專利名稱：天然普魯蘭多糖納米藥物載體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于藥物載體領域，特別涉及天然普魯蘭多糖納米藥物載體及其制備方法。
背景技術：
藥物載體是一種藥物傳送系統，智能型納米藥物載體有利于實現靶向給藥，征服癌癥等疑難病癥。腫瘤組織由于其組織的特點，可使納米粒子藥物傳送系統經EPR現象被動集中于腫瘤部位，以內吞的形式攝入胞內。在胞內的初級溶酶體及次級溶酶體內，由于其內部PH值低于人體血液循環系統的pH值，這種pH的變化使納米粒子藥物傳送系統所載藥物與其在酸性條件下分離，從而實現腫瘤的環境敏感型被動靶向治療。因此，納米粒子藥物載體的研究一直倍受關注。Ludianxiang等人公開了一種具有pH敏感性的納米藥物載體[見“Journal of BiomedicalMaterials Research (part B)”, 89(B)卷第一期 177-183 頁，(2009 年)],所述納米藥物載體由羧甲基化的普魯蘭多糖和水合肼縮合反應而成，雖然具有良好的生物相容性，且對心臟毒性小，但由于羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與水合肼的氨基的縮合反應度僅為10%左右，因而載藥量偏低(只有3% -4% )。Rong Liu等人研究了一種具有pH敏感性的聚乙二醇-聚(L-組氨酸)_聚(L-丙交酯)三嵌段共聚物納米藥物傳遞系統[見“Journal of Controlled Release”, 152卷 49-56頁，(2011年)]，聚(L-組氨酸)具有pH響應性，所形成的膠束最大載藥量達到了 14. 7% ο但載藥納米粒徑在pH = 7. 4時達到803. 6nm,pH = 5. O時達到1140nm,粒徑過大, 進入體內很難通過EPR效應進入腫瘤部位。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種新型的天然普魯蘭多糖納米藥物載體及制備方法，所述納米藥物載體不僅能提高載藥量，而且能對肝臟靶向性給藥。本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體，由羧甲基化普魯蘭多糖與肼縮合反應而成，結構式如下
O O H Il Il H 或 HN—N—C —C —N—NH,
OO
H Il H2 H2 Il H 或HN—N—C—C -C -C-N-NH2
OO
H Il H2 H2 H2 H2 Il H 或 HN-N—C-C -C -C -C -C-N-NH2η 彡 I ;所述羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與肼的氨基的縮合反應度為60 90%。從上述結構式可以看出，本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體以天然普魯蘭多糖作為主鏈(親水鏈)，在主鏈上連接肼，通過肼作為連接臂連接阿霉素等抗腫瘤藥物， 在水中自組裝形成納米粒子，其粒徑為60nm 200nm。肼與阿霉素等抗腫瘤藥物形成的腙鍵具有PH敏感性，在酸性(pH = I 6)環境中腙鍵將斷裂，釋放出藥物。本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體的載藥操作(以載阿霉素為例)將所述普魯蘭糖納米藥物載體用去離子水配制成濃度為O. I O. 5g/ml的溶液， 然后加入鹽酸阿霉素，所述鹽酸阿霉素的加入量以混合液中普魯蘭糖藥物載體與鹽酸阿霉素的質量比達到I : O. I O. 8為限；在攪拌下于常壓、室溫避光反應至少12小時，反應時間屆滿后，在乙醇中沉淀，離心收集沉淀，反復用乙醇震蕩沖洗以除去未反應的鹽酸阿霉素，將離心所得沉淀真空抽干，即得到載有阿霉素的納米藥物載體。本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體的制備方法，工藝步驟如下(I)將異丙醇加入天然普魯蘭多糖水溶液中，再加入氫氧化鈉水溶液，在常壓、 50 80°C下攪拌，直至形成透明溶液；所述天然普魯蘭多糖水溶液的濃度為O. I O. 5g/ ml，所述異丙醇與天然普魯蘭多糖水溶液體積比為I : 10 7/3 ;所述氫氧化鈉水溶液的濃度為O. I O. 5g/ml，氫氧化鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氫氧化鈉的摩爾比=I I I. 5為限；(2)將氯乙酸鈉水溶液和異丙醇同時加入到步驟(I)所制備的混合溶液中，在攪拌下于常壓、50 80°C反應2 5小時；所述氯乙酸鈉水溶液的濃度為O. 