能攜帶大分子物質進入細胞，具有穿膜能力的短肽。Wender等發現，精氨酸在細胞穿膜肽的跨膜中起到關鍵的作用，其特征基團胍基是促進跨膜的核心因素(Wender P. A, Mitchell D. J, Pattabiraman K, et al. Thedesign, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake peptoid moleculartransporters, Proc.Natl. Acad. Sci. USA,2000,97 13000-13008)。 * 發明發明人前期已成功合成了胍基化殼聚糖，且證實該修飾方法能明顯提高天然殼聚糖體外細胞轉染DNA核酸的能力。胍基修飾簡單無毒，經胍基修飾后的殼聚糖生理PH環境下能充分溶解。為了進一步提高胍基化殼聚糖向細胞轉運核酸物質的能力，依據配體與受體相結合的原理，發明人的中國專利申請CN 101781373A中公開了一種沙丁胺醇接枝胍基化殼聚糖及其制備方法，是將臨床藥用β 2腎上腺受體激動劑沙丁胺醇(氣道解痙抗炎制劑)接枝到胍基化殼聚糖分子上構成沙丁胺醇接枝胍基化殼聚糖，并通過體外細胞研究證實該載體能夠進一步提高細胞的基因轉染效率。但是由于人體或動物體內環境復雜，因此僅在體外直接轉染培養的細胞證明該載體有較好的基因轉染效率，并不意味著體內應用的可行性。載體粒徑是基因微粒分散遞送系統的重要參數，它的大小與物理特點除了會影響載體微粒在靶細胞表面的吸附和攝取以外，還會影響在細胞內復合物從內涵體成功逃逸、 核酸物質的釋放等過程。而納米粒徑的均勻度是納米載體的另一個重要參數，粒徑的分布寬，表示在任一局部范圍內分布的納米粒均較少，所以無論最適粒徑是多少，即使該納米載體的最適轉染粒徑接近平均粒徑，但因在平均粒徑附近的納米粒的比例小，大部分顆粒的粒徑遠離平均粒徑，或者太大，或者太少，所以能有效對基因進行轉染的載體比例并不多。 從圖9的a中可見，先前的沙丁胺醇胍基化殼聚糖(Ml-胍基化殼聚糖)的粒徑大小分布不均勻，且Ml-胍基化殼聚糖與核酸物質復合后的粒徑較小，約在20 60nm范圍之間，粒徑分布離散度大，說明有利于細胞轉染的最適合粒徑Ml-胍基化殼聚糖納米粒的比例少(圖 10)。而如何實現殼聚糖納米載體體內運送核酸物質導入目標器官組織和細胞，是siRNA介導基因沉默臨床應用需要解決的關鍵科學問題。采用吸入給藥方式是治療呼吸道疾病的臨床有效的給藥方式，可以實現靶向目標器官。但吸入藥氣霧的顆粒大小只有在4 6um之間，才能使藥物霧滴在肺內沉積從而發揮藥效。相對于臨床其它吸入方式，超聲霧化吸入更加簡單易行。該吸入方式通過采納一個超聲霧化裝置將水溶性藥液在高頻振蕩的作用下，形成由4 6um超微粒子構成的氣霧吸入治療。但問題是高頻振蕩會對核酸物質的結構造成破壞，因此在臨床難以采納吸入治療模式進行呼吸系統疾病小分子RNA干擾治療。

發明內容
本發明的第一個目的在于通過提供一種呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統，該給藥系統可用于運送干擾目標致病基因的siRNA，以發揮RNA干擾作用，抑制致病基因復制，能夠在活體內運送小分子RNA(SiRNA)靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因為目的發揮相應藥效作用的非病毒運送系統。本發明的第二個目的是提供上述呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統的制備方法。本發明的第一個目的是通過以下技術方案來實現的一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統，該給藥系統以經超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖為載體材料，包裹干擾目標致病基因的siRNA制成。沙丁胺醇胍基化殼聚糖(Ml-胍基化殼聚糖)中具有β 2腎上腺能受體配體沙丁胺醇，即具有了歸巢裝置，對于呼吸道上皮細胞，平滑肌細胞及肥大細胞等具有靶向效果。 而在超聲霧化處理前，Sal-胍基化殼聚糖的粒徑較小，粒徑分布離散度大，粒徑大小及分布都很不理想，且最適粒徑Ml-胍基化殼聚糖納米粒的比例少，致使人體內靶器官的細胞的攝取量少，難以發揮有效的RNA干擾作用。經過本發明人的研究發現無論是單獨的Ml-胍基化殼聚糖納米粒還是Ml-胍基化殼聚糖與核酸物質復合納米粒，經過超聲霧化處理后，其粒徑都會出現相應的增大。經超聲霧化物理修飾后的Ml-胍基化殼聚糖納米粒的粒徑較超聲霧化前大，粒徑分布離散度小，且最適粒徑Ml-胍基化殼聚糖納米粒的比例多。經實驗證明，SiRNA與經超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖納米載體復合，形成在體內可被靶器官細胞高效攝取的結構形式(具體講就是能在體內特異地被肺內氣道上皮細胞攝取的結構形式)，繼而能從內涵體充分釋放出來，發揮RNA干擾治療作用。可見，經超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖與核酸物質構成的復合霧化納米能進一步提高細胞對核酸物質的攝取與基因轉染效率。本發明的所述的呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統的粒徑在65 85nm范圍之間。本發明所述的干擾目標致病基因的SiRNA即特異性干擾入侵病毒基因、或干擾導致炎癥或腫瘤病的基因的SiRNAjB SARS冠狀病毒某些結構蛋白基因的siRNA、流感病毒A 型保守區域編碼基因的siRNA、肝炎病毒的siRNA，以及腫瘤相關基因的siRNA或突變基因的siRNA等。干擾目標致病基因的siRNA可根據具體目標致病基因的結構按常規方法設計篩選制備即可。本發明中的所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA之間的質量比為1 5 1。