一種草魚出血病口服疫苗的制備方法

專利名稱：一種草魚出血病口服疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種利用家蠶生物反應器制備草魚出血病口服疫苗的方法。
背景技術：
^jkiCtenopharyngoclon是我國淡水養魚的主要品種,其產量約占淡水養殖總產量的20%。但草魚病害多，其中以草魚出血病(hemorrhagic disease of grasscarp)最甚，由草魚出血病病毒(Crass Carp Reovirus, GCRV)引起。該病是魚種培育階段的最大病害，死亡率高達90%以上，給水產養殖業造成了巨大損失。現有技術中，在草魚出血病的免疫預防中，主要使用甲醛滅活疫苗。例如，取感染病毒死亡的草魚，勻漿滅活后過濾，即得到病毒滅活疫苗；也可以采用細胞培養滅活疫苗。滅活疫苗能夠對草魚出血病起到預防作用，但是安全性較差，有毒力返祖現象出現。基因工程疫苗具有抗原性強、保護時間長、安全性好、制備和運輸方便等優點，已引起行業內的廣泛關注。家蠶桿狀病毒表達載體系統(Bombyx mori baculovirus expression vectorsystem )是真核表達系統，已有許多基因在該系統中成功表達。用該系統在家蠶中表達外源基因，表達水平高、產物生物活性好。同時桿狀病毒也是一種良好的基因傳遞載體，已用于向哺乳類動物細胞傳遞基因研究。目前，未見利用家蠶桿狀病毒表達載體系統制備草魚出血病口服疫苗的報道。

發明內容
本發明的發明目的是提供一種采用基因工程方法制備草魚出血病口服疫苗的方法。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種草魚出血病口服疫苗的制備方法，包括下列步驟
(1)通過基因工程方法制備帶有草魚出血病病毒結構蛋白VP6基因的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6 ；
(2)將重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6感染家蠶培養細胞BmN進行擴增，采用擴增后的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6接種至五齡家蠶幼蟲或蛹；
(3)收集接種病毒4 6天后的五齡家蠶幼蟲或蛹，采用冷凍干燥法制備獲得凍干
粉；
(4)將步驟(3)獲得的凍干粉與粉狀魚飼料均勻混合，即獲得草魚出血病口服疫苗，按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為I 10%。上述技術方案中，通過基因工程方法獲得重組的帶有草魚出血病病毒結構蛋白VP6基因的家蠶Bombyx mori重組桿狀病毒，并用該病毒接種家蠶幼蟲或蛹，使重組桿狀病毒在蟲體大量復制，同時草魚出血病病毒結構蛋白VP6在家蠶幼蟲或蛹中獲得到高效表達。將高效表達VP6的幼蟲或蠶蛹制成凍干粉，經動物試驗證明，凍干粉按1% 10%與草魚飼料混合，制成口服疫苗制劑，可誘導魚體產生VP6特異性抗體，具有顯著的免疫效果。所述的魚飼料可以選擇現有的任一種草魚飼料，僅為口服目的加入。為混合方便，魚飼料應為粉狀或先加工成粉狀，再與凍干粉充分混合均勻。上述技術方案中，所述步驟(1)具體包括以下步驟
①根據GenBank已公開的草魚出血病病毒結構蛋白VP6的cDNA編碼序列(GenBank登錄號AF403394)，合成5’端和3’端分別帶EcoRI和Hind III位點的VP6基因的編碼序列，克隆進T-載體，獲pMD19T-VP6質粒；
②用EcoRI/Hindlll雙酶切消化PMD19T-VP6質粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/Hindlll雙酶切消化供體質粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，將VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和Hind III之間，將VP6基因克隆進pFastBac-Dual載體中的桿狀病毒多角體基因啟動子下游獲得pFastBac-ph-VP6重組質粒；
③以pMD19T-VP6質粒為模板，PCR合成5’端和3’端分別帶XhoI和KpnI位點的VP6基因的編碼序列，Xhol/Kpnl雙酶切后克隆進用Xhol/Kpnl雙酶切的pFastBac-ph-VP6中獲 pFastBac_VP6-ph_VP6 ；
