Panton-valentine殺白細胞素用于治療和預防葡萄球菌感染的用途的制作方法

專利名稱：Panton-valentine殺白細胞素用于治療和預防葡萄球菌感染的用途的制作方法
技術領域：
本發明大體上涉及治療和預防細菌感染。特定來說，在本文中揭示使用包括Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)抗原或與其特異性結合的抗體的組合物來治療和預防金黃色葡萄球菌(S. aureus)感染(包含社區獲得性甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(CA-MSRA)感染)的組合物和方法。本發明也大體上涉及屬于LukF-PV和LukS-PV蛋白的抗體和抗原，那些蛋白的突變形式，以及那些PVL亞單位的融合蛋白組合。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)細菌(通常被稱作“staph”、“Staph.aureus”或“S. aureus”)通常攜帶于健康個體的皮膚上或鼻子中。在任何特定時間人口的約20%-30%上定居有金黃色葡萄球菌。這些細菌通常造成輕微感染，諸如丘疹和癤子。然而，金黃色葡萄球菌也造成嚴重且潛在致命的菌血癥，其為特征在于在血流中存在活細菌的醫學病狀。金黃色葡萄球菌表達眾多毒力因子(包含莢膜多糖和蛋白毒素)。PVL是屬于synergohymenotropic毒素家族的金黃色葡萄球菌蛋白，其通過兩個不相關種類的分泌蛋白或亞單位的協同作用破壞宿主防御細胞、白細胞和紅細胞的膜。Supersac等人,Infect.Immun. 61 :580-7 (1993)。此蛋白質家族包含α -溶血素(α -毒素)、β -溶血素、δ -溶血素、Y-溶血素、殺白細胞素(Luk)和PVL蛋白(LukS-PV和LukF-PV)。通過觀察白細胞毒性活性在金黃色葡萄球菌中首先發現PVL。Van der Velde7LaCellule, 10 :401-9 (1894)。后來Panton和Valentine能夠在來自患有慢性癤病的個體的V8菌株中區分PVL與其它溶血素。Panton P. ,Lancet, 222 :506-8 (1932)。隨后Woodin發現PVL 是由兩個亞單位 LukS-PV 和 LukF-PV 組成。Woodin AM. ,Biochem. J. ,73 :225-37(1959)和 Woodin AM.，Biochem. J.，75 :158-65(1960)。通過對兔和人類多形核細胞(PMN)和巨噬細胞的孔誘導已顯示PVL具白細胞毒性。Finck-Barbancon 等人,Biochim. Biophys. Acta, 1182 :275-82 (1993)。當經皮內注射入兔中時，經純化PVL誘發嚴重炎性病變，其導致毛細管擴張、趨化性、PMN滲透、PMN核破裂和皮膚壞死。Prevost 等人,J. Med. Microbiol, 42 :237-45 (1995)和 Ward 等人，Infect. Immun. ,28 :393-7(1980)。PVL的白細胞毒性和溶血性活性涉及兩種PVL亞單位的連續結合和協同締合。首先，LukS-PV與膜祀相互作用(Colin等人，Infect. Immun. 62 3184-8(1994))。其后，LukF-PV 亞單位與 LukS-PV 亞單位結合。Woodin，AM 和 Wieneke AA,Biochem J.，105 :1029-1038 (1967)和 Colin 等人，同上。盡管LukS-PV和LukF-PV僅表達于一小部分醫院相關金黃色葡萄球菌分離物(Prevost 等人，Infect. Immun. ,63 :4121-9(1995))中，但 PVL 表達似乎在世界范圍內普遍存在于社區獲得性甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株中。Dufour等人，Clin. Infect. Dis. ,35 :819-24(2002)和 Vandenesch 等人，Emerg. Infect. Dis. ,9 978-84(2003)。實際上，CA-MRSA的出現和傳播近來已導致各種疾病的爆發，這些疾病包含胺腫和市病(Lina 等人,Clin. Infect. Dis. ,29 :1128-32(1999)和 Kazakova 等人,N. Engl.J. Med.，352 :468-75(2005)),以及嚴重毒血癥(諸如壞死性肺炎)。Francis等人，Clin.Infect. Dis. ,40 100-7(2005)。