專利名稱：一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥技術領域的新型抗病毒生物制劑，具體是涉及一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(HPV)屬于乳頭瘤病毒科(papillomaviridae),是一類嗜上皮性無囊膜雙鏈DNA病毒。目前為止，在人體的皮膚及粘膜組織中分離出的HPV可根據DNA序列的不同被劃分為100多個型別。又可根據其致癌性可分為“低危”型和“高危”型。前者低危型流行度高的代表類型為HPV6、HPVll等，主要引起良性的生殖器疣和低度的宮頸上皮 壞死；后者高危型流行度高的代表類型為HPV16、HPV18等，它們的感染是引發組織惡性腫瘤尤其是宮頸癌的主要原因。宮頸癌已成為危害女性健康的第二大惡性腫瘤，研究發現99. 7%以上的宮頸癌病理組織中能夠檢測到HPV的DNA，因而宮頸癌成為第一個由世界衛生組織(WHO)確認的完全由HPV感染所引起的癌癥。目前，該疾病在全球每年新發病例約50萬例。我國每年新發病例約13. 5萬，約占世界宮頸癌新發病例總數的1/4，死亡人數約為5萬人。特別是近十年來，其發病率飆升，增長幅度高達68. 8%，成為死亡率增長最快的疾病，居婦女癌癥的首位。隨著我國性開放程度的加深，宮頸癌的發病率及發病年齡可能將有明顯上升及提前的趨勢。因此，目前我國急需能夠有效預防和控制HPV病毒感染的藥物及生物制劑。人乳頭瘤病毒以人作為唯一宿主，感染人體皮膚組織和黏膜組織的上皮細胞，尤其集中在口腔、手腳和男女生殖器等部位。病毒與細胞的直接接觸是HPV感染宿主必要的先決條件，當皮膚或黏膜表層的物理組織保護受損，導致組織細胞暴露于游離的成熟病毒，病毒就有機會通過這種上皮細胞的微創傷侵犯并進入細胞，這通常被認為是病毒生命周期的開始階段，也是預防的最佳階段。同樣，當病毒成熟后也會從細胞中釋放，從而感染新的細胞，在口腔、手腳及男女生殖器處造成更多的感染及病變，最后導致病情的擴大、惡化及最后免疫系統無法清除形成尖銳濕疣、宮頸糜爛、慢性宮頸炎甚至腫瘤。目前，在國際上能有效預防和控制HPV病毒感染的藥物還相對缺乏，公認療效顯著的主要還是預防型的疫苗，臨床證實HPV的疫苗幾乎能100%地預防一些HPV病毒株的感染，但是它并不能預防所有類型病毒株的感染，并且價格高昂。而在治療上由于沒有特效藥因而采用的免疫調節藥物由于普遍存在無法有效地預防HPV感染、療效不明確、價格昂貴等方面的缺陷而大大限制了其在臨床上的使用，特別是在低收入的發展中國家。因此，現在國際國內都傾注了極大的熱情在研發新型的對多種HPV毒株都具有預防及控制效應的藥物及生物制劑上，但是一直沒有突破性的進展。本專利發明人之一的姜世勃教授是國際著名病毒學家，長期從事抗病毒藥物的研究，其在國際上發現了第一個抗艾滋病病毒的C-多肽-SJ-2176，用于開發抗HIV藥物-恩夫韋肽(Enfuvirtide，T-20)。Enfuvirtide在2003年被美國FDA批準上市成為全世界第一個多肽類HIV進入/融合抑制劑，該藥物的發現被視為艾滋病藥物研究領域的一個里程碑，姜世勃教授也因此開辟了多肽蛋白類病毒進入/融合抑制劑的新領域。病毒進入/融合抑制劑就是作用在病毒入侵靶細胞的第一階段，阻斷了病毒對細胞的感染，從而達到預防和控制病毒的效果，Enfuvirtide在美國臨床上使用的成功證明了該策略對治療病毒所引發的疾病是非常有效的。本發明專利建立在姜世勃教授多年研究的基礎上，是將預防及控制艾滋病病毒的成功經驗運用到了對人乳頭瘤病毒HPV的預防和控制上，經過實驗檢測該蛋白藥物對HPV的感染具有顯著的抑制活性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方
法。 本發明的發明思路是發明人利用多肽蛋白類病毒進入/融合抑制劑，在病毒入侵靶細胞的第一階段，阻斷了病毒對細胞的感染，從而達到預防和控制病毒的效果。使用一種活性酸酐來修飾一種分離和純化的蛋白質表面帶正電荷的氨基酸，從而使其具有阻斷人乳頭瘤病毒HPV進入和感染靶細胞的功能。本發明是采用如下技術方案實現的
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
