專利名稱：一種含mf59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于疫苗制備領域，尤其是一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝。
背景技術：
禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是一種由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起的傳染性疾病，被國際獸疫局定為甲類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，也能感染人類，人感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很聞。鋁佐劑用于疫苗已有80多年，但近來有資料顯示在疫苗制備中使用鋁佐劑后出現免疫抑制和中毒現象，使用量過小吸附不完全，過大吸附完全但存在安全性。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，而提供一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，將R1203禽流感病毒株接種于雞胚，經培養、收獲病毒液、滅活病毒和純化、裂解、再純化等生產工藝制成。本發明采用MF59佐劑生產禽流感裂解疫苗，加入該佐劑比不加佐劑和加入氫氧化鋁佐劑生產的疫苗更加安全和有效。本發明解決其技術問題采用的技術方案這種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，該方法步驟如下(I)、病毒接種與培養于雞胚尿囊腔接種經稀釋的禽流感工作種子批毒種，置 33 35°C培養48 72小時；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時間冷胚后，收獲尿囊液于容器內，澄清過濾后逐容器取樣進行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測定蛋白含量，控制蛋白質含量在不超過5mg/ ml的范圍內進行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醒,置 2_8°C滅活15 24小時，滅活結束分別對每個病毒滅活容器采樣，進行病毒滅活驗證試驗和細菌內毒素含量測定；(4)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液經澄清處理，然后用截留分子量為1000KD 的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；(5)、病毒純化(5. I)蔗糖速率區帶離心在靜止時以不超過離心腔容積50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同時調節機器轉速至35000r/min 40000r/min,連續泵入病毒液,進樣完畢，泵入緩沖液后，調節轉速至Or/min，待機器停穩，在280nm波長監測下，收集病毒峰；(5. 2)柱層析用S印hix)Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的 8%，洗脫液為O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測波長為280nm，收集第一峰，純化后取樣進行蛋白質含量測定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為O. 3 O. 5% Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘，然后梯度離心2小時，在280nm波長監測下收集第一峰；(7)、除糖除裂解劑將離心后的裂解物用無菌O. OlM pH7. 2PBS溶液進行超濾濃縮，以去除蔗糖并進一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測細菌內毒素含量和微生物限度，控制細菌內毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經O. 22 μ m孔徑的濾膜過濾即為單價原液，單價原液應置于2-8 °C保存。更進一步的，半成品配制根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為30 μ g/ml，按50%的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經O. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。本發明有益的效果是I.用MF59佐劑制備的疫苗免疫原性強，能產生更高的抗體應答；2.對接種常規疫苗后不能產生免疫應答或免疫應答較低的兒童和老年人能增強其免疫力；3.能對不同流感病毒亞型產生交叉免疫；4.在保持免疫力不變的前提下可以降低抗原含量，同時降低了能引起副反應的雜蛋白含量，因而疫苗的副反應更低低、安全性更好，不會出現毒力返強和變異的危險。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明本發明采用MF59佐劑制備禽流感裂解疫苗。MF59是目前全世界公認的最好佐劑， 是一種水包油的乳劑，包含I %鯊烯，O. 5% Tween80和O. 5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液。它能激發已經衰退的免疫應答，加強機體對病毒的免疫應答，使機體產生更強大的免疫保護效力，MF59在國外已應用于流感疫苗中，證明能增強兒童和老年人的免疫效力，并能對不同流感病毒亞型產生交叉免疫。本發明所述的這種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，該方法步驟如下(I)、病毒接種與培養于雞胚尿囊腔接種經稀釋的禽流感工作種子批毒種，置 33 35°C培養48 72小時；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時間冷胚后，收獲尿囊液于容器內，澄清過濾后逐容器取樣進行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測定蛋白含量，控制蛋白質含量在不超過5mg/ ml的范圍內進行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醒,置 2_8°C滅活15 24小時，滅活結束分別對每個病毒滅活容器采樣，進行病毒滅活驗證試驗和細菌內毒素含量測定；(4)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液經澄清處理，然后用截留分子量為1000KD 的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；