據估計在美國50%以上的金黃色葡萄球菌菌株如今具甲氧西林抗性。舉例來說，1999 年，在美國國家醫院感染監測系統(National Noscomial Infections Surveillance System ；NNISS)中所報導的全部金黃色葡萄球菌分離物的54. 5%具甲氧西林抗性。疾病控制中心(The Centers for Disease Control)估計在2002年美國約存在100，000例醫院獲得性MRSA感染且這些感染問題只會惡化。在某些亞洲和歐洲國家，甲氧西林抗性的比率甚至更大(例如，在日本MRSA比率為72% ;在香港為74% )。因此，抗生素抗性菌株目前在治療金黃色葡萄球菌感染時造成問題，且除非開發新穎治療工具，否則這些問題只會變得惡化。因此，存在對于用于治療通常金黃色葡萄球菌 感染且尤其CA-MRSA感染的組合物和方法的需求。使用PVL抗原來制造疫苗的先前嘗試遭受顯著缺點，其包含經投與抗原的毒性和缺乏功效。舉例來說，Banffer 和 Franken, Path. Microbiol. 30 16-74 (1967)報導用殺白細胞素類毒素(PVL)使懷孕女性免疫以及其對抗體含量和乳腺炎發病率的影響。作者發現在免疫個體中抗殺白細胞素抗體增加，但在乳腺炎發展中無統計學顯著差異。作者指出，在153名免疫個體中，11名報導“注射部位處疼痛，具有摸得出的腋淋巴腺(中等)”且“在3起病例中認為反應嚴重”。Gladstone, B. J. Exp. Path. 54 :255-59 (1973)對作者和其他人所作的研究進行評論依其申述展示經純化殺白細胞素(包括LukF-PV與LukS-PV亞單位)抗葡萄球菌感染的治療功效，但承認“其在健康人中的用途……由通常觀測到的可變局部和全身反應顯示治療不當”。作者報導用使用福爾馬林(formalin)去毒的經純化殺白細胞素制劑免疫的結果，注意到在17名個體中有16名對免疫良好耐受，其中第17名個體經歷發熱、不適和嘔吐。作者也報導在免疫個體中抗殺白細胞素抗體含量的相當大的可變性。文章未研究經福爾馬林去毒的殺白細胞素制劑的預防或治療功效。Ward 和 Turner, Infect. &Immun. 27 :393-97(1980)報導用 LukF-PV 制劑和LukS-PV制劑進行的實驗，但其制劑的純度并不明確，因為他們發現各制劑都產生LukF-PV與LukS-PV的抗體，表明缺乏純度或抗原交叉反應性。作者發現用LukF-PV制劑免疫提供對投與LukF-PV、LukS-PV或兩者產生的隨后攻毒的保護，而用LukS-PV制劑免疫則不提供對任何攻毒的保護。然而，LukF-PV和LukS-PV攻毒誘發毒性反應的事實表明各制劑已經異種亞單位污染，因為單獨一種亞單位為無毒的。
關于抗PVL抗體的潛在有效性，Gauduchon等人，J. Infect. Dis. 189 =346(2004)發現商業IVIG制劑可在活體外中和金黃色葡萄球菌PVL。作者使用經純化重組PVL (rLukF-PV和rLukS-PV)來鑒別商業IVIG制劑中的抗PVL抗體。他們發現用IVIG對重組產生的抗原進行預培育會以IVIG濃度依賴性方式抑制細胞毒性。當兩種不同的產生PVL的金黃色葡萄球菌菌株的培養物上層清液經IVIG預培育時，發現類似結果。然而，作者未證明所報導活性是由于抗PVL抗體本身引起，且未控制IVIG的全身免疫調控效應。因此，存在對于適用于治療和預防金黃色葡萄球菌感染的方法中的包括PVL抗原和PVL抗體的組合物的需求。

發明內容
本發明提供PVL抗體和抗原組合物，制造其的方法，以及使用其來預防和治療金黃色葡萄球菌感染的方法。 在一個實施例中，本發明提供一種與金黃色葡萄球菌的Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)抗原特異性結合的抗體，其選自由以下各抗體組成的群組(i)與LukF-PV亞單位特異性結合但不與LukS-PV亞單位特異性結合的抗體,和(ii)與LukS-PV亞單位特異性結合但不與LukF-PV亞單位特異性結合的抗體。所述抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體。在一個特定實施例中，抗體是由以下方法制備，其包括(i)向個體投與組合物，所述組合物選自由以下各組合物組成的群組(a)包括作為PVL抗原的LukF-PV亞單位且不包括LukS-PV亞單位的組合物和(b)包括作為PVL抗原的LukS-PV亞單位且不包括LukF-PV亞單位的組合物；和(ii)自個體獲得抗體。