專利名稱：雞球蟲adf重組卡介苗及制備方法
技術領域：
本發明提供了一種雞球蟲ADF重組卡介苗，同時還提供了該疫苗的的制備方法， 屬基因工程技術領域。
背景技術：
雞球蟲病是ー種由艾美爾屬的ー種單細胞寄生性原蟲引起的，全球性的原蟲病， 是嚴重危害養雞業的重要疾病之一，其中以柔嫩艾美耳球蟲W. tenella)的危害最為嚴重。萬.ム主要寄生于雞的盲腸上皮細胞。其裂殖體在盲腸上皮細胞內大量繁殖，嚴重破壞腸粘膜，盲腸腫脹出血，病雞明顯消瘦、食欲減退、發育停滯甚至死亡。該病分布廣泛， 長期以來主要依賴于藥物和球蟲活苗進行防治，但最近幾年由于耐藥蟲株的出現，以及藥物殘留對人們的身體健康造成威脅而研發新藥成本高、周期長，同時球蟲活苗蟲種毒カ返強等潛在危害問題的存在，使人們將目光轉向了分子疫苗。人們曾嘗試過將球蟲的抗原基因在不同的表達環境進行表達，但目前仍沒有ー種抗原基因能夠提供完全的免疫保護，而且受表達系統的限制，以大腸桿菌為原核表達系統的重組蛋白抗原性較差；痘病毒載體疫苗由于病毒的特性，只能進行一次免疫，無法滿足球蟲免疫的要求；真核載體疫苗雖然可以引起機體的細胞免疫，但是免疫途徑比較麻煩；沙門氏菌載體在實驗室應用相對來說比較安全，但若應用于臨床，就必須考慮安全性問題。因此，有必要采用基因工程方法發展ー種高效，廉價的新型雞球蟲疫苗。目前，卡介苗是世界上應用最為廣泛和安全的疫苗。因與其它細菌載體和病毒載體相比有不可比擬的優勢而成為重組活載體疫苗的首選。它本身是ー種很好的非特異免疫增強劑，能増加機體免疫功能，免疫持久，單次接種即能誘導機體產生的細胞免疫和體液免疫，副作用小，并且易于生產，價格低廉，適宜于廣大農村。肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor, ADF)是申請者在柔嫩艾美耳球蟲cDNA表達文庫和制備柔嫩艾美耳球蟲子孢子特異性單抗的基礎上，利用特異性單抗對柔嫩艾美耳球蟲cDNA表達文庫篩選獲得的。ADF序列含有357bp的開放閱讀框，可編碼118個氨基酸，分子量為13.34kDa。其序列與其他生物體的ADF蛋白有高度的同源性，且與剛地弓形蟲ADF同源性最高。CDD分析顯示該蛋白具有肌動蛋白解聚因子保守結構域特征。含有肌動蛋白結合位點，F-actin結合位點。細胞骨架中的肌動蛋白參與了一系列重要生理活動，如肌肉收縮、胞質環流、細胞運動、胞質分裂等。這些過程的發生除了需要肌動蛋白以外，還需要一些與之結合的調節蛋白參與，如肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)等，在一定條件下可以使肌動蛋白微絲解聚。因此柔嫩艾美耳球蟲ADF基因對研究蟲體的運動和侵入有重要意義。并且侵入蛋白也是重要的疫苗候選分子。ADF亞單位疫苗和核酸疫苗對雞柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護試驗表明，其有一定的免疫保護作用，但球蟲ADF重組卡介苗尚無報導
發明內容
本發明提供一種雞球蟲ADF重組卡介苗，為兩種抗雞柔嫩艾美耳球蟲的新型活載體疫苗，解決了目前雞球蟲尚無理想疫苗的問題。本發明還進ー步公開了雞球蟲ADF重組卡介苗的制備方法，適用于エ業化生產。一、本發明提供的雞球蟲ADF重組卡介苗，是通過以下方法制成的
首先獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉錄成cDNA，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，與PMD-18T載體連接進行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進行酶切反應的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261和整合表達載體PMV361相連，連接正確的重組質粒轉化到BCG中，經抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。ニ、所述的雞球蟲ADF重組卡介苗，包括
穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗，將其命名為 rBCG PMV26 トADFiPrBCG PMV361-ADF0三、本發明公開的穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟
