專利名稱：一種布魯氏菌菌殼及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，更具體的說是涉及一種布魯氏菌菌殼及其制備方法和應用。
背景技術：
布魯氏菌(Brucella spp.)是一種胞內寄生、人獸共患病原菌，而布魯氏菌病(布病)是指由布魯氏菌引起的一種流行廣泛、傳染性強、危害極大、感染后難以根治的人獸共患傳染病。動物布病主要癥狀為發熱、流產、不育、慢性關節炎及神經損害等，能引起懷孕的雌性動物在懷孕后期流產，以及雄性動物的睪丸炎和附睪炎等；人布病主要通過皮膚粘膜、 消化道和呼吸道感染，其臨床表現為長期發熱，伴有多汗、關節痛、肝脾腫大以及生殖系統損傷等。人感染布魯氏菌后，需要長時間的抗生素治療，而且往往會留下較嚴重的后遺癥。感染的家畜是人布病的主要傳染源，人主要通過接觸患病的牲畜及其產品或其污染物而感染布病。布病不僅嚴重危害著人類和動物健康，同時影響畜牧業、旅游業、國際貿易及經濟發展。該病在世界各地都有廣泛流行，每年因此造成的經濟損失高達數十億美元。 布病在我國流行范圍廣、危害嚴重，自新中國成立后開展了全面而系統的防治，有效地控制了布病的發生和流行。然而，從上世紀90年代以來，我國人與動物布病的發病率又有明顯上升的趨勢。當前使用的布魯氏菌疫苗多為弱毒疫苗，這類疫苗雖然具有一定的免疫保護效果，但也具有非常明顯的缺點，即毒性大，返祖現象嚴重，會對人與動物機體造成傷害，甚至發病。因此研制一種具有良好保護效果和安全性的布魯氏菌疫苗具有重要的實際意義。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種布魯氏菌菌殼及其制備方法和應用，使所述布魯氏菌菌殼具有良好的安全性和保護效果，優于現有弱毒疫苗。為實現上述目的，本發明提供如下技術方案一種布魯氏菌菌殼的制備方法，包括步驟1、將如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到質粒pBV220中， 得到重組質粒PBV220: :E ；步驟2、用如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的正向引物BRUl和如SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列的反向引物BRU2擴增重組質粒pBV220::E，將擴增后的產物連接到質粒 pBBRlMCS-2中SpeI和Mil酶切位點之間，得到重組質粒pBBRlMCS_2_E ；步驟3、重組質粒PBBR1MCS-2-E轉化到布魯氏菌菌株中得到重組菌株，將重組菌株在25-30°C進行繁殖培養至其OD6tltl值為1. 0后迅速升溫至37-45°C進行誘導培養至其 OD600值穩定，然后離心收集菌體，洗滌后用高滲溶液凍融即得。菌殼(Bacterial ghosts, BG)是一種新型細菌疫苗，通常是由PhiX174噬菌體的裂解蛋白E在細菌表面形成跨膜孔狀結構。噬菌體Η Χ174的E基因編碼一個由91個氨基酸組成的疏水性蛋白質，該蛋白可通過寡聚化起到連接細菌內、外膜的作用，從而形成一種孔狀通道，孔狀通道的直徑介于40-200nm之間，其大小因細菌個體差異而不同，主要涉及細菌自溶發生的程度、肽聚糖層上篩孔的大小情況以及裂解過程中細胞膜所發生的變化。 孔狀通道一旦形成，在細胞內高滲透壓的作用下，細菌內容物通過孔道排出，從而形成一個沒有核酸、核糖體和其他胞內成分的細菌空殼。菌殼是以非變性方法制備而成，完好地保留了細菌菌體和各種抗原結構，保持了細菌天然的外膜和天然表面抗原，外膜上有高免疫刺激性的脂多糖和肽聚糖等結構，這些細胞表面的有效成分可以被巨噬細胞或抗原遞呈細胞所識別，進而激發有效的免疫反應過程。此外，菌殼自身還具有佐劑活性，經改造后可以作為疫苗載體。因此，本發明采用合適的引物、質粒等，通過克隆、重組、轉化等生物技術手段制備布魯氏菌菌殼，由于布魯氏菌內細胞內容物已經外泄，屬于滅活疫苗，所以其安全性明顯高于現有的弱毒疫苗。其中，本發明所述布魯氏菌優選為布魯氏菌S2菌株(即豬種S2株)、布魯氏菌M5 菌株(即羊種M5株)、布魯氏菌RB51菌株(即牛種RB51株)或布魯氏菌104M菌株(即人用104M株)。