本發明也提供一種包括抗體和醫藥學上可接受的載劑的組合物，且在一個特定實施例中，所述組合物為IVIG組合物或超免疫特異性IVIG組合物。在一個特定實施例中，抗體組合物進一步包括一種或一種以上其它細菌抗原的一種或一種以上抗體，諸如一種或一種以上金黃色葡萄球菌抗原的抗體，所述金黃色葡萄球菌抗原選自由以下各抗原組成的群組5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌、336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.印idermidis)PSl、表皮葡萄球菌GP1、α -毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白和其組合。本發明也提供一種用于中和個體中PVL相關細胞毒性的方法，其包括向個體投與包括抗體的組合物。在一個實施例中，抗體與LukS-PV特異性結合。在另一個實施例中，抗體與LukF-PV特異性結合。本發明也提供一種檢測樣品中PVL抗原的方法，其包括使樣品與抗體接觸。本發明的另一方面涉及PVL抗原。在一個實施例中，本發明提供一種包括與另一種細菌抗原連結(conjugate)的金黃色葡萄球菌的Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)抗原的PVL抗原。在一個實施例中，PVL抗原選自由以下各抗原組成的群組(a)包括LukF-PV亞單位且不包括LukS-PV亞單位的PVL抗原和(b)包括LukS-PV亞單位且不包括LukF-PV亞單位的PVL抗原。在一個實施例中，PVL抗原選自由經純化野生型PVL抗原和重組PVL抗原組成的群組。在一個實施例中，另一種細菌抗原選自由5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌、336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、α -毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白組成的群組。在另一個實施例中，另一種細菌抗原為另一種PVL亞單位，且PVL抗原包括選自由以下各連結物組成的群組的連結物(i)與LukS-PV亞單位連結的LukF-PV亞單位；(ii)與另一 LukF-PV亞單位連結的LukF-PV亞單位；和(iii)與另一 LukS-PV亞單位連結的LukS-PV亞單位。在一個實施例中，連結物為融合蛋白或化學連結物。在另一個實施例中，本發明提供相對于其野生型序列在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一個中包括突變(包括至少一個氨基酸取代、插入或缺失)的PVL抗原。在一個實施例中，突變選自由以 下各突變組成的群組(i)防止PVL與細胞膜結合的突變，
(ii)防止跨膜域的主干或細胞質末端為LukS或LukF而展開的突變，(iii)阻斷LukF-PV與LukS-PV的裝配的突變，(iv)阻斷Ca+2通道活性的突變，(V)阻斷PVL孔的活性的突變，(vi)改變LukS-PV的磷酸化位點的突變，(vii)破壞LukF-PV的膜結合槽的突變，(viii)產生PVL抗原的“氨基閂”的N末端缺失的突變，和(ix)產生防止主干前部展開且插入膜中的半胱氨酸雙突變體的突變。在一個特定實施例中，PVL抗原包括LukF-PV亞單位，其包括至少一個選自由(i)E191A、(ii)R197A、(iii)W176A和(iv)Y179A組成的群組的突變。在另一個特定實施例中，PVL抗原包括LukS-PV亞單位，其包括至少一個選自由(i)T28F、
(ii)T28N和(iii)T28D組成的群組的突變。在一個實施例中，PVL抗原選自由以下各PVL抗原組成的群組(a)包括LukF-PV亞單位且不包括LukS-PV亞單位的PVL抗原；(b)包括LukS-PV亞單位且不包括LukF-PV亞單位的PVL抗原；(c)包括突變型LukF-PV亞單位和野生型LukS-PV亞單位的PVL抗原；(d)包括野生型LukF-PV亞單位和突變型LukS-PV亞單位的PVL抗原；和(e)包括突變型LukF-PV亞單位和突變型LukS-PV亞單位的PVL抗原。本發明也提供一種包括金黃色葡萄球菌的PVL抗原和醫藥學上可接受的載劑的組合物。PVL抗原可為任何上述抗原。在一個實施例中，組合物包括LukF-PV亞單位和LukS-PV亞單位。在另一個實施例中，組合物包括LukF-PV亞單位且不包括LukS-PV亞單位，或包括LukS-PV亞單位且不包括LukF-PV亞單位。