本發明的第二個目的可以通過以下技術措施來實現的一種上述呼吸道歸巢 siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其包括以下步驟(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液， 然后加入干擾目標致病基因的siRNA混合復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液；(II)將所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液置于超聲霧化裝置中，進行霧化成霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA復合霧化納米粒，即本發明的給藥系統。當所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液接觸到超聲霧化裝置的霧化片時，可瞬間霧化成霧滴，即所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液的超聲霧化處理在瞬間即完成，以避免長時間的高頻振蕩破壞沙丁胺醇胍基化殼聚糖的結構。本發明所述步驟(I)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的 siRNA之間的質量比為1 5 1。所述的步驟(II)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。作為本發明的另一種可行的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其具體操作是(1)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液， 然后進行超聲霧化處理，收集超聲霧化所得的霧滴；(2)在步驟(1)中收集的霧滴中加入干擾目標致病基因的siRNA進行復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA復合霧化納米粒，即得到本發明的給藥系統。所述步驟(1)中沙丁胺醇胍基化殼聚糖溶液的超聲霧化處理采用超聲霧化裝置，當沙丁胺醇胍基化殼聚糖溶液接觸到超聲霧化裝置的霧化片時，可瞬間霧化成霧滴，即所述沙丁胺醇胍基化殼聚糖的超聲霧化處理在瞬間即完成，以避免長時間的高頻振蕩破壞沙丁胺醇胍基化殼聚糖的結構。本發明所述步驟(1)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的 siRNA之間的質量比為1 5 1。所述的步驟(1)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。以下結合試驗進行闡述本發明與現有技術相比的有益效果(1)本發明通過對沙丁胺醇胍基化殼聚糖進行超聲霧化處理，再與核酸物質構成的復合霧化納米給藥系統，能進一步提高細胞對核酸物質的攝取與基因轉染效率。將沙丁胺醇胍基化修飾的殼聚糖納米按比例與siRNA復合，利用熒光染料Y0Y01 標記核酸，體外和體內實驗均發現沙丁胺醇胍基化修飾能增加細胞對殼聚糖核酸復合物的內吞(圖2，圖3)，沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米按比例與靶向綠色熒光蛋白(GFP)的 siRNA復合后，經與培養細胞共孵育，能夠迅速被細胞(一個穩定表達綠色熒光蛋白的細胞株)吞飲，并隨即從內涵體釋放，有效介導該siRNA特異性的干擾作用，降低細胞GFP的表達水平(圖4，圖5)。同時，該干擾作用也在動物體內得到驗證(圖6)。Beta腎上腺素能受體，是G-蛋白質偶合受體(GPCRs)超級家族之一，具有7個跨膜區，分為β ，β2和β 3三種亞型，其中β 2受體廣泛分布于平滑肌和肺組織內。GPCRs 和相應的配體結合以后，能誘發網格蛋白所介導的配體/受體復合物的內化作用，擁有相應受體的細胞會增加對接枝有β 2受體配體的載體特異性攝取。由于293細胞能表達一定水平的β 2受體，而16ΗΒΕ細胞不表達，通過對這兩種細胞進行轉染實驗比較證實在擁有 β 2受體的293細胞較之不表達β 2受體的16ΗΒΕ細胞，Sal-胍基化殼聚糖納米載體的基因轉染效率要明顯高于單純胍基化殼聚糖載體(圖7)。沙丁胺醇胍基化殼聚糖與siRNA復合霧化納米粒經氣道內給藥以后，可見降低GFP轉基因小鼠肺內結構細胞GFP的表達水平最為有效(圖8)。因此從體內外實驗可以證明，沙丁胺醇胍基化殼聚糖核酸納米粒具有體內靶向呼吸道上皮運送核酸物質，發揮干擾siRNA的治療能力。本發明通過采用超聲霧化對沙丁胺醇胍基化殼聚糖進行物理修飾后，使得沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米粒和沙丁胺醇胍基化殼聚糖與核酸復合納米粒的粒徑較超聲霧化處理前大，而且納米粒的粒徑分布離散度明顯減小，最適粒徑納米粒的比例增多，均勻性顯著增加(參見圖9和圖10)，證明超聲霧化效應能夠進一步優化沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米載體。而經超聲霧化處理后沙丁胺醇胍基化殼聚糖的胞內轉運siRNA的能力優于未經超聲霧化處理的沙丁胺醇胍基化殼聚糖(參見圖12和圖1 ，以上實驗結果說明本發明的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的結構形式為在體內可被靶器官細胞高效攝取的結構形式，并能從內涵體充分釋放出來發揮RNA干擾治療作用。(2)本發明的超聲霧化作用主要針對載體本身，與超聲霧化處理及復合轉染細胞的順序關聯不大，即先復合再超聲霧化處理同樣能提高細胞對核酸物質的攝取與基因轉染效率。無論沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米先經超聲霧化處理再與核酸物質形成復合霧化納米粒，還是沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米和核酸物質復合后再進行超聲霧化，沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米的包裹均能有效保護核酸物質免受機械剪切力的降解破壞作用(圖11)， 沙丁胺醇胍基化殼聚糖只要經超聲霧化處理，就能明顯增強對攜載核酸物質的能力。 且其經過超聲霧化的沙丁胺醇胍基化殼聚糖較之未經修飾的殼聚糖等載體的運送與轉染基因的效率更高(圖12，13)。因而，前述的兩種制備順序均能提高細胞對核酸物質的攝取與基因轉染效率。