5 I. Og/ml，所述氯乙酸鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氯乙酸鈉的摩爾比 =I O. 5 O. 75為限，所述異丙醇與氯乙酸鈉水溶液的體積比為I : 10 7/3 ;(3)在步驟(2)所得到的反應液中同時加入氯乙酸鈉水溶液和異丙醇，在攪拌下于常壓、50 80°C反應2 5小時，所述氯乙酸鈉水溶液的濃度和加入量與步驟(2)相同， 所述異丙醇的加入量與步驟(2)相同；(4)將步驟(3)形成的含反應產物的混合液用鹽酸調pH值至2 5，然后用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到羧甲基化普魯蘭多糖；(5)用去離子水將步驟(4)得到的羧甲基化普魯蘭多糖配制成濃度為O. 01 O. 10g/ml的溶液,用去離子水將肼配制成濃度為O. I O. 5g/ml的溶液,在攪拌下于室溫、 常壓將羧甲基化普魯蘭多糖水溶液加入到肼的水溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為O. 5 lg/ml的I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應2 6小時， 反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體；所述羧甲基化普魯蘭多糖水溶液與肼的水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與肼的摩爾比達到I : 10 30為限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比達到I : I I. 2為限。上述方法中，所述肼為水合肼、草酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼中的一種。本發明具有以下有益效果I、采用本發明所述方法制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體，所述羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與肼的氨基的縮合反應度為60 90%，因而大大提高了載藥量，最大載藥量接近50% (見實施例4)。2、由于本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體以天然多糖普魯蘭作為主鏈，該主鏈可以跟肝癌細胞的去唾液酸糖蛋白受體相結合，因而可實現對肝臟的靶向性給藥。3、用本發明所述方法制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體，載藥后形成的納米粒子粒度均勻，分散好，不團聚，有利于提高治療效果。4、本發明所述方法原料易于獲取，操作簡單，使用的設備為常規設備，便于工業化生產。
圖I是紅外譜圖，其中，A為羧甲基化普魯蘭糖的紅外譜圖，B為本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體的紅外譜圖，C為本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體載藥后的紅外譜圖。圖2是核磁譜圖，其中，I為本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體的核磁譜圖，2為本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體載藥后的核磁譜圖，3為鹽酸阿霉素的核磁譜圖。圖3是本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體載藥后的粒徑分布圖。圖4是本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體載藥后的透射電鏡圖。圖5是本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體所載阿霉素的藥物釋放曲線圖。