專利名稱：一種鼻咽癌靶向磁共振對比劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物材料領域，尤其是一種LMPl+-鼻咽癌靶向磁共振對比劑及其制備方法。
背景技術：
腫瘤是當今影響人類健康的主要疾病之一，世界衛生組織的一項報道表明，隨著全球人類生存環境的變化，全球惡性腫瘤的發生率將由現在的1000萬人/年上升到1500 萬人/年，成為威脅人類健康的頭號殺手。在我國(特別是華南地區)，近年來，鼻咽癌的發病率呈上升趨勢，全世界80%的鼻咽癌病例發生在中國。鼻咽癌病理類型主要為非角化型未分化癌，易出現頸部淋巴結及遠處轉移；在首程診療患者中，III-IV期患者占了 70% -80%。放射治療在過去很長一段時間都是鼻咽癌的標準治療手段，鼻咽癌治療的5年生存率I-II期在60%左右，III-IV期則生存率很低， 僅20%-40%，治療失敗的主要原因是局部復發和遠處轉移。此外，中晚期鼻咽癌放化療后嚴重副反應有時難以避免，因此，早期發現鼻咽癌并進行準確診斷對其預后至關重要。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是鼻咽癌的主要病因， EBV-LMPl (Epstein-Barr Virus Latent membrane protein 1) B^^J^IgS , ^ EBV永生化基因中唯一能夠轉化體外培養的人和嚙齒類動物細胞并使細胞獲得“永生”的基因。其中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMPl(Latent membrane protein 1)在鼻咽癌病人中陽性率超過65%，是重要的致瘤蛋白，是目前廣泛認可的鼻咽癌細胞表面的標志性抗原。有望成為臨床診斷及治療的靶標，且潛伏膜蛋白陽性鼻咽癌的增殖能力、侵襲和轉移能力均明顯強于潛伏膜蛋白陰性鼻咽癌，兩者對腫瘤治療方案的反應也有較大差異。因此對鼻咽癌進行進一步的分型有明顯的臨床意義和科學價值。我們研制的i^304-APTES-PEG-LMPl， Clone CS. 1_4磁共振對比劑不僅僅可用于鼻咽癌的影像診斷，而且可以利用MRI對鼻咽癌進行進一步分型。磁共振(Magnetic Resonance Imaging，MRI)因其具有精確的軟組織分辨率，無 X射線引起的輻射損傷，在腫瘤的診斷和療效的監測中正在扮演著越來越重要的角色，磁共振對比齊Ll (Contrast agent for Magnetic resonance imaging,MRICA)能顯著提高正常與異常組織之間的對比度，特別是提高腫瘤組織與周圍正常組織的之間的信噪比，提高早期腫瘤的診斷的準確率。常規磁共振成像往往對這種腫瘤的早期準確診斷存在較大困難。目前全世界醫院運用最多的陰性/陽性磁共振對比劑主要是非特異性對比劑，按照磁化性能分為陽性對比劑及陰性對比劑兩大類。陽性對比劑主要為含釓與含錳螯合物， 其馳豫性能低，由于游離釓與錳對生物體具有較強的毒性，如釓(Gd)等的毒性反應(可以引起腎纖維化等)，且其是一種血池性對比劑，其使用范圍較窄。其作用主要是縮短自旋晶格弛豫時間(Tl馳豫時間)，使靶組織的Tl信號加強，在磁共振上呈高信號，因此，又叫Tl 相對比齊LU 例如[Gd(DTPA)]. sup. 2- (diethylenetriaminepentaacetate-gadolinium(II I)), [Gd(DOTA)]. sup. -(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N' ,N" ,N' ‘’ —tetraacetate-gadolinium(III))，[Gd(BOPTA)]. sup. 2-(benzylo xypropioic-diethylenetriamine pentaacetate-gadolinium(III))禾口 MnDPDP(N, N' -dipyridoxylethy Iene diamine-N, N' -diacetate-5,5' -bis (phosphate)-manganese (II))。陰性對比劑又叫 T2 相對比劑， 主要是使局部磁場不均勻，進而減少自旋弛豫時間(T2馳豫時間)，使得靶向組織T2相信號減低，馳豫性能高。臨床上的陰性對比劑主要以菲立磁為代表，但是菲立磁也是一種非特異性磁共振對比劑。與釓對比劑相比，其特點如下1)能夠進入血管周圍間隙，是一種血管間隙對比劑，因此，其使用范圍更廣泛；幻每單位金屬鐵能夠產生更多的信號強度的改變， 馳豫性能高，尤其在T2WI序列；幻在體內具有生物可降解性，可經細胞內正常代謝途徑而進入體內鐵循環，參與體內鐵的生命活動；4)菲立磁經過普魯士藍染色等方法染色，可以被光鏡或電鏡直接觀察到，因此，更有可能成為腫瘤磁共振靶向對比劑的信號組件。缺點是在體內易被網狀內皮系統和免疫吞噬細胞吞噬，因而半衰期短、對腫瘤的主動靶向聚集功能較弱。而要改變其生物相容性，延長其血液中的循環時間，增強其靶向性能，主要通過對 Fe3O4納米微粒進行表面改性。可以成為表面修飾材料有多種，如多糖，白蛋白、APTES等。 為了減少其空間位阻，在I^e3O4與靶向分子之間插入一個柔軟的連接臂作為一種鏈繩結構， 其系著抗原的游離端活動度大，在靶區能為抗原與抗體結合提供相對較長的接觸時間與更多的接觸機會，造影劑和靶器官之間的結合便更加緊密。合成一種價格低廉的、生物相容性好的、特異性強的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，解決以往對比劑的不足，具有潛在的產業化前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種LMPl+-鼻咽癌特異性陰性對比劑及其制備方法，使得對比劑與現有技術相比具有低毒性，形態可控，高穩定性，好的生物相容性，高敏感性，好的特異靶向性，該對比劑可以用于人體或非人體LMPl+-鼻咽癌增強對比劑。本發明的目的可以通過以下方式實現一種鼻咽癌靶向磁共振對比劑，是用3-氨丙基三乙氧基硅烷(apteq包覆或連接到超順磁性四氧化三鐵上，使狗304表面氨基化，得到!^3O4-aptes表面改性微粒，再將聚乙二醇(peg)作為!^3O4-aptes表面改性微粒與eb病毒潛伏膜蛋白1單克隆抗體(簡寫為 LMPLClone CS. 1-4 ；購于DAKO公司，購買時間2008. 05. 05)之間的連接臂，將二者連接起來，得到的分散穩定的!^3O4-Aptes-Peg-LMPI, Clone CS. 1-4膠體溶液。所述的超順fi53o4是采用化學共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。