(3)本發明采用先將沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的SiRNA復合再進行超聲霧化處理的方式，更有利于簡化給藥系統的制備過程，更加適于臨床給藥操作，而且效果會更好。經實驗證明，無論是先對沙丁胺醇胍基化殼聚糖進行超聲霧化處理再與干擾目標致病基因的siRNA進行復合，還是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA復合后再進行超聲霧化處理，所得的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA復合霧化納米都有較高的細胞轉染效率，說明了超聲霧化的作用只對沙丁胺醇胍基化殼聚糖發生作用，并沒有破壞siRNA的結構。但是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA先混合復合再進行超聲霧化處理，在進行超聲霧化處理的同時霧化成可臨床使用的霧滴，使得本發明的給藥系統的制備過程更加簡單，更加適于臨床給藥操作，而且效果更好。


圖1是熒光染料Yoyol與載體結合情況。A :yoyol ；B :yoyol + Sal- M 基化殼聚 H ；C :yoyol + siRNA ；D yoyol+siRNA+lipofectamine ；E :yoyol+siRNA+殼聚糖；F :yoyol+siRNA+Sal-胍基化殼聚糖。單獨Yoyol㈧和Yoyol載體混合物⑶在未結合核酸的情況下，均不顯示熒光。當和核酸物質siRNA結合以后則發出強綠色熒光(C、D、E、F)圖2是各載體胞內轉運核酸的情況。A =Lipofectamine ；B 殼聚糖；C =Sal-胍基化殼聚糖。圖2A顯示大部分細胞內都可見綠色熒光，圖2B只見少量綠色熒光陽性細胞，圖2C顯示在Sal-胍基化殼聚糖載體組， 綠色熒光陽性細胞的比例低于對照組，但單個細胞內熒光強度高于對照組。圖3是各種載體在小鼠肺部當中轉運核酸的情況。A，B, C =Lipofectamine ；D, E，F 殼聚糖；G H，I =Sal-胍基化殼聚糖A，D，G :yoyol 示蹤；B, E，H =DAPI 染色；C, F，I 綠色熒光(yoyol)與藍色熒光 (DAPI)復合。圖A和圖B顯示，小鼠肺部基本上未觀察到綠色熒光陽性的肺氣道細胞。在 Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復合物組小鼠肺組織，其肺泡和氣道上皮處均可見綠色熒光陽性的細胞，如圖C。圖4是熒光顯微鏡顯示各種載體攜載小分子RNA在細胞內干擾GFP表達的情況。A =Sal-胍基化殼聚糖與negative-control siRNA的復合物；B 天然殼聚糖與 GFPsiRNA的復合物；C =Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復合物。圖B顯示細胞的平均熒光強度稍弱于圖A中陰性對照組中的細胞。Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復合物納米能夠顯著減弱被轉染細胞的平均熒光強度，圖C所示其細胞熒光強度明顯低于圖A陰性對照組細胞。注該細胞穩定表達GFP。圖5是流式細胞儀定量分析各種載體攜載SiRNA在細胞內干擾GFP表達的情況。1 =Sal-胍基化殼聚糖與negative-control siRNA復合納米粒；2 天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒(質量比天然殼聚糖GFP siRNA = 5:1);3 天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒(質量比天然殼聚糖GFP siRNA = 3:1);4 天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒(質量比天然殼聚糖GFP siRNA = 1:1);5 jal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒(質量比Sal-胍基化殼聚糖GFPsiRNA = 5:1);6 jal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒(質量比Sal-胍基化殼聚糖GFPsiRNA = 3:1);7 jal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒(質量比Sal-胍基化殼聚糖GFPsiRNA =1:1);注該細胞穩定表達GFP ；*P < 0. 05。圖6是熒光顯微鏡顯示Ml-胍基化殼聚糖在小鼠體內介導RNA干擾的情況。Neg 胍基化殼聚糖與negative-control siRNA復合納米粒；CS 天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒；Sal-Gua-CS =Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒。其中，Neg和CS組小鼠肺組織切片可見氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞均強表達綠色熒光蛋白。與之相比，給予Ml-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒處理的小鼠肺組織，GFP表達水平顯著下降。注該小鼠為GFP轉基因小鼠。圖7是兩種載體分別在HEK293細胞和16HBE細胞中的效率的條形圖。A :HEK293細胞，流式細胞儀檢測；B :16HBE細胞，顯微鏡下計數平均每個視野當中表達綠色熒光蛋白的細胞數量。*v. s. Chitosan P < 0. 01圖8是熒光顯微鏡顯示Ml-胍基化殼聚糖在小鼠體內靶向介導RNA干擾的情況。CS 天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒；Gua-CS 胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒；Sal-Gua-CS =Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒。CS組小鼠肺組織切片可見氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞均強表達綠色熒光蛋白。 與之相比，給予胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復合納米粒處理的小鼠肺組織，GFP表達水平有所下降，而給予Ml-胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復合納米粒處理的小鼠肺組織，GFP表達水平下降更為明顯。圖9是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復合霧化納米給藥系統超聲霧化前和超聲霧化后透視電鏡圖；a =Sal-胍基化殼聚糖；b =Sal-胍基化殼聚糖與DNA復合納米粒；c 超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖；d 超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合霧化納米粒。圖10是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復合霧化納米給藥系統超聲霧化處理前和超聲霧化處理后納米粒徑的分布圖。chi/DNA 超聲霧化處理前的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復合納米粒；A (chi/DNA)超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復合納米粒；超聲霧化處理前，Sal-胍基化殼聚糖及Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合納米粒的粒徑較小，分布范圍較寬；超聲霧化處理后其粒徑有所增大，粒徑分布范圍變窄，均勻度較前明顯改善。*P < 0. 01 ；其中的小方框代表粒徑分布。圖11是裸DNA以及DNA按不同形式與Ml-胍基化殼聚糖載體復合后的電泳圖；Lane 1和Lane 2 裸DNA ；Lane 3 =Sal-胍基化殼聚糖與DNA的復合物；Lane 4 超聲霧化后的裸DNA ；Lane 5 裸DNA超聲霧化后與Ml-胍基化殼聚糖的復合物；Lane 6 單獨超聲霧化后的裸DNA與單獨超聲霧化后的Ml-胍基化殼聚糖的復合物；Lane 7 =DNA與Ml-胍基化殼聚糖的復合物經超聲霧化的產物；Lane4, Lane5和Lane6均顯示裸DNA受超聲霧化明顯的機械剪切作用而被降解， 產物成帶狀分布；Lane7顯示載體包裹DNA后再進行超聲霧化及霧化，復合物完整地滯留在加樣孔中。圖12是超聲霧化對各載體復合物轉染效率的影響(HEK293細胞)。1. Sal-胍基化殼聚糖與DNA (pEGFP_N2質粒)復合納米粒組；2. Sal-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA的復合納米粒組；3.超聲霧化后Ml-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA的復合納米粒組 (Sal-胍基化殼聚糖和裸DNA分別超聲霧化后再復合)；4.超聲霧化Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合霧化納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖先進行超聲霧化處理，再與DNA復合)；5. Ml-胍基化殼聚糖與DNA的復合霧化納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合后再超聲霧化處理收集的霧滴)。*v. s group 1，P < 0· 01.圖13是Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合物超聲霧化前后轉染效率的變化(16HBE 細胞)；Gua =Sal-胍基化殼聚糖與DNA (pEGFP_N2質粒)復合納米粒組；Aerosol =Sal-胍基化殼聚糖與DNA (pEGFP_N2質粒)復合霧化納米粒組；*Ρ<0·01。
具體實施例方式以下通過實施例進行說明本發明提供的呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統的制備與應用，實施例僅用于說明本發明的目的，并不限制本發明的保護范圍。實驗例一 Sal_胍基化殼聚糖納米體內轉運核酸的能力主要實驗材料天然殼聚糖納米粒美國Sigma公司Sal-胍基化殼聚糖按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應用》(申請號=200910245193. 6)中所述方法制備
MEM培養基美國Gibico公司胎牛血清杭州四季青公司質粒抽提試劑盒美國Promega公司Lipofectamin 2000 (核酸轉染試劑)美國 hvitrogen 公司siRNA 美國 AMBION 公司Yoyol (熒光染料，用于標記核酸物質)美國hvitrogen公司實驗方法1. Ml-胍基化殼聚糖納米向細胞內轉運核酸1. 1取Iug的siRNA和^yol熒光染料避光復合，2小時以后分別與天然殼聚糖、 Ml-胍基化殼聚糖和LipOfectamine2000(對照品)按1 3 (siRNA 載體)的質量比進行復合，所述的復合是指天然殼聚糖、Ml-胍基化殼聚糖和LipofectamindOOO等載體包裹siRNA的過程，而天然殼聚糖和Ml-胍基化殼聚糖都帶正電荷，而siRNA帶負電荷，混合后天然殼聚糖和Ml-胍基化殼聚糖會對siRNA進行包裹。半小時以后在激光共聚焦顯微鏡觀察各復合物^yol的熒光強度。1. 2取HEK293細胞以2X IO5Cell/孔濃度接種于M孔板，常規培養于37°C、5% CO2孵箱中，待細胞密度達到60 70%時分別用上述制備的各種載體與核酸物質的復合物進行轉染(siRNAlug/孔)。M小時以后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光指示劑^yol在細胞內分布的情況。2. Sal-胍基化殼聚糖納米在體內轉運核酸2. 