在一個實施例中，組合物進一步包括一種或一種以上其它細菌抗原。在一個特定實施例中，所述一種或一種以上其它細菌抗原選自由5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌和336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、α-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白組成的群組。本發明也提供一種與任何上述PVL抗原特異性結合的抗體。本發明也提供一種用于治療或預防金黃色葡萄球菌感染的方法，其包括向有需要的個體投與包括如本文中所述的抗體或抗原的組合物。所述方法可進一步包括投與選自由抗感染劑、抗生素和抗菌劑組成的群組的藥劑。在一個實施例中，抗生素藥劑選自由萬古霉素(vancomycin)、克林霉素(clindamycin)和溶葡萄球菌素(Iysostaphin)組成的群組。在一個實施例中，金黃色葡萄球菌感染選自由以下各感染組成的群組社區獲得性甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)感染、皮膚或軟組織感染、壞死性肺炎、乳腺炎、壞死性筋膜炎、沃-弗綜合征(Waterhouse Friderichsen Syndrome)、CA-MRSA敗血癥和由表達PVL抗原的金黃色葡萄球菌菌株引起的感染。在一個實施例中，所述方法進一步包括投與一種或一種以上其它細菌抗原的一種或一種以上抗體。在一個特定實施例中，所述一種或一種以上抗體選自由以下針對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、α -毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白抗原的抗體組成的群組，所述金黃色葡萄球菌抗原選自由5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌和336型金黃色葡萄球菌組成的群組。在另一個實施例中，所述方法進一步包括投與一種或一種以上其它細菌抗原。在一個特定實施例中，所述一種或一種以上其它細菌抗原選自由5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌和336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PSl、表皮葡萄球菌GPl、α -毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白組成的群組。本發明也提供一種用于制造超免疫特異性IVIG制劑的方法，其包括(i)向個體投與PVL抗原，(ii)自所述個體采集血 漿，以及(iii)純化來自個體的免疫球蛋白。在另一個實施例中，本發明提供一種用于制造超免疫特異性IVIG制劑的方法，其包括(i)對未經投與PVL抗原的個體篩檢高滴度的抗PVL抗體，(ii)自所述個體采集血漿，以及(iii)純化來自個體的免疫球蛋白。本發明也提供一種組合物，其包括(i)靜脈內免疫球蛋白(IVIG)組合物，其包括與金黃色葡萄球菌的Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)抗原特異性結合的抗體，和(ii)醫藥學上可接受的載劑，其中所述IVIG組合物包括比正常IVIG中所發現高至少兩倍的抗PVL抗體滴度。本發明的其它方面更詳細地描述于下文中。


圖I :用抗LukS-PV和抗LukF-PV兔抗血清進行rLukS_PV和rLukF_PV抗原的免疫擴散。
具體實施例方式本發明提供用于治療和預防金黃色葡萄球菌感染(包含CA-MSRA感染)的組合物和方法。所述組合物包括如所定義且在下文更詳細描述的PVL抗原，或與PVL抗原特異性結合的抗體。所述方法包括向有需要的患者投與根據本發明的PVL抗體或PVL抗原組合物。在以下論述中，除非另外說明，否則“一”和“所述”意謂“一個或一個以上”。另外，在關于替換物列表描述本發明的方面時，本發明包含替換物列表的任何個別成員或子群和其一種或一種以上的任何組合。I.組合物Ponton Valentine 殺白細胞素(PVL)抗原本發明提供包括PVL抗原的組合物。如本文中所用，“PVL抗原”指的是經分離且經純化的野生型PVL抗原、重組PVL抗原、僅包括LukS-PV亞單位或僅包括LukF-PV亞單位的PVL抗原和包括LukS-PV與LukF-PV亞單位的PVL抗原。