在本發明所述制備方法中，質粒PBV220為市售商品質粒，其上帶有溫控調節序列ApL/pR-cI857以及確定的多克隆位點，本發明通過定向克隆將如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到溫控調節序列XpL/pR-cI857的下游，得到重組質粒 PBV220: :E,以便在后續布魯氏菌菌殼的制備過程中通過控制溫度來控制所述裂解基因E 的表達。其中，步驟1所述裂解基因E由以下方法制備用如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的正向引物LE-F和如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的反向引物LE-R從噬菌體Η Χ174中擴增得到裂解基因E。由于質粒pBV220不能在布魯氏菌中復制，故本發明用如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的正向引物BRUl和如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的反向引物BRU2擴增重組質粒 PBV220: :E中的λ pL/pR-cI857和裂解基因E的融合序列，并將擴增后的產物連接到廣宿主質粒載體pBBRlMCS-2中SpeI和Mil酶切位點之間，將重組質粒pBBRlMCS-2-E轉化到布魯氏菌菌株中，進而通過溫控讓裂解基因E在布魯氏菌中表達。質粒PBBR1MCS-2由美國路易斯安那州立大學醫學中心Kovach教授惠贈， pBBRlMCS-2圖譜參見圖1,序列見SEQ ID NO :6。為了能夠很好地收集布魯氏菌菌殼，本發明先將重組菌株在25-30°C進行繁殖培養，由于有溫控序列的存在，在30°C以下裂解基因E是不會表達的，確保布魯氏菌菌株能夠繁殖到其0D_值為0. 8-1. 2，優選為1. 0，使菌體量達到合適的程度，過高的菌體量易使之后的裂解不充分，造成大量活菌的存在，影響安全性；而過低的菌體量不容易收集到足夠的裂解后的菌殼。在繁殖培養后迅速升溫至37-45°C進行誘導培養至其0D_值穩定，溫控系統在 37°C以上就不會阻遏裂解基因E的表達，因此大量的裂解蛋白E被表達出來，對布魯氏菌菌株進行裂解，形成菌殼，在裂解過程中布魯氏菌菌株的OD6tltl值是不斷下降的，當其值穩定時即完成裂解，裂解時間因不同布魯氏菌菌株而異，一般在2天左右。
在完成裂解后，通常99. 9%以上的布魯氏菌菌株均會裂解形成菌殼，但由于現有技術的限制很難達到100%的裂解，因此為了進一步確保菌殼的安全性，本發明將菌殼，即離心收集到的菌體洗滌后用高滲溶液凍融，確保滅活殘存的活菌。在本發明所述制備方法中，步驟3所述轉化優選為電轉化，所述繁殖培養溫度為 ^°C，所述誘導培養溫度為42°C，所述高滲溶液為5%氯化鈉溶液。此外，本發明還提供一種由本發明所述制備方法制備的布魯氏菌菌殼以及所述布魯氏菌菌殼在制備預防布魯氏菌病的疫苗中的應用。本發明所述疫苗包括有效量的所述布魯氏菌菌殼和醫藥學上可接受載體。其中， 醫學上可接受載體為本領域公知的用于制備疫苗的常用載體，還可包括免疫增強劑或免疫調節劑，例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等公知的藥劑。由本發明所述制備方法制備的布魯氏菌菌殼，通過形態學觀察，具有典型的菌殼特征，有效的保留了其外膜結構，大部分的胞內物質被釋放。經BALB/c小鼠進行的安全性和免疫試驗證實，本發明所述布魯氏菌菌殼副作用小、安全性高，可誘導小鼠產生保護性抗體，與弱毒活疫苗相比較，可產生較強的免疫記憶，可保護小鼠免受強劑量布魯氏菌的攻
擊ο由以上技術方案可知，本發明采用生物技術手段將溫控調節序列XpL/pR-cI857 和裂解基因E的融合序列轉化到布魯氏菌中，制備成副作用小、安全性高、保護效果好的菌殼，對控制布魯氏菌病的流行和傳播具有重要意義，應用前景廣闊。