圖6是鹽酸阿霉素與載有阿霉素的本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體的體外細胞殺傷效果圖，其中，圖6(1)為對人肝癌細胞殺傷效果實驗結果圖(培養24小時)， 圖6 (2)為對人肝癌細胞殺傷效果實驗結果圖(培養48小時)，圖6 (3)為對人宮頸癌細胞殺傷效果實驗結果圖(培養24小時)，圖6(4)為對人宮頸癌細胞殺傷效果實驗結果圖(培養48小時)，圖6(5)為對正常細胞L929(小鼠成纖維細胞)殺傷效果實驗結果圖(培養 24小時)，圖6(6)為對正常細胞L929(小鼠成纖維細胞)殺傷效果實驗結果圖(培養48 小時)。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體及其制備方法作進一步說明。下述實施例中，所用原料均可從市場購買，所用化學試劑均為分析純。實施例I本實施例的工藝步驟如下(I)將異丙醇加入天然普魯蘭多糖溶水液中，再加入氫氧化鈉水溶液，在常壓、 50°C下攪拌，直至形成透明溶液；所述天然普魯蘭多糖水溶液用去離子水配制，濃度為 O. lg/ml，所述異丙醇與天然普魯蘭多糖水溶液體積比為I : 10 ;所述氫氧化鈉水溶液用去離子水配制，濃度為O. lg/ml，氫氧化鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氫氧化鈉的摩爾比=II為限；(2)將氯乙酸鈉水溶液和異丙醇同時加入到步驟(I)所制備的混合溶液中，在攪拌下于常壓、50°C反應2小時；所述氯乙酸鈉水溶液的濃度為O. 5g/ml，所述氯乙酸鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氯乙酸鈉的摩爾比=I O. 5為限， 所述異丙醇與氯乙酸鈉水溶液的體積比為I : 10 ;(3)在步驟(2)所得到的反應液中同時加入氯乙酸鈉水溶液和異丙醇，在攪拌下于常壓、50°C反應2小時，所述氯乙酸鈉水溶液的濃度和加入量與步驟(2)相同，所述異丙醇的加入量與步驟⑵相同；(4)將步驟(3)形成的含反應產物的混合液用鹽酸調pH值至2，然后用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到羧甲基化普魯蘭多糖；(5)用去離子水將步驟(4)得到的羧甲基化普魯蘭多糖配制成濃度為O. 01g/ml的溶液，用去離子水將水合肼配制成濃度為O. 5g/ml的溶液，在攪拌下于室溫、常壓將羧甲基化普魯蘭多糖水溶液加入到水合肼的水溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為lg/ml的I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應2小時，反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體；所述羧甲基化普魯蘭多糖水溶液與水合肼的水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與水合肼的摩爾比達到I : 30為限，所述I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比達到I : I。本實施例所制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體的紅外譜圖見圖I中的B圖，核磁譜圖見圖2中的I圖。(6)在四個容器中各放入IOOmg本實施例制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體， 然后均用去離子水配制成濃度為5mg/ml的水溶液；將IOmg鹽酸阿霉素、20mg鹽酸阿霉素、 30mg鹽酸阿霉素、40mg鹽酸阿霉素分別加入上述四個容器中，在攪拌下于常壓、室溫避光反應12小時，然后分別用乙醇沉淀，離心收集沉淀，反復沖洗，真空抽干，即得到四種載有阿霉素的天然普魯蘭多糖納米藥物載體，其形貌見圖4，粒徑分布見圖3。該四種載有阿霉素的多糖普魯蘭糖納米藥物載體中，載藥量分別為13. 59%U6. 76%,21. 20%,28. 49%，最大載藥量為28. 49%，由加入40mg鹽酸阿霉素的容器中的反應液獲得。在常壓、37°C下將載藥量為13. 59%的天然普魯蘭多糖納米藥物載體分別放入pH =5. O的PBS緩沖液、PH = 7. 4的PBS緩沖液中，其釋藥曲線見圖5，從圖5可以看出，12個小時內，在pH = 5. O的PBS緩沖液環境中釋放總量達90%，在PH = 7. 4的PBS緩沖液環境中釋放總量在10%以內。