將3_輕基-鄰苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalicanhydride,縮寫HP)溶于二甲基亞諷DMSO中，得到飽和的HP溶液；將￠-乳球蛋白@-1^溶于？118.5，0. IM磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為20mg/mL的蛋白溶液；再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，每次加完后用IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM，在溫度為25°C的條件下，放置I小時，pH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用0. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，即可制得成品。所述的0 -乳球蛋白從牛奶中分離及純化得到。所述的e -乳球蛋白用雞血清蛋白0VA、兔血清蛋白RSA、豬血清白蛋白PSA、冷水魚皮明膠G-FS、豬皮明膠G-PS代替。所述的3-羥基-鄰苯二甲酸酐用3-羥基-鄰苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalicanhydride)的衍生物、玻拍酸酐(Succinic anhydride)、馬來酸酐(maleic anhydride)酸酐代替。所述的劑型可以是凝膠制劑、膏霜劑、噴霧劑、搽洗劑、盥洗劑。本發明藥物具有阻斷HPV病毒入侵細胞、阻止病毒擴大感染、安全無毒副作用、穩定性高、成本低廉等顯著優勢，可用于開發成為以其為主要活性成分的預防和控制HPV感染的各種劑型，制備方法簡單，易于推廣。
圖I 為 HPV6 (6S)、HPV16 (16S)及 HPV18(18S)假病毒質粒鑒定結果；
圖2為對HPV6抑制活性的檢測；
圖3為對HPV16抑制活性的檢測；
圖4為對HPV18抑制活性的檢測。
具體實施例方式實驗例I
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
(1)從牛奶制品中分離及純化￠-乳球蛋白為主的穩定性蛋白質；
(2)利用活性酸酐對分離純化的蛋白質進行酸酐化，透析后再次純化活性蛋白；
首先將3-羥基-鄰苯二甲酸酐(HP)溶于二甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和，然后將
^ -乳球蛋白(P -LG)溶于pH8. 5,0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL，再將上述HP加入蛋白溶液中，震蕩混勻，在溫度為25°C的條件下，放置I小時，pH7.4 PBS透析，再用 0. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成凝膠劑。實驗例2
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
首先將HP溶于二甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和，然后將雞血清蛋白OVA溶于pH8. 5，0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL，再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM。在溫度為25°C的條件下，放置I小時，pH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用0. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成膏霜劑。實驗例3
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
首先將HP溶于二甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和(I. 19M)，然后將兔血清蛋白RSA溶于pH8. 5,0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL，再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM。在溫度為25°C的條件下，放置I小時，pH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用0. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成噴霧劑。實驗例4
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