從本試驗室構建的柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2cDNA表達文庫中篩選出ADF基因，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，TA克隆。測序鑒定正確的質粒進行酶切，回收目的片段，與同種酶切的PMM61穿梭表達載體進行連接， 將連接產物轉入DH5 α感受態細胞中，提取質粒，將重組質粒ADFj61經電穿孔轉化到卡介苗中，37°C培養至對數生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實為陽性克隆后， 45°C熱誘導表達，對該表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及flfestern blotting鑒定。將制備好的穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF以IO7CFU/只的劑量，通過滴鼻點眼、ロ服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，同時設BCG組和紅、 白對照組，三免一周后ロ服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行攻蟲試驗，對體液免疫水平、ACI 和細胞免疫水平檢測等指標進行綜合評價。穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMM61-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量明顯減少，體重增長明顯增加，盲腸病變計分數值較小，保護率達到72. 58%以上。各項指標均優于對照組。其中陰性對照組ACI值為 104. 31，而 rBCG PMM61-ADF 免疫組 ACI 值分別為 161. 47、152. 73、149. 35，說明使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數，而滴鼻點眼ACI值達到160以上，以這種途徑免疫抗球蟲效果非常有效。BCG免疫的三組其ACI值在134. 85^147. 74之間，效果也高于對照組，提示我們單獨使用BCG對增強雞球蟲免疫保護效果也有一定的作用，其中以滴鼻點眼方式免疫效果更好。穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗PMM61-ADF免疫雛雞后，能同時誘導有效的細胞和體液免疫，表現為CD4+ T細胞數量和特異性抗體滴度明顯高于對照組 (Ρ<0· 01)。四、本發明整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟
根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物并引入酶切位點，進行PCR，TA克隆，對測序鑒定正確的質粒進行雙酶切，回收目的片段，與同種酶切的 PMV361整合表達載體進行連接，轉入DH5 α感受態細胞中，提取質粒，將重組質粒ADF-361 經電穿孔法轉化到卡介苗中，37°C培養至對數生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實為陽性克隆后，45°C熱誘導表達，對該表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting 鑒定。將制備好的穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF以IO7CFU/只的劑量，通過滴鼻點眼、ロ服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，同時設BCG組和紅、 白對照組，三免一周后ロ服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行攻蟲試驗，對體液免疫水平、ACI 和細胞免疫水平檢測等指標進行綜合評價。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數，其中rBCG PMV361-ADF滴鼻點眼，ロ服和皮下注射免疫組ACI值分別為169. 21，156. 7和153. 34，具有較好的抗球蟲效果。整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV361-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著増加，盲腸病變計分數值較小，三種免疫途徑保護率分別為86. 71%,77. 70%,75. 34%。以滴鼻點眼免疫方式效果更為明顯。用整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗免疫雛雞后能誘導有效的細胞免疫和體液免疫，CD4+ T細胞數量和特異性抗體滴度均較之陰性對照組有不同程度的提高(P<0. 05)。本發明所提供的兩種重組卡介苗疫苗菌株，本專利申請將其命名為rBCG PMW61-ADF和rBCG PMV361-ADF.