舉例來說，可使用一系列色譜步驟自金黃色葡萄球菌原型V8菌株(ATCC 49775)來純化包括LukS-PV和LukF-PV亞單位的野生型 PVL 抗原。Finck-Barbancon 等人，Biochim. Biophys. Acta, 1182 :275-82(1993)和 Prevost 等人，Infect. Tmmun.，63 :4121-9 (1995)。根據一個實施例，PVL抗原為重組PVL抗原。如本文中所用，術語“重組PVL抗原”表示由重組DNA方法制造的PVL抗原。所屬技術領域中眾所周知這些重組DNA方法。一般來說，重組PVL抗原不含野生型PVL在天然狀態下所締合的其它蛋白質和細胞組分(例如，金黃色葡萄球菌細胞中所存在的蛋白質和細胞組分)。根據一個實施例，PVL抗原為經純化PVL抗原。如本文中所用，術語“經純化PVL抗原”表示已至少部分與野生型PVL在天然狀態下所締合的其它蛋白質和細胞組分(例如，金黃色葡萄球菌細胞中所存在的蛋白質和細胞組分)分離的PVL抗原。在本發明的特定實施例中，提供單一 PVL亞單位的制劑，諸如不含LukS-PV的LukF-PV制劑，或不含LukF-PV的LukS-PV制劑。可通過(例如)展示對抗LukF-PV制劑而產生的抗體不與LukS-PV特異性結合或對抗LukS-PV制劑而產生的抗體不與LukF-PV特異性結合來確定這些制劑的純度。在一些實施例中，通過單一 PVL亞單位在不含(且未經改造以含有)編碼其它PVL亞單位的功能基因的宿主中的重組表達來獲得包括單一 PVL亞單位的制劑。 根據本發明的一個方面，LukF-PV和LukS-PV亞單位經重組表達于大腸桿菌(E. coli)細胞中且隨后使用兩步柱流程自大腸桿菌純化，所述兩步柱流程包含離子交換色譜(例如使用SP-sepharose柱),接著親和色譜(例如使用陶瓷輕磷灰石(CHT)柱)。如本文中所述的PVL抗原也涉及PVL抗原片段、LukS-PV亞單位片段和LukF-PV亞單位片段。適用于本發明中的片段具有類似于野生型PVL抗原的抗原性質。舉例來說，PVL抗原片段、LukS-PV亞單位片段和LukF-PV亞單位片段為誘導特異性識別野生型PVL抗原的抗體的片段。根據本發明的PVL抗原(包含LukS-PV和/或LukF-PV亞單位和PVL和亞單位片段)可在LukS-PV亞單位、LukS-PV亞單位中的至少一個或兩個中包括一個或一個以上氨基酸插入、取代或缺失。舉例來說，LukF-PV或LukS-PV序列內的一個或一個以上氨基酸殘基可由相似極性的另一種氨基酸(其充當功能等價物)取代，產生沉默轉變。序列內的氨基酸替代物可選自氨基酸所屬種類的其它成員。舉例來說，非極性(疏水性)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包含精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。或者，可進行非保守性氨基酸改變，其包含在去毒的情形中在下文更詳細論述的改變。因此，在一個實施例中，對PVL抗原進行非保守性氨基酸改變以使蛋白質去毒或穩定蛋白質且防止插入膜中。如本文中所用的“PVL抗原”也指已經歷諸如以下修飾的PVL抗原，所述修飾⑴防止PVL與細胞膜結合，(ii)防止跨膜域的主干或細胞質末端為LukS-PV或LukF-PV而展開，(iii)阻斷LukF-PV與LukS-PV的裝配，(iv)阻斷Ca+2通道活性，(v)阻斷PVL孔的活性，(vi)改變LukS-PV的磷酸化位點，(vii)破壞LukF-PV的膜結合槽，(viii)產生PVL抗原的“氨基閂”的N末端缺失，或(ix)產生防止主干前部展開且插入膜中的半胱氨酸雙突變體。如在下文更詳細所述，可通過包含化學處理、連結和突變(諸如氨基酸缺失或取代)的方法來實現一種或一種以上這些修飾。在一個實施例中，PVL抗原經去毒。如本文中所用，“經去毒”PVL抗原不允許通過嗜中性粒細胞的細胞鈣通道流入二價陽離子或通過PVL孔流入單價陽離子或形成PVL孔。可通過所屬技術領域中已知的技術(諸如光或熒光顯微鏡檢查、流式細胞測量和熒光測定法)來測量對于人類多形核嗜中性粒細胞(PMN)的PVL毒性。參看Staali等人，J Membrane Biol. 162 :209-216(1998) ;Meunier 等人，Cytometry 21 :241-247(1995)；Werner 等人，Infection and Immunity :70 (3) 1310-1318 (2002)。舉例來說，PVL 抗原誘導PMN膜上現有細胞|丐通道的開放。