所述的 fii3O4-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 膠體微粒粒徑為 20_30nm。所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑是將超順狗304與3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反應，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒，然后與PEG連接；再將LMP1，Clone CS. 1-4和帶有PEG連接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中攪拌過夜；借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，再經過洗滌，分散得到的磁共振對比劑。Fe3O4與APTES反應摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘_1小時。!^e3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應摩爾比為0. 1 1-20 1，兩者反應30 分鐘-1小時。
帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和LMPl，Clone CS. 1-4以Fii3O4/單抗的摩爾比1 1-100 1混合反應。Fe3O4與APTES的摩爾比優選為1 1-10 1，Fe3O4與PEG摩爾比優選為 1 1-10 1，帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和 LMPl,Clone CS. 1—4 以Fii3O4/ 單抗的摩爾比優選為10 1-100 1。一種鼻咽癌靶向磁共振對比劑的制備方法，將超順磁性!^e3O4與3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反應，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒， 然后與PEG連接；再將LMP1，Clone CS. 1-4和帶有PEG連接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中攪拌過夜；借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，再經過洗滌，分散得到磁共振對比劑。所述的超順Fe53O4是采用化學共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。!^e3O4與APTES反應摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘_1小時； Fe3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘-1小時；帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和LMP1，Clone CS. 1-4以!^e3O4/單抗的摩爾比1 1-100 1混合反應。一種LMPl+-鼻咽癌特異性陰性磁共振對比劑是運用Discovery Studio和 Autodock等計算機模擬藥物分子設計軟件構建的分子設計平臺進行設計，并通過以上方法制備而成。本發明的優勢本發明制備的LMPl+-鼻咽癌特異性陰性磁共振對比劑，所產生的!^e3O4-LMPl是生物相容性好的磁共振對比劑，具有超順磁性。體外細胞學實驗證實，該對比劑對血細胞形態無明顯影響，對腎細胞生長無明顯影響，體內大鼠急性動物實驗證實，該對比劑安全性好， 無1例動物死亡，可以從腎臟排除，不存在體內長期聚集問題。解決了常規含釓對比劑腎臟等毒性問題，解決了常規狗304生物相容性差，易聚集于受體肝脾等網狀內皮系統的問題。本發明制備的LMPl+-鼻咽癌特異性陰性磁共振對比劑，體外細胞學實驗證實， 磁性細胞分選儀顯示其敏感性為85.9%，同時，它具有高度特異靶向LMP-Γ鼻咽癌細胞 (CNE1-LMP1細胞株)的能力，特異性為75. 51 %，體內裸鼠荷瘤模型MR成像實驗證實，其對 LMP-I+鼻咽癌腫瘤顯像的敏感性及特異性為85. 7%及71. 4%，且具有高馳豫性能，該對比劑在主要聚集于LMP-Γ鼻咽癌瘤灶區。解決了常規磁共振對比劑低馳豫性能，對鼻咽癌低敏感性及低特異性，MRI診斷正確率低的問題。本發明制備的!^3O4-Aptes-Peg-LMPI,Clone CS. 1-4 磁共振對比劑，經 APTES、PE6 與LMPl，Clone CS. 1-4表面改性及修飾后，具有良好的分散性能，解決了顆粒團聚易至動物死亡的問題，提升其臨床應用價值。
圖1為本發明的主要工藝流程圖及檢測實驗步驟示意圖；圖 2Fi5304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 與 LMP-Γ 鼻咽癌進行特異性結合光學顯微圖(X1000)；2-1為LMPl靶向對比劑與CNE1-LMP1細胞共孵后油鏡下成像；4/8頁2-2為LMPl靶向對比劑與CNEl細胞共孵后油鏡下成像；圖 3Fi5304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 與 LMP-Γ 鼻咽癌靴共孵后 MRI 成像圖； 肉眼觀察即可發現T2WI信號強度降低程度隨著細胞數量級的遞增；圖 4Fe304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 對荷鼻咽癌 LMPl+ 和鼻咽癌 LMPr 雙瘤動物MRI成像圖；4-1，4-2分別為裸鼠T1、T2序列圖像，證明模型造瘤成功，箭頭所指為CNE+LMP1腫瘤，4-3為經裸鼠尾靜脈注射LMPl-Fe3O4后在Τ2序列，可見右側LMPl+信號明顯降低，而左側LMPr鼻咽癌腫塊信號無明顯變化。圖5荷鼻咽癌LMPl+和鼻咽癌LMP1—雙瘤動物模型LMPl抗原表達的免疫組化分析圖(Χ200)；5-1為LMPl+鼻咽癌細胞細胞膜上見棕黃色染色，LMPl表達陽性；5-2為LMPl-鼻咽癌細胞表達LMPl陰性；圖 6Fe304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 增強掃描后，對荷鼻咽癌 LMPl+ 和鼻咽癌LMP1_雙瘤動物普魯士蘭染色圖；6-l，CNEl_LMPl移植瘤腫塊組織內見大量、顯示清晰的藍染鐵顆粒，說明腫瘤組織中LMPl靶向對比劑聚集良好；6-2，CNEl移植瘤腫塊組織內只可見少許藍染鐵顆粒(箭頭所示)。與前圖相比差異明顯，從而表明LMPl靶向!^e3O4對于裸小鼠荷人鼻咽癌CNE1-LMP1 移植瘤腫塊具有一定的靶向效應。