首先將HP溶于二甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和(I. 19M)，然后將豬血清白蛋白PSA、冷水魚皮明膠G-FS、或者豬皮明膠G-PS溶于pH8. 5,0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL,再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM。在溫度為25°C的條件下，放置I小時，pH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用0. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成搽洗劑。實驗例5
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
首先將3-羥基-鄰苯二甲酸酐的衍生物溶于二甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和(I. 19M)，然后將雞血清蛋白OVA溶于pH8. 5,0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL，再將上述3-羥基-鄰苯二甲酸酐的衍生物溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM。在溫度為25°C的條件下，放置I小時，PH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用0. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成灌洗劑。
實驗例6
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟
首先將琥珀酸酐溶于ニ甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和(I. 19M)，然后將兔血清蛋白RSA溶于pH8. 5,0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL，再將上述琥珀酸酐溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM。在溫度為25°C的條件下，放置I小吋，pH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用O. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成凝膠劑。實驗例7
一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟 首先將馬來酸酐溶于ニ甲基亞颯DMSO中，濃度達到飽和(I. 19M)，然后將豬血清白蛋白PSA、冷水魚皮明膠G-FS、或者豬皮明膠G-PS溶于pH8. 5，0. IM磷酸鈉溶液中，使蛋白終濃度為20mg/mL，再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IMNaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM。在溫度為25°C的條件下，放置I小吋，pH7. 4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用O. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，然后按照現有方法制成膏霜劑。實驗例8酸酐修飾蛋白濃度測定
合成的酸酐修飾蛋白濃度按照BCA蛋白濃度分析試劑盒的操作步驟測定，具體方法如
下
(1)稀釋BSA 蛋白標準品，使終濃度為 0，25，125，250，500，750，1000，2000ug/mL,標準品的稀釋與待測蛋白樣品溶液相同；
(2)分別將25ul各濃度標準品和25ul待測樣品加入96孔圓底細胞板中，復孔對照；
(3)制備反應工作液,將ReagentA與ReagentB按50:1比例混勻;
(4)每孔200ul反應工作液，輕柔震蕩30s，混勻；
(5)37°C孵育30min，冷卻至室溫，680型酶標儀測定0D562nm吸光度；
(6)繪制蛋白質濃度標準曲線，根據標準曲線，計算待測樣品濃度。實驗例9 TNBS法及ρ-HPG法測定蛋白的酸酐修飾比率，及檢測正電荷氨基一酸賴氨酸和精氨酸殘基的被修飾率
采用2,4,6—三硝基苯磺酸(TNBS)檢測修飾后蛋白末端的賴氨酸殘基被相應酸酐修飾的比率。(I)系列稀釋的待測酸配修飾蛋白樣品與陰性對照未修飾的蛋白各25ul加入96孔圓底細胞培養板中，空白對照孔加入25ul/孔O. IM磷酸鈉溶液；
(2)25ul/孔的O. IM四硼酸鈉Na2B407:與各待測樣品室溫混勻5min;各孔加入IOul的，TNBS，室溫混勻，5min;