本發明提供的兩種球蟲重組卡介苗通過三種不同免疫途徑即滴鼻點眼、ロ服、頸部皮下注射，免疫雛雞，共免疫三次，在第三次免疫后一周，ロ服接種雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行攻蟲試驗，通過體液免疫水平、ACI和細胞免疫水平檢測等指標進行綜合評價。結果顯示，球蟲重組卡介苗rBCG PMW61-ADF和rBCG PMV361-ADF組均具有明顯的免疫保護作用， 各指標均強于陰性對照組，能夠有效地抵抗柔嫩艾美耳球蟲卵囊的攻擊，ACI值到達170以上，具有很好的抗球蟲效果。卡介苗活載體疫苗是用于實驗動物和人的最強免疫佐劑，本身能誘導機體產生較強的細胞免疫和體液免疫作用，免疫力持久，而且又能高效表達重組蛋白，同時使表達的球蟲蛋白發揮較好的免疫保護作用，兩者的優勢互相組合，達到更好的預防雞球蟲病的目的。 rBCG可以根據不同病原體的致病機制，采用不同的接種方式，而采用ロ服呼吸道粘膜免疫不僅可誘導全身體液和細胞免疫反應，而且還能夠誘發全身粘膜免疫反應，誘導具有特異性分泌性的IgA產生，這對于雞球蟲病的預防來說尤其重要。ADF蛋白是組成微線的一類重要的肌動蛋白結合蛋白，在肌動蛋白纖維骨架的重建過程中以及寄生蟲侵染宿主的過程中有重要作用。因此ADF基因有望成為防治柔嫩艾美耳球蟲病的疫苗候選基因。本發明的積極效果在于這種活載體疫苗能發揮卡介苗本身較強的細胞免疫佐劑作用，同時使表達的蛋白發揮較強的免疫保護作用，達到更好的預防雞球蟲病的目的。這種新型活載體疫苗穩定性好，運輸和保存較為容易，易于生產，產品不需純化，可直接用于免疫保護試驗.免去了蛋白質后處理的復雜エ序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農村。
圖1為PMM61-ADF載體構建示意圖； 圖2為PMV361-ADF載體構建示意圖3為重組卡介苗pMW61-ADF經SDS-PAGE分析結果；
重組卡介苗PMM61-ADF經SDS-PAGE分析，在17kD左右出現一條新的蛋白帶，而非重組卡介苗蛋白則未見相應帶出現。M為標準蛋白marker ;1為卡介苗陰性對照；2為重組質粒pMM61-ADF在卡介苗中表達的結果；
圖4為重組卡介苗pMV361-ADF經SDS-PAGE分析結果；
重組卡介苗PMV361-ADF經SDS-PAGE分析，在17kD左右出現一條新的蛋白帶，而非重組卡介苗蛋白則未見相應帶出現。M為標準蛋白marker ；1為重組卡介苗pMV361_ADF在卡介苗中表達的結果；2為卡介苗陰性對照；
圖5為重組卡介苗pMM61-ADF經Western blotting分析的結果； 重組卡介苗PMM61-ADF表達的重組蛋白在相對分子質量約17kD處可見特異性反應條帶。圖6為重組卡介苗pMV361-ADF經Westernblotting分析的結果；
重組卡介苗PMV361-ADF表達的重組蛋白，在相對分子質量約17kD處可見特異性反應條帶。
具體實施例方式通過以下實施例進ー步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。實施例1
本發明球蟲重組卡介苗疫苗的制備
本發明以球蟲侵入相關基因ADF基因為例，進行穿梭表達載體和整合表達載體的構建。一、穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟
參照ADF基因DNA序列及穿梭表達載體PMV261物理圖譜設計兩對特異性引物并引入酶切位點。上游引物ADl 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3 ；其中 5、端含有 PstI位點；
下游引物 AD 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3 ；5、端含有 ClaI 位點。以cDNA為模板，用RT-PCR技術擴增ADF基因，將擴增產物連接至PMD18-T克隆載體后，進行PCR、酶切及測序鑒定，將凝膠回收的目的片段與用同種酶切的穿梭表達載體 PMV261連接，同時連接產物轉化到^: cWi DH5a感受態細胞，篩選重組質粒，用!3st I、 Cla I進行雙酶切反應，重組質粒命名為PMM61-ADF，(如圖1所示將ADF目的基因與T 載體進行連接，用!3st KCla I進行雙酶切反應，回收片段與同樣進行酶切反應的穿梭載體PMV261進行連接，構建PMW61-ADF穿梭表達載體)。將BCG接種于MB7H9 ADC液體培養基中，37°C培養至對數生長期，取BCG菌液(600nm處OD值為0. 5左右)，冰浴后，離心收集菌液，加入預冷甘油洗滌沉淀，重復洗滌兩次，最后重懸Iml 10%甘油中，用于電轉化。取 60-80ulBCG感受態菌液加入0. Iug重組質粒PMM61-ADF置于電轉杯中。電穿參數電壓 2.5KV，電容25 μ F，電阻1000 Ω。電穿孔轉化后立即加入ΜΒ7Η9 OADC培養基中，37°C培養 48小時后涂布于含20ug/mlKan MB7H10 OADC培養基平板，約4w_6w后長出菌落。從培養基平板上挑取BCG重組子，接種于MB7H9 OADC液體培養基(含Kan抗性)，37°C培養至對數生長期，PCR證實陽性克隆后，45°C水浴中誘導，離心收集菌體，菌體沉淀加入分枝桿菌裂解緩沖液以重懸沉淀，并加入終濃度為1%的SDS，溶菌酶至終濃度100μ g/mL，37°C作用15min，超聲波剪切DNA至溶液不再粘稠，最后加入等體積2X SDS-PAGE加樣緩沖液，100°C煮沸IOmin 后，，IOO0C 5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析(如圖3所示)及Western blotting鑒定。重組卡介苗PMM61-ADF表達的重組蛋白在相對分子質量約17kD處可見特異性反應條帶(如圖5所示)。ニ、整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟
參照ADF基因DNA序列及穿梭載體PMV361物理圖譜設計兩對引物并引入酶切位點。上游引物AD2 5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3 ；其中端含有 Pvu II 位點； 下游引物 AD 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3 ；5、端含有 ClaI 位點。以cDNA為模板，用RT-PCR技術擴增ADF基因，將擴增產物連接至PMD18-T克隆載體后，進行PCR、酶切及測序鑒定，將凝膠回收的目的片段與用同種酶切的穿梭表達載體 Pmv361連接，同時連接產物轉化到五cWi DH5a感受態細胞，篩選重組質粒，用!3st I、 Cla I進行雙酶切反應，重組質粒命名為PMV361-ADF (如圖2所示將ADF目的基因與T載體進行連接，用Pvu IKCla I進行雙酶切反應，回收片段與同樣進行酶切反應的整合載體 PMV361進行連接，構建PMV361-ADF整合表達載體)。取60_80ulBCG感受態菌液加入0. Iug 重組質粒PMM61-ADF置于電轉杯中。電穿參數電壓2. 5KV，電容25 μ F，電阻1000 Ω。 電穿孔轉化后立即加入ΜΒ7Η9 OADC培養基中，37°C培養48小時后涂布于含20ug/mlKan MB7H10 OADC培養基平板，約4w_6w后長出菌落。從培養基平板上挑取BCG重組子，接種于 MB7H9 OADC液體培養基(含Kan抗性)，37°C培養至對數生長期，PCR證實陽性克隆后，45°C 水浴中誘導，離心收集菌體，菌體沉淀加入分枝桿菌裂解緩沖液以重懸沉淀，并加入終濃度為1%的SDS，溶菌酶至終濃度100μ g/mL，37°C作用15min，超聲波剪切DNA至溶液不再粘稠，最后加入等體積2XSDS-PAGE加樣緩沖液，100°C煮沸IOmin后，，100°C 5min。取12ul 上述菌液SDS-PAGE分析(如圖4所示)及Wfestern blotting鑒定。重組卡介苗pMV361_ADF 表達的重組蛋白，在相對分子質量約17kD處可見特異性反應條帶(如圖6所示)。實施例2
本發明球蟲重組卡介苗疫苗的用途
一、穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的用途
實驗動物為1日齡雛雞，飼養于無球蟲污染的鐵籠中，自由采食，自由飲水。6日齡時， 剔除弱雛和過大、過小雞雛，將其余雞只隨機分為8組，每組20只。試驗分pMM61-ADF免疫組，BCG免疫組和紅白對照組。將重組卡介苗和BCG分別以IO7CFU/只的劑量免疫雛雞， 井分別于1周和2周后進行加強免疫，采用滴鼻點眼、ロ服和頸部皮下注射三種免疫方式， 三免后1周ロ服接種E. tenella抱子化卵囊1 X 104個/只進行攻蟲試驗。紅白對照組接種PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。進行以下各項指標判定，包括保護率、相對增重率、0PG、ACI等；第三次免疫一周后取脾臟，分離脾淋巴細胞，流式細胞儀對⑶4+、⑶8+進行細胞水平免疫檢測；每次免疫后采血，分離血清ELISA方法對體液免疫水平進行檢測。攻蟲前對每組雞逐只稱重并標號記錄，攻蟲后一周對每組雞再次逐只稱重，觀察攻蟲后雞的增重情況，計算相對增重；攻蟲后每天檢查糞便，并從第五天開始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取2g，加入58mL飽和食鹽水，取一滴置于改良的麥克馬斯式計數板中，在低倍鏡下記數球蟲卵囊總數；于攻蟲后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按 Johnson設計的病變記分法記分。計算ACI=相對增重率+存活率-病變值-卵囊記分。結果顯示各項指標均明顯優于不免疫攻蟲對照組，陰性對照組的ACI僅為 104. 31，而單獨使用BCG能不同的提高抗球蟲指數，其中BCG滴鼻點眼組ACI達到了 147. 74，發揮了 BCG作為免疫增強劑的效果，效果尤為突出的是本發明所提供的穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF,免疫方式采用滴鼻點眼組，抗球蟲指數ACI 值均達到160以上，說明抗球蟲效果非常有效。穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMM61-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著増加，盲腸病變計分數值較小，保護率達到72. 