④根據GenBank已公開的團頭鮮Megalobramaamblycephala的P -肌動蛋白啟動子序列(GenBank登錄號AY170122)合成5’端和3’端分別帶SmaI和XhoI位點的P -肌動蛋白啟動子序列，克隆進T-載體,獲pMD19T-0 -actin質粒；
⑤用Smal/Xhol雙酶切pMD19T-^ -actin質粒，回收P -肌動蛋白啟動子序列片段，Smal/Xhol雙酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，將P -肌動蛋白啟動子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6 的 SmaI 和 XhoI 之間，獲得 pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 重組質粒；
⑥將pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重組質粒轉化大腸桿菌BmDHlOBac感受態細胞，涂布于LB瓊脂培養平板上，挑取白色菌落培養，提取重組Bacmid基因組Bacmid-IIVP6 DNA ；
⑦將Bacmid-IIVP6DNA由脂質體介導轉染家蠶培養細胞BmN，培養細胞后取上清，獲得重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6。其中，所述步驟⑥中，LB瓊脂培養平板上含有四環素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG、和 X-gal。將pFastBac-FA-VP6-ph_VP6重組質粒轉化大腸桿菌BmDHlOBac感受態細胞,涂布于含四環素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂培養平板上是為了方便重組Bacmid的篩選，本領域技術人員能夠根據需要調整各組份的含量，通常四環素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG和X-gal在LB瓊脂培養平板上的含量分別為10吒/ml、50吒/ml、7 ^g/ml、40M<g/ml 和 100 M-g/ml 上述技術方案中，所述步驟(3)中凍干粉的制作方法是，取收集的五齡家蠶幼蟲或蛹，冰浴勻漿，加入3 5倍重量的生理鹽水，混勻，過濾，濾液冷凍干燥至水份含量小于2wt%,粉碎過篩,獲得凍干粉。優選的技術方案，在接種病毒5天后收集五齡家蠶幼蟲或蛹。按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為I 10%。上文中，采用所述家蠶Bombyx mori重組桿狀病毒接種家蠶幼蟲或蛹的方法為將重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6感染家蠶培養細胞BmN進行擴增，采用擴增后的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6接種至五齡家蠶幼蟲或蛹。進一步地，取5天后家蠶或蛹的血淋巴，分析檢測VP6表達水平，結果顯示重組VP6占血淋巴總蛋白的5 5. 5%左右。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
I.由于本發明采用家蠶桿狀病毒表達系統生產草魚出血病口服疫苗，家蠶可食，家蠶桿狀病毒對魚類無致病性，表達VP6的家蠶幼蟲和蛹可直接冷凍干燥，表達產物無需純化，可以直接作為口服藥物使用，因此具有制備工藝簡單、成本低，口服疫苗方便使用等優點，同時可以避免采用注射免疫方案中捕 撈魚及注射對魚體損傷的副作用。2.由于用本發明技術方案獲得的重組家蠶桿狀病毒基因組中，同時具有桿狀病毒多角體蛋白啟動子控制VP6基因的表達元件和團頭魴的P -肌動蛋白啟動子控制VP6基因的表達元件，因此，該病毒接種家蠶后，病毒在家蠶中大量復制的同時可以大量表達VP6蛋白，而當魚食下本發明技術方案獲得的口服疫苗制劑后，重組VP6蛋白作為亞單位疫苗可以刺激魚體產生特異性抗體；同時，重組桿狀病毒可以進入魚的細胞，在魚體內通過團頭魴的￠-肌動蛋白啟動子驅動VP6的表達，進一步產生免疫作用。即采用本發明技術方案有蛋白亞單位疫苗和核酸疫苗的雙重作用。3.本發明所得一種草魚出血病口服疫苗制劑經動物試驗證明可誘導魚體產生VP6特異性抗體，具有顯著的免疫效果。