(3)加入 IOOul/ 孔的終止液(O. IM NaH2PO4;和 I. 5mM Na2SO3)，終止反應，測 0D420nm值，根據其與陰性對照蛋白OD值差異，計算賴氨酸的修飾率。(4)賴氨酸修飾率 ％=[l-(0D450nm 樣品 _0D450nm 空白)バ0D450nm 陰性 _0D450nm空白)]xlOO
采用p-HPG檢測合成的修飾蛋白末端的精氨酸殘基被相應酸酐修飾的比率。(I)系列稀釋的待測酸配修飾蛋白樣品與陰性對照未修飾的蛋白各90ul加入96孔圓底細胞培養板中，空白對照孔加入90uL/孔O. IM磷酸鈉溶液，調節各孔溶液pH為9. O;
(2)IOuL/孔50M1 p-HPG, pH9. 0，與各樣品室溫避光反應90min;
(3)測0D340nm值，計算精氨酸的修飾率。(4)精氨酸修飾率％=[l-(0D450nm樣品-0D450nm空白)バ0D450nm陰性_0D450nm空白)]X 100
實驗例10 構建不同型HPV的假病毒感染模型(以HPV6、HPV16、HPV18為代表株)目前認為生產假病毒是模擬HPV感染最有效的方法。HPV結構蛋白基因在哺乳動物細胞中可表達衣殼蛋白LI、L2，這兩種蛋白在體外具有自我組裝成病毒樣顆粒(Virus-likeparticle, VLP)并包裹病毒基因組或外源基因的能力，形成與天然病毒結構及免疫原性一致的假病毒(PsV)。Buck等人在國際頂級病毒學期刊〈C/ KirW》上報道他們利用該發現以 及PsV能非特異包裝DNA的特性，將含優化的HPV LI、L2基因的質粒與報告基因表達質粒共轉染哺乳動物細胞，使LI、L2結構蛋白在哺乳動物細胞中能夠高效表達并自我組裝成包裹報告質粒的病毒樣顆粒，即攜帶報告基因的假病毒。利用該方法構建的假病毒滴度較高，最高可達到IO7 TU/ml (transdueingunitsperml),且試驗操作簡單結果穩定可靠，因此該HPV假病毒系統目前被廣泛的用于抗HPV疫苗及藥物的篩選與鑒定。發明人建立起了 HPV假病毒抑制模型，包括代表毒株HPV6、HPV16、HPV18。具體的方法如下
(1)利用分子生物學技術分別克隆HPV6、HPV16及HPV18的LI及L2衣殼蛋白DNA構建到真核表達載體中，形成可以穩定表達LI及L2的表達質粒HPV6^S) p6sheLLr,HPV16(16S) :pl6sheLL、HPV18(18S)pl8sheLL，用 BamHI 酶切鑒定，如圖 I 中所示酶切鑒定結果正確；
(2)利用Qiagen大提質粒試劑盒純化以上構建正確的重組質粒，檢測獲得純度高的質粒準備轉染293FT細胞。胰酶消化293FT細胞，計數，將5xl05個細胞/ ml接種于6孔板中，DMEM 培養基，10% FBS (Gibco), 37°C, 5% C02 培養過夜。(3)利用LipofectamineTM2000轉染試劑分別將大提的質粒(p6sheLLr、pl6sheLL、pl8sheLL)與報告質粒pCLucf (含有Luciferase報告基因)共轉染到293FT細胞，同時設單獨轉染報告質粒的陰性對照。(4)將6孔板重新置于細胞培養箱中，37°C，5% C02孵育6小時后為細胞換液。轉染48小時后收集細胞。(5)轉染48小時后的細胞，棄去培養基，用胰酶消化細胞，完全培養基終止，將細胞懸液移至50ml離心管中，離心210g, 5 min,棄上清,用Iml DPBS-Mg(9. 5mM MgC12溶于IxPBS中)將細胞重新懸起，將細胞懸液轉移至I. 5ml離心管中，離心棄上清。向含細胞沉淀的離心管中加入與細胞沉淀等體積的細胞裂解液(O. 3% Brij58,9. 5mM MgCl2溶于IxPBS中)，混勻，放至培養箱中，37°C孵育24小吋。取出細胞裂解液，冰浴5 min，加入O. 17倍體積的5M的NaCl溶液，使鹽濃度調整為850mmol/L，冰浴10-20 min,離心5000g，10 min。取上清，分裝、-80度保存。(6)進行假病毒滴度的測定
1)鋪100μ1293ΡΤ細胞于96孔培養板中，每孔細胞數為IxlO5個，37°C，5%C02培養6-8小時；
2)將HPV6、HPV16、HPV18假病毒分別進行梯度稀釋，在已有細胞的96孔板中加入50μ1假病毒稀釋液，再加入50μ1新鮮的培養基(帶血清)；
3)將細胞培養板置于37°C，5%C0的培養箱中培養48-72小時；
4)用PromegaLuciferase報告基因檢測試劑盒進行細胞裂解及檢測，以此計算TCID50 (病毒感染一半組織細胞時的病毒稀釋度。實驗例11 :本發明制備的產品對HPV6、HPV16和HPV18抑制活性的檢測
利用以上先進的HPV感染模型，檢測JBOl對HPV6、HPV16和HPV18的抑制活性，具體方法為
Cl)鋪100μ1293ΡΤ細胞于96孔培養板中，每孔細胞數為IxlO5個，37°C，5% C02培養6-8小時；
(2)將100TCID50的HPV6、HPV16、HPV18假病毒(50μ1)分別與不同稀釋度的JBOl(50μ1)進行孵育，37 °C，30 min ；將孵育后的混合物加入到預鋪的293FT細胞中，37 °C，5%C02培養，培養過夜；