1取siRNA和^yol熒光染料避光復合，2小時以后分別與天然殼聚糖、Sal-胍基化殼聚糖和Lipofectamine 2000(對照品)按1 3 (siRNA 載體)的質量比進行復合半小時。經氣管將各種載體/核酸物質復合物注射入小鼠肺部(siRNA 2ug/每只小鼠)， 6小時以后處死小鼠，分離肺臟冷凍包埋進行組織冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光染料yoyol在肺內細胞的分布情況。實驗結果1.單獨的^yolJoyol與載體混合物在未結合核酸物質siRNA的情況下，基本看不到熒光。當^yol和核酸物質siRNA結合以后，馬上發出強的綠色熒光，但大部分呈絲絮樣分布。加入載體以后，大部分熒光物質呈顆粒狀分布，小部分聚集成團，參見圖1。激光共聚焦顯微鏡觀察三種載體向細胞導入siRNA的能力，顯示在LipOfectamin2000組(對照品組脂質體)，幾乎所有細胞內都可見綠色熒光(見圖2A)，在Ml-胍基化殼聚糖載體組， 綠色熒光陽性細胞的比例雖然低于對照脂質體組，但單個細胞內熒光強度高于對照組(見圖2C)，提示單個細胞攝取的siRNA量較對照組增多。在天然殼聚糖載體組只可見少量綠色熒光陽性細胞(見圖2B)。2.在各實驗組小鼠肺組織，激光共聚焦顯微鏡顯示給予Lipofectamin 2000與 siRNA復合納米粒的小鼠肺基本上未觀察到綠色熒光陽性的肺氣道細胞，提示轉染離體細胞的核酸轉染試劑Lipofectamin脂質體并不能有效地把siRNA在體內轉運入小鼠肺部細胞(見圖3A、D和G)。未經過修飾的天然殼聚糖納米載體同樣不能有效在體內轉運核酸物質siRNA(見圖3B、E和H)。相反，在Ml-胍基化殼聚糖與siRNA復合物組的小鼠肺組織，其肺泡和氣道上皮處均可見綠色熒光陽性的細胞(見圖3C、F和I)。表明經氣管給予Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復合納米粒能在體內被小鼠肺的細胞有效攝取。結論Sal_胍基化殼聚糖與siRNA復合納米粒能有效將siRNA轉運入體外培養的細胞，并能在活體狀態下經氣道在體內轉運siRNA至肺內細胞。

實驗例二 Sal-胍基化殼聚糖與SiRNA復合納米粒在活體內發揮RNA干擾作用主要實驗材料Sal-胍基化殼聚糖按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應用》(申請號200910245193. 6)中所述方法制備天然殼聚糖納米粒美國Sigma公司綠色熒光蛋白(GFP)siRNA 美國AMBION公司Negative Control siRNA 美國 AMBION 公司GFP穩定表達HEK293細胞株本實驗室篩選和培養EGFP轉基因小鼠賽業生物技術有限公司。EGFP轉基因小鼠為C57BL/6背景，表達方式為全身表達。EGFP基因構建在pCAGGS載體上，該載體具有雞β -actin啟動子、CMV 增強子。超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer)美國 Aerogen 公司微量霧化器美國Penn-Century公司實驗方法l.Sal-胍基化殼聚糖介導RNA干擾的作用(體外培養的細胞)Sal-胍基化殼聚糖按與Negative Control siRNA 3 1的質量比復合半小時；天然殼聚糖與GFP siRNA按5 1,3 1和1 1的質量比復合半小時；Sal-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA按5 1，3 1和1 1的質量比復合半小時。接種HEK293細胞(穩定表達 GFP))以2X105cell/孔濃度于24孔板，將Sal-胍基化殼聚糖與Negative Control siRNA 復合納米粒、天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒以及Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒分別添加至接種細胞的孔內(lug的siRNA/孔)。24小時以后激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細胞GFP表達的改變，同時用流式細胞儀定量檢測各組細胞GFP的平均熒光強度。2. Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復合納米粒在小鼠體內介導RNA干擾的作用Sal-胍基化殼聚糖與Negative Control siRNA按3 1的質量比復合半小時，得到Sal-胍基化殼聚糖與Negative Control siRNA復合納米粒；天然殼聚糖與GFP siRNA 按3 1的質量比復合半小時，得到天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒；Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA按3 1的質量比復合半小時，得到Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒；再應用超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer)分別對三種復合納米粒進行超聲霧化，然后用IOml玻璃離心管連接霧化頭的霧化液出口，收集霧滴(形成的氣霧滴直徑分布約4 6微米，適合臨床霧化治療)。實驗采納穩定表達GFP的轉基因小鼠(體內各臟器組織均表達綠色熒光蛋白)，利用Perm-Century公司的微量霧化裝置將收集的各種復合物納米通過氣道內霧化的方式分別給予GFP轉基因小鼠，每天一次，每次IOOul (含2ug的 siRNA)，連續3天，第4天處死小鼠，冷凍包埋進行冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察各處理因素對小鼠肺組織GFP表達的影響。結果