(5)、病毒純化(5.1)蔗糖速率區帶離心在靜止時以不超過離心腔容積50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同時調節機器轉速至35000r/min 40000r/min,連續泵入病毒液,進樣完畢，泵入緩沖液后，調節轉速至Or/min，待機器停穩，在280nm波長監測下，收集病毒峰；(5. 2)柱層析用S印hix)Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的 8%，洗脫液為O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測波長為 280nm，收集第一峰，純化后取樣進行蛋白質含量測定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為O. 3 O. 5% Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘，然后梯度離心2小時，在280nm波長監測下收集第一峰；(7)、除糖除裂解劑將離心后的裂解物用無菌O. OlM pH7. 2PBS溶液進行超濾濃縮，以去除蔗糖并進一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測細菌內毒素含量和微生物限度，控制細菌內毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾即為單價原液，單價原液應置于2-8 °C保存。更進一步的，半成品配制根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為30 μ g/ml，按50%的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。各項檢驗項目經檢測后，結果顯示均符合國家藥典標準。注本發明中提到的百分比濃度，除特別標注的，其他均為體積百分比濃度。除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
權利要求
1.一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，其特征是該方法步驟如下(1)、病毒接種與培養于雞胚尿囊腔接種經稀釋的禽流感工作種子批毒種，置33 35°C培養48 72小時；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時間冷胚后，收獲尿囊液于容器內，澄清過濾后逐容器取樣進行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測定蛋白含量，控制蛋白質含量在不超過5mg/ml的范圍內進行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醒,置2-8°C滅活15 24小時，滅活結束分別對每個病毒滅活容器采樣，進行病毒滅活驗證試驗和細菌內毒素含量測定；(4)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液經澄清處理，然后用截留分子量為1000KD的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；(5)、病毒純化(5. I)蔗糖速率區帶離心在靜止時以不超過離心腔容積50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同時調節機器轉速至35000r/min 40000r/min,連續泵入病毒液,進樣完畢,泵入緩沖液后，調節轉速至Or/min，待機器停穩，在280nm波長監測下，收集病毒峰；(5. 2)柱層析用S印hix)Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的8%，洗脫液為O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測波長為280nm， 收集第一峰，純化后取樣進行蛋白質含量測定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為O.3 O. 5% Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘，然后梯度離心2小時，在280nm波長監測下收集第一峰；(7)、除糖除裂解劑將離心后的裂解物用無菌O.OlM pH7. 2PBS溶液進行超濾濃縮，以去除蔗糖并進一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測細菌內毒素含量和微生物限度，控制細菌內毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經0.22 μ m孔徑的濾膜過濾即為單價原液，單價原液應置于2-8°C保存。
2.根據權利要求I所述的含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，其特征是半成品配制根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為30yg/ml，按50%的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。
全文摘要
本發明公開了一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，將R1203禽流感病毒株接種于雞胚，經病毒接種與培養、收獲病毒液、滅活病毒和純化、裂解、再純化、除菌過濾等生產工藝制成。本發明有益的效果是用MF59佐劑制備的疫苗免疫原性強，能產生更高的抗體應答；對接種常規疫苗后不能產生免疫應答或免疫應答較低的兒童和老年人能增強其免疫力；能對不同流感病毒亞型產生交叉免疫；在保持免疫力不變的前提下可以降低抗原含量，同時降低了能引起副反應的雜蛋白含量，因而疫苗的副反應更低低、安全性更好，不會出現毒力返強和變異的危險。
文檔編號A61P31/16GK102600468SQ20121005121
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者姚偉, 朱智勇, 蘇波, 蔣正東, 郭志軍, 鐘建琴 申請人:浙江天元生物藥業有限公司