可通過使用突光指示劑Fura2、Fluo3、Fluo4或Calcium3來監控鈣通道的開放和隨后的鈣流入，且已形成用于測量流入使用DMSO分化為成熟嗜中性粒細胞(PMN)的細胞中的Ca+的流入量的檢定。另外，PVL通過將其亞單位插入細胞膜中而形成單獨孔。可通過單價陽離子流入或流出細胞的流量來測量孔形成。溴化乙錠也能夠通過這些孔進入細胞中，且因此，溴化乙錠可用于追蹤單價陽離子的流入。當溴化乙錠進入細胞中時，其經核酸插入且產生熒光發射。可使用熒光顯微鏡視覺上檢測或使用熒光計定量檢測細胞內熒光。同樣，諸如PBFI (結合磷酸根的熒光指示劑)和Na-Green (其與鉀和鈉螯合)的熒光指示劑可用于監控PVL孔的形成。在一個實施例中，PVL抗原經分子去毒，其可由所屬技術領域中已知的方法來實現，所述方法包含由原始Kunkel方法使用單鏈模板(Kunkel,TA,Proc. Acad. Sci. ,USA,82 488-492 (1985))或雙鏈 DNA 模板(Papworth 等人，Strategies, 9 (3) :3-4(1996))以及通過 PCR 克隆(Braman，J.(編)，IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS，第 2 版 Humana Press,Totowa, NJ(2002) ；Ishii 等人，Meth. Enzymoh, 293, 53-71 (1998) ;Kammann 等人，NucleicAcids Res.，17 :5404(1989) ;Hemsley 等人，Nucleic Acids Res.，17 :6545-6551 (1989)；Giebel 等人，Nucleic Acids Res.，18 :4947(1990) ;Landt 等人，Gene，96 :125-128 (1990)；Stemmer 等人，BioTechniques, 13 :214-220 (1992) ;Marini 等人，Nucleic Acids Res. ,21 2277-2278(1993);和 Weiner 等人，Gene, 151 :119-123(1994))在質粒模板上進行引物延伸。在另一個實施例中，PVL抗原是通過化學方式(例如，通過將PVL抗原與另一分子連結)去毒。此實施例涵蓋未通過除與另一分子連結之外的任何方式去毒的PVL抗原。在另一個實施例中，PVL抗原與另一抗原(諸如另一 PVL抗原)連結。舉例來說，LukF-PV亞單位可與另一 LukF-PV亞單位或LukS-PV亞單位連結。盡管不希望受限于任何理論,但本發明人相信LukS亞單位與Luk-F亞單位直接連結或通過連接子連結可通過防止抗原折疊為其毒性狀態(例如，通過防止S和F亞單位以展現毒性所需的方式相互作用)來使抗原去毒。在另一個實施例中，PVL抗原是與另一抗原(諸如另一細菌抗原，其包含革蘭氏陰性(gram-negative)或革蘭氏陽性(gram-positive)抗原、另一葡萄球菌抗原和/或細菌多糖)連結。舉例來說，PVL抗原可與一種或一種以上諸如選自由以下各抗原組成的群組的抗原的其它金黃色葡萄球菌抗原連結5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌、336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PSl、表皮葡萄球菌GP1、a -毒素、LTA、MSCRAMM、其它保護性抗原或毒素和其組合。在另一個實施例中，PVL抗原是通過在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一個中突變(包括至少一個氨基酸取代、插入或缺失)來去毒。組合物(諸如疫苗)可包括LukF-PV亞單位和LukS-PV亞單位中的一種或兩種。根據一個實施例，組合物(諸如疫苗)也包括一種或一種以上金黃色葡萄球菌抗原，諸如選自由以下各抗原組成的群組的抗原5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌、336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、a-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白、其它保護性抗原或毒素和其組合。因此，例如，本發明的疫苗組合物可包括PVL-5型連結物、PVL-8型連結物、PVL-336型連結物、PVL-PSl連結物、PVL-GPl連結物、PVL- a -毒素連結物、PVL-LTA連結物或PVL-MSCRAMM連結物，其中這些連結物中的任一種都包括PVL抗原。