1.激光共聚焦顯微鏡與流式細胞儀檢測示天然殼聚糖與GFPsiRNA復合納米粒轉染體外培養的穩定表達GFP的HEK293細胞，可以輕度下調細胞的平均熒光強度；相比之下，超聲霧化后的Ml-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA復合納米粒能夠顯著減弱被轉染細胞的平均熒光強度，表明超聲霧化后的Ml-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒能將GFP siRNA有效轉運帶入細胞內，并發揮RNA干擾的作用，降低細胞內GFP的表達水平。(見圖 4和圖5)。2.激光共聚焦顯微鏡觀察肺組織切片顯示給予Ml-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA 復合納米粒的小鼠肺組織GFP的表達水平較之陰性對照或天然殼聚糖與GFPsiRNA復合納米粒處理顯著下降(見圖6)。結論經超聲霧化處理的Ml-胍基化殼聚糖與siRNA復合納米粒能在活體狀態下經氣道在肺內發揮有效的RNA干擾作用。實驗例三Aal-胍基化殼聚糖與核酸的復合納米粒活體狀態下靶向性轉運核酸進行RNA干擾的能力材料及方法主要實驗材料胍基化殼聚糖按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應用》(中國專利申請，申請號=200910245193. 6)中所述方法制備。沙丁胺醇(Sal)美國Sigma公司。Sal-胍基化殼聚糖納米載體按照《沙丁肢醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應用》(中國專利申請，申請號=200910245193. 6)中所述方法制備。16HBE細胞(人支氣管上皮細胞株)英國南安普頓(Southampton)大學Meven. Holgate教授惠贈。pEGFP-N2 質粒美國 Clontech 公司。綠色熒光蛋白(GFP)siRNA 美國AMBION公司。GFP轉基因小鼠同實驗例二。超聲霧化頭(Aeroneb LabNebulizer)美國 Aerogen 公司。微量霧化器美國Penn-Century公司。方法1、由于HEK293細胞能夠表達β 2受體，而16ΗΒΕ細胞不表達β 2受體，首先在體外培養細胞比較了未接枝β 2受體激動劑沙丁胺醇的胍基化殼聚糖與接枝沙丁胺醇的胍基化殼聚糖(Ml-胍基化殼聚糖)在向上述兩種細胞轉染核酸的不同能力。取HEK293細胞以2 X IO5Cell/孔濃度接種于M孔板，常規培養于37°C、5% CO2孵箱中，待細胞密度達到60 % -70 %的時候進行轉染，實驗分兩組，單純胍基化殼聚糖轉染組和Ml-胍基化殼聚糖轉染組，分別以5 1的質量比與PEGFP-N2質粒復合后進行轉染(lug 的質粒/孔)。24小時換液一次，轉染后72小時，流式細胞儀計算并比較胍基化殼聚糖與 PEGFP-N2質粒復合納米粒和Ml-胍基化殼聚糖與PEGFP-N2質粒復合納米粒在HEK293細胞被成功轉染PEGFP-N2質粒的陽性細胞比例。與此同時，比較了熒光顯微鏡下胍基化殼聚糖與Ml-胍基化殼聚糖在不表達β 2受體的16ΗΒΕ細胞轉染pEGFP-N2效率的不同(按照表達綠色熒光蛋白細胞數/平均每個視野細胞數測算)。
2、驗證Sal-胍基化殼聚糖與pEGFP_N2質粒復合納米粒在活體狀態下通過歸巢裝置靶向氣道細胞對siRNA干擾能力的影響。天然殼聚糖、胍基化殼聚糖和Sal-胍基化殼聚糖分別與GFP siRNA按3 1的質量比復合半小時，再應用超聲霧化頭(Aer0neb Lab Nebulizer)進行超聲霧化，然后用 IOml玻璃離心管連接霧化頭的霧化液出口，收集霧滴(形成的氣霧滴直徑分布約4 6微米，適合臨床霧化治療)。實驗采納穩定表達GFP的轉基因小鼠(體內各臟器組織均表達綠色熒光蛋白)，利用Perm-Century公司的微量霧化裝置將收集的三種復合物納米通過氣道內霧化的方式分別給予GFP轉基因小鼠，每天一次，每次IOOul (含2ug的siRNA)，連續3 天，第4天處死小鼠，冷凍包埋進行冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察各處理因素對小鼠肺組織GFP表達的影響。
結果1、熒光顯微鏡與流式細胞儀檢測表明在離體培養表達β 2受體的ΗΕΚ293細胞， Sal-胍基化殼聚糖納米載體轉染PEGFP-N2質粒的效率顯著高于未接枝Sal的胍基化殼聚糖納米載體，表達綠色熒光蛋白的細胞比例顯著增加(見圖7Α)。而在不表達β 2受體的16ΗΒΕ細胞，有無Sal-歸巢裝置對載體轉染質粒的效率沒有明顯影響。(見圖7Β)。這一結果可以證明胍基化殼聚糖接枝Sal的歸巢修飾具有靶向性，可以提高具有β 2受體的 ΗΕΚ293細胞對核酸的攝取能力。2、激光共聚焦顯微鏡顯示活體給予天然殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒、胍基化殼聚糖與GFP siRNA復合納米粒和Sal-胍基化殼聚糖GFP siRNA的復合納米粒后，從各組小鼠肺組織切片可以看到較之天然殼聚糖與GFPsiRN A復合納米粒組或胍基化殼聚糖與GFPsiRNA復合納米粒組，給予Sal-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA復合納米粒的小鼠肺組織熒光表達下降的程度最明顯，表明siRNA干擾的效率最好。(見圖8)。結論經過超聲霧化處理的Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復合納米粒在活體狀態下經鼻給予小鼠，具有靶向氣道細胞轉運小分子RNA，實現并提高了 RNA干擾的能力。實驗例四呼吸道歸巢核酸霧化納米粒的制備及其對核酸物質的轉運效應材料及方法主要材料與裝置Sal-胍基化殼聚糖載體按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應用》 (中國專利申請，申請號=200910245193. 6)中所述方法制備pEGFP-N2 質粒美國 Clontech 公司超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer)美國 Aerogen 公司實驗方法利用了頻率為128KHz士 10%的超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer,由原裝交流電源驅動改接成便攜干電池驅動)對復合物納米進行超聲霧化。先將Sal-胍基化殼聚糖和pEGFP-N2質粒按質量比為5 1的比例復合，再應用Aeroneb霧化頭在128KHz 士 10% 的頻率下進行超聲霧化，然后用IOml玻璃離心管連接霧化頭的霧化液出口，收集霧滴(形成的氣霧滴直徑分布約4 6微米，適合臨床霧化治療)，得到霧化納米粒。1、將收集的霧化納米粒制備電鏡標本進行透射電鏡觀察納米粒徑大小與分布的變化。