圖1所示為pBBRlMCS-2質粒圖譜；圖2所示為重組質粒pBBRlMCS-2-E進行Spel/&ill雙酶切驗證電泳圖，其中泳道 1和2是重組質粒pBBRlMCS-2-E進行Spel/Sall雙酶切鑒定，泳道3是λ-Hind III degest DNA分子量標準；圖3所示為實施例1重組菌株PCR鑒定電泳圖，其中泳道1為DL2000DNA分子量標準，泳道2為重組菌株擴增結果；圖4所示為實施例1布魯氏菌菌殼電鏡照片；圖5所示為實施例1布魯氏菌菌殼電鏡照片；圖6所示為布魯氏菌S2菌株電鏡照片；圖7所示為布魯氏菌S2菌株電鏡照片；圖8所示為本發明安全性試驗中BALB/c小鼠平均體重變化折線圖，其中縱坐標為體重(單位g)，橫坐標為時間(單位day)，折線1為注射布魯氏菌S2菌株弱毒活疫苗組的折線(第1組折線)，折線2為注射實施例1制備的布魯氏菌菌殼組(第2組折線)，折線3為注射生理鹽水的陰性對照組(第3組折線)；圖9所示為實施例1布魯氏菌菌殼免疫后血清IgG抗體檢測柱形圖，其中橫坐標為免疫后時間(單位周)，縱坐標為抗體滴度對數，柱形1為注射接種實施例1制備的布魯氏菌菌殼的柱形圖(第2組柱形圖)，注射布魯氏菌S2菌株弱毒活疫苗組的柱形圖(第 1組柱形圖)。
具體實施例方式本發明公開了一種布魯氏菌菌殼及其制備方法和應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述制備方法、產品已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例1 制備本發明所述布魯氏菌菌殼用如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的正向引物LE-F和如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的反向引物LE-R從噬菌體WiiX174 (購自MBI公司)中擴增得到如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的裂解基因E ；將如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到質粒pBV220(購自上海生工生物工程有限公司)中，得到重組質粒pBV220: :E ；用如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的正向引物BRUl和如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的反向引物BRU2擴增重組質粒pBV220 E，將擴增后的產物連接到質粒pBBRlMCS_2 中SpeI和Mil酶切位點之間，得到重組質粒pBBRlMCS-2-E ；重組質粒pBBRlMCS-2-E轉化到布魯氏菌S2菌株中得到重組菌株，將重組菌株在進行繁殖培養至其0D_值為1. 0后迅速升溫至42°C進行誘導培養至其OD6tltl值穩定，
然后離心收集菌體，洗滌后用5%氯化鈉凍融即得。實施例2 重組質粒pBBRlMCS-2-E的驗證將實施例1中得到的重組質粒pBBRlMCS-2-E進行Spel/&ill雙酶切驗證，結果見圖2。由圖2可知，酶切鑒定結果與預期一致，證實重組質粒pBBRlMCS-2-E構建正確。實施例3 重組菌株的驗證將實施例1中得到重組菌株進行PCR驗證，見圖3。圖3證實從重組菌株中擴增到了克隆的溫控調節序列λ pL/pR-cI857和裂解基因E的融合片段，表明重組菌株構建成功。實施例4 本發明所述布魯氏菌的裂解率統計將實施例1誘導培養前(繁殖培養完成后)和誘導培養后(裂解完成后)的菌液分別以適當倍數稀釋后，通過平板計數法測定活菌數(CFU/mL)，計算重組菌株的裂解效率。 重復三次取平均值，結果顯示裂解效率達99. 9%以上。實施例5 本發明所述布魯氏菌菌殼的電鏡觀察將實施例1制備的布魯氏菌菌殼經生理鹽水洗滌3次并重懸，固定染色后用透射電鏡進行觀察。結果見圖4和圖5，本發明所述布魯氏菌菌殼保持細菌的基本細胞形態，具有完整的細菌外膜結構，但由于細胞內容物外流而使細胞表面發生明顯皺縮，在溶菌孔道附近能觀察到流出的胞質內容物(圖5黑色陰影部分)。而正常形態的布魯氏菌S2菌株飽滿、橢圓，細胞內含有胞質內容物，見圖6和圖7。實施例6 本發明所述布魯氏菌菌殼的安全性試驗選用6-8周齡(重約18_20g)的健康雌性BALB/c小鼠30只，隨機分為3組，每組 10只。第1組腹腔注射布魯氏菌S2菌株弱毒活疫苗，劑量為IO7CFU/只小鼠；第2組腹腔注射實施例1制備的布魯氏菌菌殼，劑量為IO8CFU/只小鼠(相當于原始活菌量)；第3組