85%以上。將發明的新型活載體疫苗rBCG PMM61-ADF免疫雛雞后，于第三次免疫后1周，每組隨機各取10只雞放血處死，取脾臟，加2mL Hank's液，用剪刀將脾臟剪成小塊，在200目篩上研磨，用雞脾淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，用Hank’ s液稀釋成細胞懸液(IO6個/ mL)。取100 μ L細胞懸液，加PE標記的抗⑶4+和FITC標記的抗⑶8+兔抗雞單克隆抗體， 用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+ T淋巴細胞的數量，并用SPSS軟件對所得數據進行統計學分折。結果表明免疫組及BCG組⑶4 +變量明顯高于陰性對照組，其中rBCG PMV261-ADF滴鼻組和ロ服組雞的⑶4+ T淋巴細胞數升高較為明顯，與對照組相比差異均極顯著(P<0. 01)。 毎次免疫前翅靜脈采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白作為包被抗原，通過間接 ELISA方法對雞血清中IgG變化情況進行檢測。結果ー免后各實驗組與對照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。ニ免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實驗組均顯示一定的抗體效價，其中，rBCG PMV261-ADF滴鼻組血清抗體吸光度最高，與對照組相比差異極顯著(Ρ<0· 01)。ニ、整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的用途
實驗動物為1日齡雛雞，飼養于無球蟲污染的鐵籠中，自由采食，自由飲水。6日齡時， 剔除弱雛和過大、過小雞雛，將其余雞只隨機分為8組，每組20只。試驗分pMV361-ADF免疫組，BCG免疫組和紅白對照組。將重組卡介苗和BCG分別以IO7CFU/只的劑量免疫雛雞， 井分別于1周和2周后進行加強免疫，采用滴鼻點眼、ロ服和頸部皮下注射三種免疫方式， 三免后1周ロ服接種Ε. tenella抱子化卵囊1 X 104個/只進行攻蟲試驗。紅白對照組接種PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。進行以下各項指標判定，包括保護率、相對增重率、0PG、ACI等；第三次免疫一周后取脾臟，分離脾淋巴細胞，流式細胞儀對⑶4+、⑶8+進行細胞水平免疫檢測；每次免疫后采血，分離血清ELISA方法對體液免疫水平進行檢測。攻蟲前對每組雞逐只稱重并標號記錄，攻蟲后一周對每組雞再次逐只稱重，觀察攻蟲后雞的增重情況，計算相對增重；攻蟲后每天檢查糞便，并從第五天開始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取2g，加入58mL飽和食鹽水，取一滴置于改良的麥克馬斯式計數板中，在低倍鏡下記數球蟲卵囊總數；于攻蟲后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按 Johnson設計的病變記分法記分。計算ACI=相對增重率+存活率-病變值-卵囊記分。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數，其中rBCG PMV361-ADF滴鼻點眼免疫組ACI值達到169. 21，具有很好的抗球蟲效果。整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV361-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著増加，盲腸病變計分數值較小，三種免疫途徑保護率分別為86. 71%,77. 70%,75. 34%。以滴鼻點眼免疫方式效果更為明顯。 將發明的新型疫苗rBCG PMV361-ADF免疫雛雞后，于第三次免疫后1周，每組隨機各取10只雞放血處死，取脾臟，加2mL Hank's液，用剪刀將脾臟剪成小塊，在200目篩上研磨，用雞脾淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，用Hank's液稀釋成細胞懸液(IO6個/mL)。取 100 μ L細胞懸液，加PE標記的抗⑶4+和FITC標記的抗⑶8+兔抗雞單克隆抗體，用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+ T淋巴細胞的數量，并用SPSS軟件對所得數據進行統計學分析。結果表明免疫組及BCG組⑶4+變量明顯高于陰性對照組，其中rBCG PMV361-ADF免疫組與對照組相比差異極顯著(P<0. 01)。毎次免疫前翅靜脈采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白作為包被抗原，通過間接ELISA方法對雞血清中IgG變化情況進行檢測。結果ー免后各實驗組與對照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。ニ免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實驗組均顯示一定的抗體效價，其中，rBCG PMV361-ADF滴鼻組血清抗體吸光度最高，于對照組相比差異極顯著(P<0. 01)。