2、凝膠電泳進行DNA-凝膠阻滯實驗觀察霧化納米中DNA的完整性以及殼聚糖納米粒對核酸的包裹作用。電泳條件瓊脂糖凝膠60V電泳半小時，分為7個泳道，Lanel 和Lane2為裸DNA，Lane3為Ml-胍基化殼聚糖與DNA的復合物，Lane4為單獨霧化后的裸 DNA, Lane5為單獨霧化后的裸DNA與Ml-胍基化殼聚糖的復合物，Lane6為單獨霧化后的裸DNA與單獨霧化后的Ml-胍基化殼聚糖的復合物，Lane7為Ml-胍基化殼聚糖與裸DNA 的復合物超聲霧化的產物。3、用收集的復合物霧化納米粒進行細胞轉染實驗觀察其包裹的核酸物質，即 PEGFP-N2質粒的轉染效率。HEK293細胞以8X IO5/孔濃度接種于6孔板，常規培養于37°C,5% CO2孵箱，待細胞密度達到60-70 %時進行轉染。當細胞密度達到60 % -70 %的時候進行轉染，轉染 HEK293細胞的實驗分五個組1. Ml-胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP-N2質粒)復合納米粒組； 2. Sal-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA復合納米粒組；3.超聲霧化后Ml-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA的復合納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖和裸DNA分別超聲霧化后再復合)；4.超聲霧化Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖先進行超聲霧化處理，再與DNA復合)；5. Sal-胍基化殼聚糖與DNA的復合霧化納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合后再超聲霧化處理收集的霧滴)。收集各組轉染的細胞，流式細胞儀計算綠色熒光蛋白表達陽性細胞比例。轉染16HBE的實驗分兩組，分別為Ml-胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP-N2質粒)復合納米粒組和胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP_N2質粒)復合霧化納米粒組。熒光顯微鏡下計算平均每個視野中表達綠色熒光蛋白的16HBE細胞的數量。結果1.透射電鏡示超聲霧化處理后，載體Ml-胍基化殼聚糖納米粒徑和Ml-胍基化殼聚糖與DNA復合納米粒的粒徑較前增大，約在65 85nm范圍之間，粒徑分布范圍變窄，而且Ml-胍基化殼聚糖納米粒的粒徑分布離散度明顯減小，最適粒徑納米粒的比例增多，均勻性顯著增加(參見圖9和圖10)，證明超聲霧化效應能夠進一步優化Ml-胍基化殼聚糖納米載體。2.凝膠阻滯實驗顯示超聲霧化對裸DNA產生明顯的機械剪切作用，裸DNA被降解(圖11泳道4、5、6)，裸DNA霧化產物經電泳以后在泳道成帶狀分布。載體Ml-胍基化殼聚糖包裹DNA后再進行霧化，電泳顯示復合物完整地滯留在加樣孔中(圖11泳道7)，提示Ml-胍基化殼聚糖納米載體能有效保護DNA免受超聲霧化對核酸物質的破壞作用。3.細胞轉染實驗表明無論在HEK293細胞還是16HBE細胞，經超聲霧化處理后的 Sal-胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP-N2質粒)復合霧化納米粒的細胞轉染效率均較前顯著提高。另外，先對載體Ml-胍基化殼聚糖進行超聲霧化修飾，再與核酸物質復合，同樣可使細胞轉染效率得到相似水平的提高(見圖12和圖13)。結論Aal-胍基化殼聚糖納米載體或Ml-胍基化殼聚糖與核酸復合納米粒經一定頻率的超聲霧化進行物理修飾，顯著改善了其作為載體轉運核酸物質的性能，與此同時能夠形成臨床霧化吸入治療適宜的氣霧滴，提供了經呼吸道給予治療用核酸藥的新系統。實施例一(1)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后置于超聲霧化裝置中在128KHz頻率下進行超聲霧化成4um 6um霧滴，收集超聲霧化所得的霧滴；(2)在步驟(1)中收集的霧滴中加入干擾目標致病基因的SiRNA進行復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA之間的質量比為1 1，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的 siRNA復合霧化納米粒，即呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統。收集霧滴制成電鏡標本， 經透射電鏡觀察到所得呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的粒徑在65 85nm之間。實施例二(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后加入干擾目標致病基因的siRNA進行混合復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液，其中沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA為質量比3 1。(II)沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液置于超聲霧化裝置中在128KHz頻率下進行超聲霧化成4um 6um霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA復合霧化納米粒，即呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統。 