圖I為實施例一中pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重組質粒的酶切鑒定圖，其中，M.標準 DNA 分子質量(200-2000bp) ;1_2 :pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 重組質粒 EcoR I /Hind III 酶切；3-4 pFastBac-FA-VP6-ph-VP6 重組質粒 Sma I /Xho I 酶切；5_6 pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 重組質粒 Xho I /Kpn I 酶切。圖2為實施例一中P2代BmNPV_IIVP6病毒感染細胞引起的細胞病變圖，其中A為正常沒有感染病毒的細胞，B為感染BmNPV-IIVP6的細胞。圖3為實施例一中重組VP6蛋白的SDS-PAGE和Western blotting檢測。M.標準蛋白分子量 I和I’.正常5齡家蠶血液；2和2’ 感染BmNPV-IIVP6病毒5天后的5齡家蠶血液。SDS-PAGE膠的濃度為12%，一抗為鼠抗VP6抗體，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG0圖4為實施例一中SDS-PAGE檢測BmNPV_IIVP6病毒感染家蠶幼蟲不同時相的VP6表達。M.標準分子量蛋白.N正常5齡家蠶血液，W.感染野生病毒5齡家蠶血液，24h，48h，72h，96h，120h.分別為感染 BmNPV-IIVP6 病毒 24，28，72，96，120 小時 5 齡家蠶血液。圖5為實施例一中SDS-PAGE膠灰度分析估計VP6在BmNPV_IIVP6病毒不同感染時相的表達水平。橫坐標為病毒感染家蠶后的時間，縱坐標為VP6蛋白占血淋巴總蛋白的比例。圖6為實施例四中口服免疫后草魚血液VP6特異性抗體檢測。Group LV :低劑量組，含1%表達VP6蠶蛹凍干粉的魚飼料；Group MV :中劑量組，含5%表達VP6蠶蛹凍干粉的魚飼料；Group HV :高劑量組，含10%表達VP6蠶蛹凍干粉的魚飼料；Group NV :非免疫組，含5%正常蠶蛹凍干粉的魚飼料；Group CK :正常對照組，正常魚飼料。橫坐標為免疫后的周數,縱坐標為抗體的滴度。實驗重復3次，*P < 0. 05 ;**P < 0.01。
圖I為實施例四中RT-PCR檢測免疫后草魚血液中的VP6基因的mRNA。M.標準分子量DNA ；泳道1-3.為分別飼喂含1%，5%和10%表達VP6基因的蠶蛹凍干粉魚飼料的草魚；泳道4.飼喂含5%正常蠶蛹凍干粉魚飼料的草魚；泳道5.陽性對照(pFastBac-FA-VP6-ph-VP6 質粒)。圖8為實施例四中免疫熒光檢測免疫后草魚腎臟組織中的VP6蛋白。a.正常光線下的腎臟組織；e.用DAPI染色的腎臟組織；f. Dylight 488標記的腎臟組織。
具體實施方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述
實施例一表達草魚出血病病毒(GCRV) VP6家蠶幼蟲的制備
I. 用QIAGEN Viral RNA Mini Kit (Qiagen公司)提取草魚出血病病毒基因組RNA，用RNA PCR KitVer. 3. 0 (Qiagen公司)按產品錄說明書將病毒RNA轉化為cDNA，根據草魚出血病病毒結構蛋白VP6的cDNA編碼序列(GenBank登錄號AF403394)設計引物 GCRV-EI-6 (GGCGAATTC ATGGCACAGCGTCAGnTTTCGG，下劃線表示 EcoR I 酶切位點)和GCRV-HD-6 (TCGAAGCTTAGACGAACATCGCCTGCGC,下劃線表示 Hind III酶切位點)，通過 PCR 合成5’端和3’端分別帶EcoRI和Hind III位點的VP6基因的編碼序列，克隆進T-載體，獲PMD19T-VP6 質粒。2.用 EcoRI/Hindlll雙酶切消化PMD19T-VP6 質粒，回收 VP6 基因片段(I. 23 kb)，用EcoRI/Hindlll雙酶切消化供體質粒pFastBac-Dual,回收pFastBac-Dual片段，將VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和HindIII之間，即將VP6基因克隆進pFastBac-Dual載體中的桿狀病毒多角體基因啟動子下游獲得pFastBac-ph-VP6。其中，質粒pFastBac-Dual是美國Invitrogen公司的產品，其產品名為PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR ;pFastBac_Dual 載體屬于 Bac-to-Bac (Bacteria toBaculovirus)表達系統載體。