專利名稱：一種適配體修飾的磁光雙功能造影劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學材料領域，涉及一種適配體修飾的磁光雙功能造影劑及其制備方法和應用。
背景技術：
隨著科學技術的進步、人民生活的需要和納米技術的發展，人們對納米材料的研究已深入到越來越小的尺度范圍，以及越來越多的功能特征。磁光雙功能納米材料以其良好地磁學和發光性能、獨特的結構等特點，集磁性和發光于一體，在磁學、熒光、生物、醫藥等領域廣泛應用；特別是在超高密度信息存儲、生物分子識別、藥物傳輸等方面具有極其重要的應用，成為國際科技界的重大研究課題。生化及醫學等領域對磁光雙功能納米材料的物理、化學及藥理性質如化學組成、粒度大小、磁功能、光功能、晶體結構、表面形貌、溶解性及毒性等都有嚴格的要求。實現具有磁光雙功能的納米材料在生化及醫學等領域的應用， 必須滿足以下條件1.對腫瘤細胞具有靶向性，1.同時具有磁學和熒光成像模式；2.發光體熒光不容易猝滅；3.具有水溶性；4.具有較好的單分散性；5具有良好的體外或體內成像效果。現有技術制備水溶性磁性納米粒子，在納米粒子表面修飾的主要手段有機聚合物包覆、配體交換。有機聚合物包覆，容易造成粒子團聚，納米粒子溶解性不穩定。配體交換方法時間效率低，制備過程復雜。采用上述現有技術制備的磁性納米粒子接上發光材料后，最明顯的缺點是容易導致表面連接的熒光配體熒光猝滅，從而較難實現磁光雙功能的目的。現有技術制備的磁光雙功能納米粒子的缺點是1.只具有磁學性質，光學性質不穩定；2.發光體熒光容易猝滅，3.對腫瘤細胞無靶向性。由于制備的磁光雙功能納米粒子具有上述缺點，無法滿足在生化及醫學等領域的應用條件，限制了磁光雙功能納米粒子的應用。因此發明一種制備靶向的磁光雙功能納米粒子是十分重要的。經廣泛檢索國內外專利文件和公開出版物，均未見有與本發明相同的制備磁光雙功能納米粒子的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種適配體修飾的磁光雙功能造影劑，并提供其制備方法和用途。為了實現本發明的目的，所采用的技術方案如下一種適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，包括以下步驟(1)乙酰丙酮合錳前驅體溶解于油胺中，在氮氣氣氛，160 180°C下恒溫反應8 12h，分離所得物質，即得表面油胺配位的油溶性四氧化三錳納米粒子；(2)將所制備油溶性四氧化三錳納米粒子溶于環己烷，加入正硅酸四乙酯，反應 10 30min后加入氨水，繼續反應10 36h，然后加入3-氨基丙基-三乙氧基硅烷反應 10 36h，用丙酮沉淀，靜置1 2h，分離所得物質，制得二氧化硅包覆的表面帶有氨基的水
3溶性四氧化三錳納米粒子；(3)將所制備的二氧化硅包覆的水溶性四氧化三錳納米粒子溶解于無水N，N 二甲基酰胺中，加入與氨基的摩爾比為1 1 1 2的異硫氰酸羅丹明，氮氣氣氛下避光反應 10 36h ；分離所得物質，得具有磁光雙功能的二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子；(4)將所得具有磁光雙功能的二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，加入與剩余氨基量摩爾比為1 1 2 1的分子量為600 800雙羧基聚乙二醇，反應12 Mh，離心，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌，然后加入含有適配體的磷酸鹽水溶液，反應10 36h，得適配體修飾的磁光雙功能造影劑。步驟(1)乙酰丙酮合錳前驅體油胺的質量比為1 20 1 30。步驟O)中正硅酸四乙酯四氧化三錳的質量比為1 30 50。步驟O)中3-氨基丙基-三乙氧基硅烷正硅酸四乙酯的質量比為1 3 1 5。步驟C3)中二氧化硅包覆的水溶性四氧化三錳納米粒子與無水N，N二甲基酰胺質量體積比為2 1 4 lmg/mL。步驟(3)中二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子在磷酸鹽緩沖溶液的質量體積比為 2 1 4 lmg/mL。步驟⑷中適配體的加入量與雙羧基聚乙二醇的摩爾比為1 1000 100 1000。適配體的序列為5，-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3，。