6腹腔注射等體積的生理鹽水作為陰性對照。連續14天觀察小鼠體重變化和精神狀態，最后取脾臟觀察重量變化。結果顯示小鼠平均體重變化如圖8所示。第一組小鼠表現出精神萎靡、嚴重聳毛、 體重明顯下降等生理現象，從注射后第2天開始出現死亡，至第6天共死亡5只。第2組與陰性對照組小鼠生長正常，體重變化曲線一致，無死亡現象。接種14天后，捕殺所有小鼠，稱取每組小鼠平均脾重量。結果見表1表1接種后14天各組小鼠脾臟平均重量
權利要求
1.一種布魯氏菌菌殼的制備方法，其特征在于，包括步驟1、將如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到質粒pBV220中，得到重組質粒PBV220: :E ；步驟2、用如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的正向引物BRUl和如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的反向引物BRU2擴增重組質粒pBV220 E，將擴增后的產物連接到質粒pBBRlMCS_2 中SpeI和Mil酶切位點之間，得到重組質粒pBBRlMCS-2-E ；步驟3、重組質粒pBBRlMCS-2-E轉化到布魯氏菌菌株中得到重組菌株，將重組菌株在 25-30°C進行繁殖培養至其0D_值為0. 8-1. 2后迅速升溫至37-45°C進行誘導培養至其 OD600值穩定，然后離心收集菌體，洗滌后用高滲溶液凍融即得。
2.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟1所述裂解基因E由以下方法制備用如SEQ ID NO :4所示核苷酸序列的正向引物LE-F和如SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的反向引物LE-R從噬菌體Η Χ174中擴增得到裂解基因E。
3.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟3所述轉化為電轉化。
4.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟3所述布魯氏菌菌株為布魯氏菌 S2菌株、布魯氏菌M5菌株、布魯氏菌RB51菌株或布魯氏菌104M菌株。
5.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟3所述繁殖培養溫度為^°C。
6.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟3所述誘導培養溫度為42°C。
7.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟3所述高滲溶液為5%氯化鈉溶液。
8.由權利要求1-7任意一項所述制備方法制備的布魯氏菌菌殼。
9.權利要求8所述布魯氏菌菌殼在制備預防布魯氏菌病的疫苗中的應用。
10.根據權利要求9所述應用，其特征在于，所述疫苗包括有效量的權利要求7所述布魯氏菌菌殼和醫藥學上可接受載體。
全文摘要
本發明涉及微生物領域，具體公開了一種布魯氏菌菌殼及其制備方法和應用。該制備方法將如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到質粒pBV220中，得到重組質粒pBV220::E，接著擴增重組質粒pBV220::E，擴增產物連接到質粒pBBR1MCS-2中，然后轉化到布魯氏菌中，將重組菌株在25-30℃進行繁殖培養至其OD600值為0.8-1.2后升溫至37-45℃進行誘導培養至其OD600值穩定，然后離心收集菌體，洗滌后用高滲溶液凍融即得。本發明采用生物技術將溫控調節序列和裂解基因E的融合序列轉化到布魯氏菌中，制備成安全性高、保護效果好的菌殼，對控制布魯氏菌病的流行和傳播具有重要意義。
文檔編號A61K39/10GK102352338SQ20111029349
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者馮書章, 劉軍, 劉爽 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所