權利要求
1.一種雞球蟲ADF重組卡介苗，是通過以下方法制成的首先獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉錄成cDNA，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，與PMD-18T載體連接進行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進行酶切反應的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261和整合表達載體PMV361相連，連接正確的重組質粒轉化到BCG中，經抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。
2.權利要求1所述的雞球蟲ADF重組卡介苗，包括穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗。
3.權利要求2所述穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟 將構建的柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2cDNA表達文庫中篩選出ADF基因，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，TA克隆；測序鑒定正確的質粒進行酶切，回收目的片段，與同種酶切的PMM61穿梭表達載體進行連接，將連接產物轉入DH5 α感受態細胞中，提取質粒，將重組質粒ADF-261經電穿孔轉化到卡介苗中，37°C培養至對數生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實為陽性克隆后，45°C熱誘導表達，對該表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及Wfestern blotting鑒定；其中，上游引物 ADl 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3 ； 下游引物 AD: 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3 ；。
4.權利要求2所述整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟 根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物并引入酶切位點，進行PCR，TA克隆，對測序鑒定正確的質粒進行雙酶切，回收目的片段，與同種酶切的 PMV361整合表達載體進行連接，轉入DH5 α感受態細胞中，提取質粒，將重組質粒ADF-361 經電穿孔法轉化到卡介苗中，37°C培養至對數生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實為陽性克隆后，45°C熱誘導表達，對該表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting 鑒定； 其中，上游引物 AD2 5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3 ； 下游引物 AD: 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3。
全文摘要
本發明提供了一種雞球蟲ADF重組卡介苗，同時還提供了該疫苗的制備方法，獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉錄成cDNA，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，與PMD-18T載體連接進行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進行酶切反應的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261和整合表達載體PMV361相連，連接正確的重組質粒轉化到BCG中，經抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。該活載體疫苗穩定性好，運輸和保存較為容易，易于生產,產品不需純化，可直接用于免疫保護試驗.免去了蛋白質后處理的復雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農村。
文檔編號A61K39/012GK102552893SQ201110439688
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張西臣, 李建華, 李 赫, 李運娜, 楊舉, 程柏淇, 陳玉江 申請人:吉林大學