(3)第二天，棄上清，補充150μ 新鮮的培養基，37°C，5% C02培養；
(4)48-72小時后用Promega Luciferase報告基因檢測試劑盒進行細胞裂解及檢測，利用Compusyn I. O和SigmaPlot軟件進行計算抑制病毒的IC50。同樣用以上的方法檢測不同修飾度的JBOl對HPV6、HPV16和HPV18的抑制活性。從圖2-4中我們可以發現酸酐修飾后的β -乳球蛋白(JBOl)對HPV6、HPV16及HPV18病毒具有顯著的抑制活性，其IC50 (半數抑制濃度)分別約為5Pg/ml、lPg/ml和Wg/ml ο而其對照蛋白(未修飾的β-乳球蛋白，C protein)沒有觀察到明顯地梯度性抑制，IC50均大于500 Pg/ml。從不同修飾度的JBOl對各種HPV病毒的抑制上看，如表I示，該活性蛋白的抑制活性與其上正電荷氨基酸被修飾的程度密切相關，隨著正電荷氨基酸被修飾程度的加深，其抑制活性逐漸增高。我們原先的結果發現JBOl對不同種類的病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)以及單純皰疹病毒(HSV-1，HSV-2)等都有顯著的抑制活性，因此我們推測該活性蛋白對HPV的作用機制不是特異性的，很可能與其酸酐化修飾后所帶的電性相關。本酸酐方法所修飾后的蛋白也可能用于其他病毒的控制。表I JBOl的酸酐化修飾率與其抗HPV活性的關系
權利要求
1.一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是包括以下步驟將3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP溶于二甲基亞颯DMSO中，得到飽和的HP溶液；將β -乳球蛋白β-LG溶于pH8. 5,0. IM磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為20mg/mL的蛋白溶液；再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，IM NaOH調節pH為8. 5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM，在溫度為25°C的條件下，放置I小時，pH7. 4 PBS透析，再用O. 45uM微孔濾膜過濾除菌，4°C保存，即可按照常規方法制成各種劑型的成品。
2.根據權利要求I所述的一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的β-乳球蛋白從牛奶中分離及純化得到。
3.根據權利要求I所述的一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的β -乳球蛋白用雞血清蛋白0VA、兔血清蛋白RSA、豬血清白蛋白PSA、冷水魚皮明膠G-FS、豬皮明膠G-PS代替。
4.根據權利要求I或2所述的一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的3-羥基-鄰苯二甲酸酐用3-羥基-鄰苯二甲酸酐的衍生物、琥珀酸酐、馬來酸酐代替。
5.根據權利要求I或2所述的一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的劑型為凝膠制劑、膏霜劑、噴霧劑、搽洗劑、盥洗劑。
全文摘要
本發明公開了一種預防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法。包括以下步驟將3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP溶于二甲基亞颯DMSO中，得到飽和的HP溶液；將β-乳球蛋白β-LG溶于pH8.5，0.1M磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為20mg/mL的蛋白溶液；再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，1MNaOH調節pH為8.5，酸酐在反應體系中的終濃度為60mM，在溫度為25℃的條件下，放置l小時，pH7.4PBS透析，再用0.45uM微孔濾膜過濾除菌，4℃保存，即得成品。本發明藥物具有阻斷HPV病毒入侵細胞、阻止病毒擴大感染、安全、穩定、成本低等優點。
文檔編號A61P31/20GK102631666SQ20121006669
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者姜世勃, 楊霞, 陸路 申請人:姜世勃, 楊霞, 陸路