實施例2本實施例的工藝步驟如下(I)將異丙醇加入天然普魯蘭多糖水溶液中，再加入氫氧化鈉水溶液，在常壓、 80°C下攪拌，直至形成透明溶液；所述天然普魯蘭多糖水溶液用去離子水配制，濃度為 O. 5g/ml，所述異丙醇與天然普魯蘭多糖水溶液體積比為I : 7/3 ;所述氫氧化鈉水溶液用去離子水配制，濃度為O. 5g/ml，氫氧化鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氫氧化鈉的摩爾比=I I. 5為限；(2)將氯乙酸鈉水溶液和異丙醇同時加入到步驟(I)所制備的混合溶液中，在攪拌下于常壓、80°C反應5小時；所述氯乙酸鈉水溶液的濃度為I. Og/ml，所述氯乙酸鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氯乙酸鈉的摩爾比=I O. 75為限， 所述異丙醇與氯乙酸鈉水溶液的體積比為I : 7/3;(3)在步驟(2)所得到的反應液中同時加入氯乙酸鈉水溶液和異丙醇，在攪拌下于常壓、80°C反應5小時，所述氯乙酸鈉水溶液的濃度和加入量與步驟(2)相同，所述異丙醇的加入量與步驟⑵相同；(4)將步驟(3)形成的含反應產物的混合液用鹽酸調pH值至5，然后用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到羧甲基化普魯蘭多糖；(5)用去離子水將步驟⑷得到的羧甲基化普魯蘭多糖配制成濃度為O. lg/ml的溶液，用去離子水將草酸二酰肼配制成濃度為O. lg/ml的溶液，在攪拌下于室溫、常壓將羧甲基化普魯蘭多糖水溶液加入到草酸二酰肼水溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為O. 5g/ ml的I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應4小時，反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體；所述羧甲基化普魯蘭多糖水溶液與草酸二酰肼水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與草酸二酰肼的摩爾比達到I : 20為限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比達到I : 1.2。本實施例所制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體的紅外譜圖類似于圖I中的B 圖，核磁譜圖類似于圖2中的I圖。(6)在四個容器中各放入IOOmg本實施例制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體， 然后均用去離子水配制成濃度為5mg/ml的水溶液；將20mg鹽酸阿霉素、30mg鹽酸阿霉素、 40mg鹽酸阿霉素、50mg鹽酸阿霉素分別加入上述四個容器中，在攪拌下于常壓、室溫避光反應12小時，然后分別用乙醇沉淀，離心收集沉淀，反復沖洗，真空抽干，即得到四種載有阿霉素的天然普魯蘭多糖納米藥物載體，其外形類似于圖4，粒徑分布類似于圖3。該四種載有阿霉素的天然普魯蘭多糖納米藥物載體中，載藥量分別為10. 58%U5. 54%,27. 23%, 34. 39%，最大載藥量為34. 39%，由加入50mg鹽酸阿霉素的容器中的反應液獲得。在常壓、37°C下將載藥量為15. 54%的天然普魯蘭多糖納米藥物載體分別放入pH =5. O的PBS緩沖液、PH = 7. 4的PBS緩沖液中，其釋藥曲線類似于圖5，在12個小時內， 在pH = 5. O的PBS緩沖液環境中釋放總量達90%，在PH = 7. 4的PBS緩沖液環境中釋放總量在IO 以內。
實施例3本實施例的工藝步驟如下(I)將異丙醇加入天然普魯蘭多糖水溶液中，再加入氫氧化鈉水溶液，在常壓、 60°C下攪拌，直至形成透明溶液；所述天然普魯蘭多糖水溶液用去離子水配制，濃度為 O. 3g/ml，所述異丙醇與天然普魯蘭多糖水溶液體積比為I : 9 ;所述氫氧化鈉水溶液用去離子水配制，濃度為O. 2g/ml，氫氧化鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氫氧化鈉的摩爾比=I I. 4為限；(2)將氯乙酸鈉水溶液和異丙醇同時加入到步驟(I)所制備的混合溶液中，在攪拌下于常壓、60°C反應3小時；所述氯乙酸鈉水溶液的濃度為O. 