具體實施例方式以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例1取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比0.1 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比0.1 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸酰，用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/ml。實施例2 取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBQ溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液
6轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比0.1 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比0.1 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/ml。實施例3取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBQ溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比0.1 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比0.1 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(己烯基雙硬脂酰胺.用量為0. 5% 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/ml。。實施例4取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBQ溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比1 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比1 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(己烯基雙硬脂酰胺.用量為0. 5% 2% )超聲分散 30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/ml。。實施例5
取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比1 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比1 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(聚乙烯醇PVA.用量為2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實施例6取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比1 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比1 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/單抗的摩爾比100 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(聚乙烯醇PVA.用量為2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實施例7 取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比10 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比10 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸.用量0. 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實施例8取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比10 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比10 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實施例9取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比10 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比10 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比100 1取PEG連接的APTES修飾的!^e3O4納米磁流體和LMPl,Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/ml。實施例10取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比20 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比20 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實施例11取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比20 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比20 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸.用量0. 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實施例12 取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調pH值至8_9，繼續攪拌lh。將混合溶液轉入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉入三口瓶中，此時先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比20 1，溶解于水中進行混合。將該混合物置于純氬氣環境中，回流半小時，使磁鐵礦結晶，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子。產生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比20 1反應半小時，進行共價偶聯，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比100 1取PEG連接的APTES修飾的!^e3O4納米磁流體和LMPl,Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過夜。借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經透析除去雜質后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸.用量0. 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對比劑的濃度為0. 25mmol/mL·
權利要求
1.一種鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于，是用3-氨丙基三乙氧基硅烷包覆或連接到超順磁性四氧化三鐵上，使狗304表面氨基化，得到!^3O4-APTES表面改性微粒，再將聚乙二醇作為!^3O4-APTES表面改性微粒與EB病毒潛伏膜蛋白1單克隆抗體之間的連接臂， 將二者連接起來，得到的分散穩定的i^OfAPTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4膠體溶液。
2.根據權利要求1所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于，所述的超順!^e3O4是采用化學共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。
3.根據權利要求1所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于， Fe3O4-APTES-PEG-LMPl, Clone CS. 1-4 膠體微粒粒徑為 20_30nm。
4.根據權利要求1或2或3所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于，所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑是將超順磁性!^e3O4與3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反應，通過離心， 超濾，和透析純化納米粒子；得到!^e3O4-APTES表面改性微粒，然后與PEG連接；再將LMP1， Clone CS. 1_4和帶有PEG連接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中攪拌過夜；借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，再經過洗滌，分散得到的磁共振對比劑。
5.根據權利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于，Fe3O4與APTES反應摩爾比為0.1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘-1小時。
6.根據權利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于，Fe3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘-1小時。
7.根據權利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振對比劑，其特征在于，帶有PEG連接臂的 Fe3O4-APTES 表面改性微粒和 LMPl，Clone CS. 1_4 以!^e3O4/單抗的摩爾比 1 1-100 1 混合反應。
8.—種鼻咽癌靶向磁共振對比劑的制備方法，其特征在于，將超順磁性狗304與3_氨丙基三乙氧基硅烷混合反應，通過離心，超濾，和透析純化納米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒，然后與PEG連接；再將LMP1，Clone CS. 1-4和帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中攪拌過夜；借助于外磁場的作用對產物進行磁性分離，再經過洗滌， 分散得到磁共振對比劑。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的超順!^e3O4是采用化學共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，！^e3O4與APTES反應摩爾比為 0. 1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘-1小時Je3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應30分鐘-1小時；帶有PEG連接臂的Fe3O4-APTES表面改性微粒和LMP1，Clone CS. 1_4以Fii3O4/單抗的摩爾比1 1-100 1混合反應。
全文摘要
本發明公開了一種鼻咽癌靶向磁共振對比劑及其制備方法，該對比劑是采用化學共沉淀的方法合成粒徑約10-15nm的超順磁性Fe3O4，用APTES包覆或連接到10-15nm的Fe3O4上，使Fe3O4表面氨基化，得到Fe3O4-APTES表面改性微粒，聚乙二醇作為Fe3O4-APTES與EB病毒潛伏膜蛋白1單克隆抗體(LMP1，Clone CS.1-4)之間的連接臂，將二者連接起來，得到分散穩定的Fe3O4-APTES-PEG-LMP1，Clone CS.1-4膠體溶液，本發明的對比劑與現有常規對比劑相比，具有低毒，高穩定性，好的生物相容性，高敏感性，對LMP1+鼻咽癌具有好的特異靶向性，可以用于鼻咽癌篩查和特異性磁共振診斷。
文檔編號A61K49/16GK102552944SQ20121001607
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者劉晟, 周科朝, 容鵬飛, 張聲旺, 曾文彬, 王維, 鄒蟠 申請人:中南大學