采用上述技術方案所制備的適配體修飾的磁光雙功能造影劑，包括二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子，其中四氧化三錳納米粒子的直徑為6 8nm，二氧化硅包覆層的厚度為8 12nm，二氧化硅包覆層表面帶有氨基并通過氨基與異硫氰酸羅丹明分子和雙羧基聚乙二醇偶合，所述雙羧基乙二醇再連接帶有氨基的適配體，可用于T1磁共振成像。如所述適配體的序列為5，-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，所制備的適配體修飾的磁光雙功能造影劑還可用于Hela細胞靶向檢測。本發明首先通過熱分解的方法進行制備油溶性的磁性納米粒子，然后將該納米粒子表面包覆二氧化硅，不但納米粒子具有水溶性同時表面帶有大量的氨基，然后通過異硫氰酸羅丹明(RBITC)與部分氨基作用連接到納米粒子表面，使得納米粒子也具有了很好的發光性能，然后在剩余氨基上連接雙羧基聚乙二醇，然后再接入帶有氨基的適配體。這種結構的特點是表面有機發光材料與具有磁性的納米粒子核距離相對較大，發光材料不會因為磁性納米粒子核的磁性影響導致熒光猝滅，從而合成以適配體為靶向的磁光雙功能的水溶性四氧化三錳納米粒子造影劑。通過上述技術方案，本發明制得的磁光雙功能四氧化三錳納米粒子粒徑均一，磁性穩定，發光性能好，熒光不易猝滅同時具有良好的分散性和水溶性。本發明合成方法簡單，反應條件溫和、所需原材料易得、價格低廉、操作過程方便、無環境污染，在醫藥和生物領域應用廣泛。
圖1是本發明合成的表面有機配體是油胺的四氧化三錳納米粒子的透射電子顯微鏡圖譜。圖2是本發明合成的包覆二氧化硅外殼后表面有大量氨基的四氧化三錳納米粒子的透射電子顯微鏡圖譜。圖3是本發明合成的具有靶向性的磁光雙功能四氧化三錳納米粒子對HeLa細胞的毒性分析圖。圖4是本發明合成的包覆二氧化硅外殼前、后的四氧化三錳納米粒子以及接入羅丹明和雙羧基聚乙二醇的紅外線圖譜(IR圖)。圖5是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在水溶液中的T1核磁共振成像圖。圖6是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在水溶液中的1/ \相對于 Mn2+濃度擬合的直線圖。圖7是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在HeLa細胞中的T1核磁共振成像圖。圖8是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑及非靶向的磁光雙功能納米粒子在HeLa細胞中的熒光共聚焦成像圖。圖9是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在裸鼠體內T1核磁共振成像圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。實施例(1)制備表面油胺配位油溶性四氧化三錳納米粒子取0.4g乙酰丙酮合錳前驅體溶解于10. 13g油胺中，抽真空，在氮氣氛圍中磁力攪拌，快速加熱到180°C，恒溫反應9h ；冷卻至室溫后離心分離；分離后的物質用無水乙醇連續洗3 6次；真空干燥；制得表面油胺配位的褐色物質油溶性四氧化三錳納米粒子。其透射電子顯微鏡圖譜如圖1所示，表明四氧化三錳納米粒子在環己烷中具有較好的單分散性，粒徑為7nm左右。(2)制備配制表面活性劑的環己烷溶液將7mL α-(4-壬基苯基)-ω-羥基-聚(氧化-1，2_聯乙烷)(30mmol) (Ig印al C0-520)表面活性劑，加入到50mL環己烷溶液中，超聲溶解60min。(3)取30mg步驟(1)制備的油溶性四氧化三錳納米粒子，加入50mL環己烷溶液中，超聲溶解10 60min。(4)將步驟O)、(3)制得的兩種溶液混合，超聲溶解均勻，置入容器中，加入Img 正硅酸四乙酯，常溫攪拌15min后加入0. 8mL25%的氨水，調節pH至9左右，繼續常溫攪拌 24h,然后加入0. 3mg3-氨基丙基-三乙氧基硅烷，再常溫攪拌Mh，用20mL丙酮沉淀，靜置 lh，離心分離，分別用乙醇和水各洗滌2 6次，制得表面有大量氨基的二氧化硅包覆的水溶性四氧化三錳納米粒子。其透射電子顯微鏡圖譜如圖2所示，由圖可知該納米粒子在水溶液中具有良好的單分散性，粒徑均一，大約30nm左右。測得其氨基密度為2. 4*10_4mol/