8g/ml，所述氯乙酸鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氯乙酸鈉的摩爾比=I 0.6為限， 所述異丙醇與氯乙酸鈉水溶液的體積比為I:9;(3)在步驟(2)所得到的反應液中同時加入氯乙酸鈉水溶液和異丙醇，在攪拌下于常壓、60°C反應3小時，所述氯乙酸鈉水溶液的濃度和加入量與步驟(2)相同，所述異丙醇的加入量與步驟⑵相同；(4)將步驟(3)形成的含反應產物的混合液用鹽酸調pH值至4，然后用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到羧甲基化普魯蘭多糖；(5)用去離子水將步驟(4)得到的羧甲基化普魯蘭多糖配制成濃度為0.025g/ ml的溶液，用去離子水將丁二酸二酰肼配制成濃度為O. 25g/ml的溶液，在攪拌下于室溫、 常壓將羧甲基化普魯蘭多糖水溶液加入到丁二酸二酰肼水溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為O. 8g/ml的I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應6小時，反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體；所述羧甲基化普魯蘭多糖水溶液與丁二酸二酰肼水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與丁二酸二酰肼的摩爾比達到I : 10為限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與 I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比達到I : 1.1。本實施例所制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體的紅外譜圖類似于圖I中的B 圖，核磁譜圖類似于圖2中的I圖。(6)在六個容器中各放入IOOmg本實施例制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體， 然后均用去離子水配制成濃度為5mg/ml的水溶液；將IOmg鹽酸阿霉素、20mg鹽酸阿霉素、 30mg鹽酸阿霉素、40mg鹽酸阿霉素、50mg鹽酸阿霉素、60mg鹽酸阿霉素分別加入上述六個容器中，在攪拌下于常壓、室溫避光反應12小時，然后分別用乙醇沉淀，離心收集沉淀，反復沖洗，真空抽干，即得到六種載有阿霉素的天然普魯蘭多糖納米藥物載體，其外形類似于圖4，粒徑分布類似于圖3。該六種載有阿霉素的天然普魯蘭多糖納米藥物載體中，載藥量分別為 17. 63%,22. 93%,29. 29%,33. 78%,39. 19%,41. 76%，最大載藥量為 41. 76%,由加入60mg鹽酸阿霉素的容器中的反應液獲得。在常壓、37°C下將載藥量為17. 63%的天然普魯蘭多糖納米藥物載體分別放入pH =5. O的PBS緩沖液、PH = 7. 4的PBS緩沖液中，其釋藥曲線類似于圖5，在12個小時內， 在pH = 5. O的PBS緩沖液環境中釋放總量達90%，在PH = 7. 4的PBS緩沖液環境中釋放總量在IO 以內。
實施例4本實施例的工藝步驟如下(I)將異丙醇加入天然普魯蘭多糖水溶液中，再加入氫氧化鈉水溶液，在常壓、 70°C下攪拌，直至形成透明溶液；所述天然普魯蘭多糖水溶液用去離子水配制，濃度為 O. 3g/ml，所述異丙醇與天然普魯蘭多糖水溶液體積比為I : 8 ;所述氫氧化鈉水溶液用去離子水配制，濃度為O. 3g/ml，氫氧化鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氫氧化鈉的摩爾比=I I. 2為限；(2)將氯乙酸鈉水溶液和異丙醇同時加入到步驟(I)所制備的混合溶液中，在攪拌下于常壓、70°C反應4小時；所述氯乙酸鈉水溶液的濃度為O. 8g/ml，所述氯乙酸鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氯乙酸鈉的摩爾比=I O. 75為限， 所述異丙醇與氯乙酸鈉水溶液的體積比為I:8;(3)在步驟(2)所得到的反應液中同時加入氯乙酸鈉水溶液和異丙醇，在攪拌下于常壓、70°C反應4小時，所述氯乙酸鈉水溶液的濃度和加入量與步驟(2)相同，所述異丙醇的加入量與步驟⑵相同；(4)將步驟(3)形成的含反應產物的混合液用鹽酸調pH值至3，然后用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到羧甲基化普魯蘭多糖；(5)用去離子水將步驟(4)得到的羧甲基化普魯蘭多糖配制成濃度為O. 