3.設計引物 GCRV-XH-6 (TAT CTC GAG ATG GCA CAG CGT CAG TTT TTC GG，下劃線示 Xho I 位點)和 GCRV-KN-6 (GCT GGT ACC TAG ACG AAC ATC GCC TGC GC，下劃線示Kpn I位點)，以pMD19T-VP6質粒為模板，PCP合成5’端和3’端分別帶XhoI和KpnI位點的VP6基因的編碼序列,Xhol/Kpnl雙酶切后克隆進用Xhol/Kpnl雙酶切的pFastBac_ph_VP6中獲 pFastBac-VP6-ph-VP6 質粒。4.根據GenBank已公開的團頭鮮的@ _肌動蛋白啟動子序列(GenBank登錄號AY170122)設計引物 FA-SM (TCT CCC GGG CTC TTA CAG GAA ACG GGT C，下劃線示 Sma I位點)和 FA-XH (CTA CTC GAG ATT GGA GCT CAA AGT GAG G，下劃線示 Xho I 位點)，以團頭魴基因組DNA為模板，PCR合成5’端和3’端分別帶SmaI和XhoI位點的P -肌動蛋白啟動子序列，克隆進T-載體,獲pMD19T-0 -actin質粒。5.用Smal/Xhol雙酶切pMD19T_ P -actin質粒，回收P -肌動蛋白啟動子序列片段(0.56 kb), Smal/Xhol雙酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，將P -肌動蛋白啟動子序列片段插入到 pFastBac-VP6-ph-VP6 的 SmaI 和 XhoI 之間，獲得 pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 重組質粒。鑒定結果參見圖I :重組質粒 pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 分別用 EcoR I /HindIII和Xho I /Kpn I雙酶切，均可切出與vp6基因理論分子量相符的片段(I. 23kb);Sma I /Xho I雙酶切可切出與￠-肌動蛋白基因啟動子(0. 56kb)理論分子量相符的片段，表明外源基因已按設計要求被正確克隆。6. pFastBac-FA-VP6-ph_VP6重組質粒轉化大腸桿菌BmDHlOBac感受態細胞，涂布于含四環素(10 Mg/ml)、卡那霉素(50 Mg/ml)、慶大霉素(7 Mg/ml)、IPTG (40I^g/ml)、X-gal (100 吒/ml)的L B瓊脂培養平板上。挑取白色菌落培養，提取重組Bacmid基因組 DNA，用 M13 正向引物(5’ -CCCAGTCACGACGITGTAAAACG-3’)和 M13 反向引物(5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)對重組 Bacmid-I IVP6 進行 PCR，可從重組 Bacmid DNA中擴增出與理論分子量一致的目的條帶(5. 72 kb),說明已按要求正確構建了重組Bacmid,命名為 Bacmid-IIVP6。7. Bacmid-IIVP6 DNA (2 y g)力口入至Ij 98 y I TC-100 (無胎牛血清，GIBCO BRL 公司)中混勻，另取 10 u I FuGENE HD transfection reagent (Roche 公司)加入到 90 u ITC-100 (無胎牛血清)中混勻，再將前者滴加到后者中混勻放置30分鐘后滴加到SOOiU的TC-100 (無胎牛血清)中混勻，轉染BmN細胞。27°C培養3 4天，收取病毒感染的培養細胞上清，獲Pl代重組病毒BmNPV-IIVP6。取Pl代病毒感染單層BmN細胞，培養5天后，收取病毒感染的培養細胞上清，獲P2代重組病毒BmNPV-IIVP6，取P2代病毒感染單層BmN細胞，感染72小時細胞出現典型的細胞病變，感染4天后收取病毒感染的培養細胞上清，獲P3代重組病毒BmNPV-IIVP6，4度避光保存備用。P2代BmNPV_IIVP6病毒感染細胞引起的細胞病變參見圖2。BmN細胞感染P2代BmNPV-IIVP6病毒72小時后，細胞停止生長繁殖，細胞變圓，細胞核膨大，后細胞逐漸失去貼壁性能。8.用昆蟲針醮取P3代重組病毒，從節間膜處穿刺接種5齡起蠶，25°C左右正常飼養，5天后，取少量蠶血，進行SDS-PAGE和Western blotting檢測重組VP6蛋白，5齡起蠶接種后，每24小時取血，進行SDS-PAGE，并通過灰度分析估計VP6表達水平。結果顯示重組VP6蛋白的分子量為53kD左右(圖3)，感染病毒72小時后，可明顯檢測到VP6特異性表達(圖4)，120小時VP6蛋白占血淋巴總蛋白的5%左右(圖5)。實施例二表達草魚出血病病毒(GCRV) VP6家蠶蛹的制備