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(5)制備磁光雙功能四氧化三錳納米粒子取步驟⑷制備四氧化三錳納米粒子30mg(7. 2*10_6mOl氨基)，溶解于IOmL無水 N，N 二甲基酰胺中；加入aiig(3. 6*10_6mol)異硫氰酸羅丹明；密封抽真空，氮氣保護；錫箔紙避光；室溫攪拌24h ；離心分離，用無水乙醇洗滌2 6次，制得有二氧化硅包覆具有磁光雙功能的水溶性四氧化三錳納米粒子。測得剩余氨基密度為1. 0*10_4mOl/g。(6)制備適配體修飾的磁光雙功能造影劑將步驟(5)制備的磁光雙功能納米粒子30mg (3*10_6mol氨基)，溶解于IOmL磷酸鹽緩沖溶液中，加入3 μ L分子量為600的雙羧基聚乙二醇(6*10_6mol)，磁力攪拌12h，離心，用磷酸鹽緩沖溶液洗兩遍，然后加入含有3. 75*l(T9m0l 11. 25*l(T9m0l (1 30D)適配體的磷酸鹽水溶液0. 5mL,磁力攪拌Mh，得具有靶向性的磁光雙功能四氧化三錳納米粒子，即本發明的適配體修飾的磁光雙功能造影劑，適配體的序列為5’ -TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3，。以合成的具有靶向性的磁光雙功能四氧化三錳納米粒子對HeLa細胞進行毒性分析，結果如圖3所示，由圖可知，該納米粒子經過1 和24h孵育后幾乎無毒性。圖4是本發明合成的包覆二氧化硅外殼前、后的四氧化三錳納米粒子以及接入羅丹明和聚乙二醇的紅外線圖譜(IR圖)；包裹前的表面為油胺的四氧化三錳納米粒子， 422^,516^1左右為四氧化三錳粒子的錳氧鍵伸縮振動產生的特征峰，1120CHT1左右為納米粒子表面的油胺C-N伸縮振動，163 !^1左右為納米粒子表面的油胺C = C的伸縮振動，2925cm—1為納米粒子表面的油胺C-H的伸縮振動；包覆二氧化硅以后，可以明顯看到1057CHT1左右為Si-O-Si不對稱伸縮振動，45201^,78301^,9560^1左右為二氧化硅的 δ Si-O形變振動特征峰，1561cm-1左右為納米粒子表面的油胺N-H的彎曲振動1639CHT1為納米粒子表面的油胺C = C的伸縮振動，由于反應時加入了 APS，所以二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子表面帶有氨基，3427cm—1可能為-NH2的彎曲振動。圖5是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在水溶液中的T1核磁共振成像圖，隨著納米粒子濃度增加，圖像逐漸變亮，可以作為T1造影劑。圖6是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在水溶液中的1/ \相對于 Mn2+濃度擬合的直線圖；圖中直線的斜率即為橫向馳豫率R1，圖6表明制備的水溶性四氧化三錳納米粒子有較強的馳豫能力，橫向馳豫率R1達到0. SSmr1sA圖7是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在HeLa細胞中的T1核磁共振成像圖，納米粒子濃度分別為O μ g/mLUO μ g/mL、20 μ g/mL、50 μ g/mLUOO μ g/mL,由圖可知隨著納米粒子濃度增加，圖像逐漸變亮，納米粒子在細胞內成像效果較好。圖8是本發明合成的具有靶向性的適配體修飾的磁光雙功能造影劑及非靶向的磁光雙功能納米粒子在HeLa細胞中的熒光共聚焦成像圖，由圖可知。具有靶向性德適配體修飾的磁光雙功能納米粒子成像效果明顯優于非靶向的磁光雙功能納米粒子，說明具有靶向性的適配體修飾的磁光雙功能納米粒子對Hela細胞具有靶向性。圖9是本發明合成的適配體修飾的磁光雙功能造影劑在裸鼠體內T1核磁共振成像圖，分別為0h、iau24h的T1核磁共振成像圖，由圖可知具有靶向性的適配體修飾的磁光雙功能納米粒子在體內具有良好成像效果。上述實施例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限定的范圍。
權利要求