075g/ml, 用去離子水將己二酸二酰肼配制成濃度為O. 25g/ml的溶液，在攪拌下于室溫、常壓將羧甲基化普魯蘭多糖水溶液加入到己二酸二酰肼水溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為lg/ml的 I-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應2小時,反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體；所述羧甲基化普魯蘭多糖水溶液與己二酸二酰肼水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與己二酸二酰肼的摩爾比達到I : 10為限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比達到I : 1.2。本實施例所制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體的紅外譜圖類似于圖I中的B 圖，核磁譜圖類似于圖2中的I圖。(6)在六個容器中各放入IOOmg本實施例制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體， 然后均用去離子水配制成濃度為5mg/ml的水溶液；將IOmg鹽酸阿霉素、20mg鹽酸阿霉素、 30mg鹽酸阿霉素、40mg鹽酸阿霉素、50mg鹽酸阿霉素、60mg鹽酸阿霉素分別加入上述六個容器中，在攪拌下于常壓、室溫避光反應12小時，然后分別用乙醇沉淀，離心收集沉淀，反復沖洗，真空抽干，即得到六種載有阿霉素的多糖普魯蘭糖納米藥物載體，其外形類似于圖 4，粒徑分布類似于圖3。該六種載有阿霉素的多糖普魯蘭糖納米藥物載體中，載藥量分別為 11. 37%U8. 77%,23. 78%,29. 16%,35. 69%,47. 67%，最大載藥量為 47. 67%,由加入 60mg鹽酸阿霉素的容器中的反應液獲得。在常壓、37°C下將載藥量為11. 37%的天然普魯蘭多糖納米藥物載體分別放入pH =5. O的PBS緩沖液、PH = 7. 4的PBS緩沖液中，其釋藥曲線類似于圖5，在12個小時內， 在pH = 5. O的PBS緩沖液環境中釋放總量達90%，在PH = 7. 4的PBS緩沖液環境中釋放總量在IO 以內。
實施例5將人肝癌細胞(HepG2)、人宮頸癌細胞(Hela)和小鼠成纖維細胞(L929)用含有 10%小牛血清的DMEM培養基分別連續培養，取對數生長期的細胞，胰酶消化后加上述培養基稀釋，按每孔I X IO4個/ml的細胞密度接種于96孔板；用含有10%小牛血清的DMEM培養基和鹽酸阿霉素配制含鹽酸阿霉素的六種培養基，所述培養基中，阿霉素含量分別為 O. 01mg/L、0. lmg/L、l. 0mg/L、5. 0mg/L、20mg/L、50mg/ L ;用含有10%小牛血清的DMEM培養基和實施例I制備的載藥量為13. 59%的天然多糖普魯蘭糖納米藥物載體，配制含載有阿霉素的天然普魯蘭多糖納米藥物載體的六種培養基， 所述培養基中，阿霉素含量分別為 O. 01mg/L、0. lmg/L、l. 0mg/L、5. 0mg/L、20mg/L、50mg/L ；待接種于96孔板的細胞貼壁生長后，將上述12種培養基(用于實驗組)和含有
10%小牛血清的DMEM培養基(用于空白對照組)分別加入96孔板，繼續培養24小時和48 小時用MTT法觀察體外細胞生長情況，計算細胞殺傷率細胞殺傷百分率=(空白組OD值-實驗組OD值)X100%/空白組OD值鹽酸阿霉素和含載有阿霉素的實施例I制備的天然普魯蘭多糖納米藥物載體(簡稱含阿霉素載體)的體外腫瘤細胞殺傷性能的MTT分析結果見圖6。從圖6 (I)、圖6 (2)可以看出，含阿霉素載體在含不同濃度的阿霉素時對人肝癌細胞0fepG2)具有不同的殺傷能力，隨著阿霉素含量的增多，依次表現出更強的殺傷力；含阿霉素載體表現出與鹽酸阿霉素相當的腫瘤細胞殺傷能力。由于阿霉素的主要作用是阻斷細胞核內mRNA的合成并導致腫瘤細胞凋亡，因而以上結果說明載阿霉素載體能夠有效地將阿霉素傳遞到細胞核內部。從圖6(3)、圖6(4)、圖6 (5)、圖6(6)可以看出，鹽酸阿霉素對人宮頸癌細胞 (Hela)和小鼠成纖維細胞(L929)的殺傷作用隨阿霉素濃度增加而增強，其趨勢與對人肝癌細胞(HepG2)的作用類似。而含阿霉素載體隨所含阿霉素濃度的增加對人宮頸癌細胞 (Hela)和小鼠成纖維細胞(L929)的生長沒有明顯的影響，直到48h時，依然沒有表現出很強的殺傷作用。上述結果表明，含阿霉素載體能夠有效地聚集于人肝癌細胞0fepG2)中，與肝癌細胞膜表面的去唾液酸糖蛋白受體相結合，因而可實現對肝臟的靶向性給藥。