I.采用實施例一步驟7獲得的P3代重組病毒BmNPV-IIVP6，感染BmN培養細胞，4天后收集細胞培養上清。2.用昆蟲針醮取步驟I的細胞培養上清，環節處穿刺接蛹齡2天左右的家蠶蛹，25 °C左右保護5天后，取少量蛹血，進行SDS-PAGE和Western blotting檢測，并對SDS-PAGE膠通過灰度分析估計VP6的表達水平。結果顯示重組VP6蛋白的分子量約為53kD，感染5天后VP6蛋白表達水平最高，占蛹血淋巴總蛋白的5. 5%左右。收集接種病毒5天后的家蠶蛹，_20°C保存。實施例三表達VP6家蠶蛹凍干粉的制備
I.取實施例二步驟2的蠶蛹10kg，冰浴勻漿，加0. 7%的生理鹽水40kg，混勻，用紗布過濾去除粗雜質。2.濾液冷凍干燥至水份小于2%，粉碎過篩制成粉劑原料。實施例四口服含有VP6家蠶蛹粉誘導草魚產生VP6特異性抗體的能力I.于實驗前兩周，選取健壯無病的同一批次草魚魚種(體長10-13 cm，體重23-28g)，于31± I C水溫中充氧飼育。魚每天喂商業化魚飼料2次。2.含2. 5%淀粉的商業化魚飼料與實施例三步驟2的粉劑原料混合，分別制成含1%、5%和10%實施例三步驟2的粉劑原料的魚飼料，同時制作含5%正常蠶蛹凍干粉的魚飼料。3.正常對照組魚每天喂普通商業化魚飼料，非免疫組魚每天喂含含5%正常蠶蛹凍干粉的魚飼料，免疫組魚每天喂 1%、5%和10%實施例三步驟2的粉劑原料的魚飼料，分別稱低劑量組，中劑量組和高劑量組，飼喂28天后，改喂正常商業化魚飼料。每隔I周取魚血用間接血凝法測定VP3抗體滴度。結果如圖6所示，在免疫組，免疫后2-8周內均可檢測到VP3抗體，免疫后第3周抗體達到最高水平，后逐漸下降，直至第9周，且抗體產生水平呈現免疫劑量依賴關系，而正常對照，非免疫組基本測不到特異性VP6抗體。表明口服表達VP6的蠶蛹凍干粉可誘導魚產生VP6特異性抗體。草魚口服疫苗3個月后，取草魚血液，用Trizol Reagent (Takara公司)制取總RNA,用RNase-free DnaseI去除DNA污染后,用SuperScript III kit (Invitrogen公司)反轉錄成cDNA,然后用引物GCRV-XH-6/ GCRV-KN-6進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖7所示，在免疫后的魚血液樣品中可檢測到VP6特異性mRNA，說明口服表達VP6蠶蛹凍干粉后，BmNPV-IIVP6重組病毒進入魚體后，VP6基因能轉錄；草魚口服表達VP6蠶蛹凍干粉免疫5天后，取腎組織用4%甲醛固定，然后用石臘包埋，切片先后與鼠抗VP6抗體、Dylight488標記的羊抗鼠IgG(H+L) (Earthox公司反應)，然后再用DAPI (Sigma公司)染色.熒光顯微鏡觀察結果顯示，在口服免疫后的魚腎臟組織切片中可觀察到特異性綠色熒光，說明口服表達VP6蠶蛹凍干粉后，BmNPV-IIVP6重組病毒進入魚體后，VP6基因能正確表達(圖8)，表明VP6蠶蛹凍干粉不僅具有蛋白亞單位疫苗的特性，同時也具有核酸疫苗的功倉泛。
權利要求
1.一種草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于，包括下列步驟 (1)通過基因工程方法制備帶有草魚出血病病毒結構蛋白VP6基因的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6 ； (2)將重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6感染家蠶培養細胞BmN進行擴增，采用擴增后的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6接種至五齡家蠶幼蟲或蛹； (3)收集接種病毒4 6天后的五齡家蠶幼蟲或蛹，采用冷凍干燥法制備獲得凍干粉； (4)將步驟(3)獲得的凍干粉與粉狀魚飼料均勻混合，即獲得草魚出血病口服疫苗，按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為I 10%。