1.一種適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)乙酰丙酮合錳前驅體溶解于油胺中，在氮氣或惰性氣體氣氛，160 180°C下恒溫反應8 12h，分離所得物質，即得表面油胺配位的油溶性四氧化三錳納米粒子；(2)將所制備油溶性四氧化三錳納米粒子溶于環己烷，并加入表面活性劑分散均勻； 加入正硅酸四乙酯，反應10 30min后加入氨水調節ph至8 10，繼續反應10 36h，然后加入3-氨基丙基-三乙氧基硅烷反應10 36h，用丙酮沉淀，靜置1 2h，分離所得物質，制得二氧化硅包覆的表面帶有氨基的水溶性四氧化三錳納米粒子；(3)將所制備的二氧化硅包覆的水溶性四氧化三錳納米粒子溶解于無水N，N二甲基酰胺中，加入與氨基的摩爾比為1 1 1 2的異硫氰酸羅丹明，氮氣氣氛下避光反應10 36h ；分離所得物質，得具有磁光雙功能的二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子；(4)將所得具有磁光雙功能的二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，加入與剩余氨基量摩爾比為1 1 2 1的分子量為600 800雙羧基聚乙二醇，反應12 Mh，離心，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌，然后加入含有適配體的磷酸鹽水溶液，反應10 36h，得適配體修飾的磁光雙功能造影劑。
2.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟(1)乙酰丙酮合錳前驅體與油胺的質量比為1 20 1 30。
3.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟O)中正硅酸四乙酯與四氧化三錳的質量比為1 30 50。
4.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟O)中3-氨基丙基-三乙氧基硅烷正硅酸四乙酯的質量比為1 3 1 5。
5.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟C3)中二氧化硅包覆的水溶性四氧化三錳納米粒子與無水N，N二甲基酰胺的質量體積比為 2 1 4 lmg/mL。
6.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于，步驟(3)中二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子與磷酸鹽緩沖溶液的質量體積比為 2 1 4 lmg/mL。
7.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟中適配體的加入量與雙羧基聚乙二醇的摩爾比為1 1000 100 1000。
8.根據權利要求1所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑的制備方法，其特征在于， 適配體的序列為5，-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3，。
9.權利要求1 8所述任意一項制備方法所制備的適配體修飾的磁光雙功能造影劑， 其特征在于，包括二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子，其中四氧化三錳納米粒子的直徑為6 8nm，二氧化硅包覆層的厚度為8 12nm，二氧化硅包覆層表面帶有氨基并通過氨基與異硫氰酸羅丹明分子和雙羧基聚乙二醇偶合，所述雙羧基乙二醇再連接帶有氨基的適配體。
10.權利要求9所述的適配體修飾的磁光雙功能造影劑，其特征在于，所述適配體的序列為5’ -TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3，。
11.權利要求9或10所述的造影劑用于T1磁共振成像。
12.權利要求10所述的造影劑用于Hela細胞靶向檢測。
全文摘要
本發明公開了一種適配體修飾的磁光雙功能造影劑及其制備方法和應用，該造影劑包括二氧化硅包覆的四氧化三錳納米粒子，其中四氧化三錳納米粒子的直徑為6～8nm，二氧化硅包覆層的厚度為8～12nm，二氧化硅包覆層表面帶有氨基并通過氨基與異硫氰酸羅丹明分子和雙羧基聚乙二醇偶合，所述雙羧基乙二醇再連接帶有氨基的適配體。本發明所得造影劑單分散和生物兼容性好，且具有靶向性，可作為一種很好的T1磁共振成像造影劑，并且對腫瘤細胞具有良好的靶向性，在醫藥和生物領域具有廣泛應用價值；本發明的制備方法對設備的要求很低，操作過程方便，所需原料價格低廉，副產物無公害。
文檔編號A61K49/18GK102397566SQ20111036103
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者代安濤, 安璐, 張崇琨, 楊仕平, 汪娟娟, 胡鶴, 黃國勝 申請人:上海師范大學