1權利要求
1.天然普魯蘭多糖納米藥物載體，其特征在于由羧甲基化普魯蘭多糖與肼縮合反應而成，結構式如下
2.根據權利要求I所述的天然普魯蘭多糖納米藥物載體，其特征在于該載體載藥后在水中自組裝形成納米粒子，其粒徑為60nm 200nm。
3.一種天然普魯蘭多糖納米藥物載體的制備方法，其特征在于工藝步驟如下(1)將異丙醇加入天然普魯蘭多糖水溶液中，再加入氫氧化鈉水溶液，在常壓、50 80°C下攪拌，直至形成透明溶液；所述天然普魯蘭多糖水溶液的濃度為O. I O. 5g/ml，所述異丙醇與天然普魯蘭多糖水溶液體積比為I : 10 7/3 ;所述氫氧化鈉水溶液的濃度為 O. I O. 5g/ml，氫氧化鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氫氧化鈉的摩爾比=I I I. 5為限；(2)將氯乙酸鈉水溶液和異丙醇同時加入到步驟(I)所制備的混合溶液中，在攪拌下于常壓、50 80°C反應2 5小時；所述氯乙酸鈉水溶液的濃度為O. 5 I. Og/ml，所述氯乙酸鈉水溶液的量以混合溶液中天然普魯蘭多糖的葡萄糖單元與氯乙酸鈉的摩爾比= I O. 5 O. 75為限，所述異丙醇與氯乙酸鈉水溶液的體積比為I : 10 7/3 ;(3)在步驟(2)所得到的反應液中同時加入氯乙酸鈉水溶液和異丙醇，在攪拌下于常壓、50 80°C反應2 5小時，所述氯乙酸鈉水溶液的濃度和加入量與步驟(2)相同，所述異丙醇的加入量與步驟(2)相同；(4)將步驟(3)形成的含反應產物的混合液用鹽酸調pH值至2 5，然后用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到羧甲基化普魯蘭多糖；(5)用去離子水將步驟(4)得到的羧甲基化普魯蘭多糖配制成濃度為O.Ol O. IOg/ ml的溶液，用去離子水將肼配制成濃度為O. I O. 5g/ml的溶液，在攪拌下于室溫、常壓將羧甲基化普魯蘭多糖水溶液加入到肼的水溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為O. 5 lg/ml的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應2 6小時，反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體；所述羧甲基化普魯蘭多糖水溶液與肼的水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與肼的摩爾比達到I : 10 30為限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液的量以反應液中羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比達到I : I I. 2為限。
4.根據權利要求3所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體的制備方法，其特征在于所述肼為水合肼、草酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼中的一種。
全文摘要
本發明所述天然普魯蘭多糖納米藥物載體，由羧甲基化普魯蘭和肼縮合反應而成，所述羧甲基化普魯蘭多糖的羧基與肼的氨基的縮合反應度為60～90％。該載體載藥后在水中自組裝形成納米粒子，其粒徑為60nm～200nm。其制備方法的工藝步驟如下(1)制備羧甲基化普魯蘭糖；(2)用去離子水將羧甲基化普魯蘭糖配制成濃度為0.01～0.10g/ml的溶液，用去離子水將肼配制成濃度為0.1～0.5g/ml的溶液，在攪拌下于室溫、常壓將羧甲基化普魯蘭糖水溶液加入到肼溶液中，攪拌均勻后，加入濃度為0.5～1g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，在攪拌下反應2～6小時，反應時間屆滿后，用去離子水透析除去小分子雜質，冷凍干燥，即得到天然普魯蘭多糖納米藥物載體。
文檔編號A61K47/36GK102603912SQ20121006618
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年1月9日
發明者張興棟, 李樺楠, 樊渝江, 邊少荃 申請人:四川大學