收集霧滴制成電鏡標本，經透射電鏡觀察到所得呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的粒徑在65 85nm之間。實施例三(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后加入干擾目標致病基因的siRNA進行混合復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液，其中沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA為質量比5 1。(II)沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液置于超聲霧化裝置中在128KHz頻率下進行超聲霧化成4um 6um霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA復合霧化納米粒，即呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統。 收集霧滴制成電鏡標本，經透射電鏡觀察到所得呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的粒徑在65 85nm之間。以上實施例中的干擾目標致病基因的SiRNA是指導致炎癥或腫瘤病的病毒基因的siRNA、腫瘤基因的siRNA、腫瘤相關基因的siRNA或突變基因的siRNA等，如SARS冠狀病毒某些結構蛋白基因的siRNA、流感病毒A型保守基因的siRNA、肝炎病毒的siRNA等。以上干擾目標致病基因的siRNA根據具體目標致病基因的結構按常規方法制備即可。本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不是限制，因此凡是依據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何細微修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統，其特征在于，該給藥系統以經超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖為載體材料，包裹干擾目標致病基因的SiRNA制成。
2.根據權利要求1所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統，其特征在于，所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的粒徑在65 85nm范圍之間。
3.根據權利要求1所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統，其特征在于，所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA之間的質量比為1 5 1。
4.一種權利要求1 3任一權利要求所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后加入干擾目標致病基因的siRNA混合復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液；(II)將所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA的復合物溶液置于超聲霧化裝置中，進行霧化成霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的 siRNA復合霧化納米粒，即本發明的給藥系統。
5.根據權利要求4所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA之間的質量比為1 5 1。
6.根據權利要求5所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的步驟(II)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。
7.一種權利要求1 3任一權利要求所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟(1)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后進行超聲霧化處理，收集超聲霧化所得的霧滴；(2)在步驟(1)中收集的霧滴中加入干擾目標致病基因的siRNA進行復合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標致病基因的siRNA復合霧化納米粒，即得到本發明的給藥系統。
8.根據權利要求7所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標致病基因的siRNA之間的質量比為1 5 1。
9.根據權利要求8所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。
全文摘要
本發明公開了一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統，該給藥系統以經超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖為載體材料，包裹干擾目標致病基因的siRNA制成。本發明還公開了上述呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統的制備方法。本發明公開的給藥系統可用于運送干擾目標致病基因的siRNA，以發揮RNA干擾作用，抑制致病基因復制，能夠在活體內運送siRNA靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因為目的發揮相應藥效作用的非病毒運送系統。
文檔編號A61K47/48GK102178957SQ20111004054
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月18日 優先權日2011年2月18日
發明者劉文廣, 孫鵬, 徐軍, 羅永峰, 翟欣昀 申請人:呼吸疾病國家重點實驗室, 天津大學, 廣州醫學院