2.根據權利要求I所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)具體包括以下步驟 ①根據GenBank已公開的草魚出血病病毒結構蛋白VP6的cDNA編碼序列,合成5’端和3’端分別帶EcoRI和Hind III位點的VP6基因的編碼序列，克隆進T-載體，獲pMD19T_VP6質粒; ②用EcoRI/Hindlll雙酶切消化PMD19T-VP6質粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/Hindlll雙酶切消化供體質粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，將VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和Hind III之間，將VP6基因克隆進pFastBac-Dual載體中的桿狀病毒多角體基因啟動子下游獲得pFastBac-ph-VP6重組質粒； ③以pMD19T-VP6質粒為模板，PCR合成5’端和3’端分別帶XhoI和KpnI位點的VP6基因的編碼序列，Xhol/Kpnl雙酶切后克隆進用Xhol/Kpnl雙酶切的pFastBac-ph-VP6中獲 pFastBac_VP6-ph_VP6 ； ④根據GenBank已公開的團頭鮮Megalobramaamblycephala的0 -肌動蛋白啟動子序列合成5’端和3’端分別帶SmaI和XhoI位點的P -肌動蛋白啟動子序列，克隆進T-載體，獲 pMD19T_ ^ -actin 質粒； ⑤用Smal/Xhol雙酶切pMD19T-^ -actin質粒，回收P -肌動蛋白啟動子序列片段，Smal/Xhol雙酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，將P -肌動蛋白啟動子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6 的 SmaI 和 XhoI 之間，獲得 pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 重組質粒； ⑥將pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重組質粒轉化大腸桿菌BmDHlOBac感受態細胞，涂布于含四環素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG和X-gal的LB瓊脂培養平板上，37°C培養I 2天，挑取白色菌落培養，提取重組Bacmid基因組Bacmid-IIVP6 DNA ； ⑦將Bacmid-IIVP6DNA由脂質體介導轉染家蠶培養細胞BmN，培養細胞后取上清，獲得重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6。
3.根據權利要求I所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中凍干粉的制作方法是，取收集的五齡家蠶幼蟲或蛹，冰浴勻漿，加入3 5倍重量的生理鹽水，混勻，過濾，濾液冷凍干燥至水份含量小于2wt%，粉碎過篩，獲得凍干粉。
4.根據權利要求3所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于在接種病毒4 6天后收集五齡家蠶幼蟲或蛹。
5.根據權利要求I所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為I 10%。
全文摘要
本發明公開了一種草魚出血病口服疫苗的制備方法，包括下列步驟(1)通過基因工程方法制備帶有草魚出血病病毒結構蛋白VP6基因的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6；(2)采用擴增后的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6接種至五齡家蠶幼蟲或蛹；(3)收集接種病毒4～6天后的五齡家蠶幼蟲或蛹，采用冷凍干燥法制備獲得凍干粉；(4)將步驟(3)獲得的凍干粉與粉狀魚飼料均勻混合，即獲得草魚出血病口服疫苗，按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為1～10%。本發明可以直接作為口服疫苗使用，具有制備工藝簡單、成本低、方便使用，具有蛋白亞單位疫苗和核酸疫苗雙重功能等優點。
文檔編號A61K39/15GK102614509SQ20121011606
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月19日 優先權日2012年4月19日
發明者劉林, 徐詩英, 曹廣力, 薛仁宇, 貢成良, 鄒勇, 陳輝 申請人:蘇州大學