在一個實施例中，PVL抗原經衍生且與另一細菌抗原連接，所述另一細菌抗原為諸如另一金黃色葡萄球菌抗原，諸如選自由以下各抗原組成的群組的抗原5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌、336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、a-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白、其它保護性抗原或毒素和其組合。舉例來說，5型或8型抗原可由I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)活化以形成半胱胺衍生物。PVL是 經N-琥珀酰亞胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)丙酸酯(STOP)修飾且隨后通過硫醇置換與T5 CP或T8 CP的半胱胺衍生物連結。可由尺寸排阻色譜將所得連結物與未連結抗原分離。在另一個實施例中，(例如)通過使用溴化氰或四氟硼酸I-氰基-4-二甲基氨基-吡啶鹽活化抗原上的羥基且通過含有親核性基團的連接子或在不存在連接子的情況下與PVL結合而將PVL抗原與336型抗原連結。例如參看Kohn等人，FEBS Lett.，154 :209 210(1993) ;Schneerson 等人，J. Exp. Med. , 152 :361-376(1980) ;Chu 等人，INfect. Tmmun.，40 :245-256(1983) ;Kossaczka 等人，Infect. Immun. ,68 :5037-5043(2000)。所得連結物隨后可與未連結抗原分離。類似方法可用于將PVL抗原與LTA連結。在另一個實施例中，PVL抗原與a-毒素(a -溶血素)(一種由金黃色葡萄球菌的大多數病原性菌株產生的成孔且溶血外蛋白)連結。在另一個實施例中，(例如)通過經由EDC促進的反應用己二酸二酰肼(ADH)修飾表皮葡萄球菌PSl或GPl來制備PSl的己二酸酰肼衍生物(PSlAH)而將PVL抗原與PSl或GPl抗原連結。PVL抗原隨后經琥珀酰化且PVL的琥珀酸衍生物(PVLsuc)與PSlAH連結，其是由EDC介導。類似方法可用于將PVL抗原與LTA連結。存在所屬技術領域中已知的其它連結方法，例如高碘酸鹽氧化接著還原性胺化、碳化二亞胺處理和其它方法和/或其不同組合，其可提供PS與蛋白載體的直接或間接(通過連接子)共價結合且因此得到連結物。舉例來說，可通過使用迅速與伯胺反應的不可逆同雙官能交聯劑(諸如雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯(BS3))來處理PVL抗原和蛋白質而將PVL抗原與另一蛋白質連結。也參看Partis等人，J. Prot. Chem. 2 :263-77 (1983)。不考慮用于將抗原與載體蛋白連結的方法，PS與蛋白載體的共價結合將PS自T細胞非依賴性抗原轉化為T細胞依賴性抗原。結果，與在單獨投與PS后未觀測到所述反應相反，PS-蛋白質連結物會在免疫動物中引起PS特異性抗體反應。如上所述,本發明涵蓋包括LukS-PV和LukF-PV或包括兩種LukF-PV亞單位或包括兩種LukS-PV亞單位的融合蛋白。這些融合蛋白可重組產生或通過化學連結產生。在一個實施例中，本發明的融合蛋白是使用適當建構的DNA序列表達。舉例來說，編碼LukF-PV亞單位的核酸序列可直接或間接與編碼LukS-PV亞單位的核酸序列連接，例如，LukF-PV核酸的一端可與LukS-PV核酸的一端直接連接，或編碼亞單位的序列可由“連接子”或“間隔基”核酸序列分隔。本發明包含包括在其3'端與LukS-PV亞單位直接或間接連接的LukF-PV亞單位的融合蛋白。本發明也包含包括在其3'端與LukF-PV亞單位直接或間接連接的LukS-PV亞單位的融合蛋白。本發明涵蓋LukF-PV和LukS-PV亞單位在相同或不同構筑體中、在相同或不同表達載體中的重組表達。因此，例如，編碼LukF-PV的DNA序列和編碼LukS-PV的DNA序列可存在于單一構筑體中，其與適當調控元件(例如，啟動子和終止子)可操作地連接以進行表達。或者，本發明涵蓋使用兩種構筑體進行表達，一種用于表達LukF-PV且另一種用于表達LukS-PV0在所述實施例中，各亞單位序列可用(例如)驅動各亞單位的表達的不同啟動子與其自身調控元件可操作地連接。表達構筑體可存在于相同或不同表達載體中。因此，本發明涵蓋重組轉錄包括LukS-PV與LukF-PV亞單位的序列的單一 mRNA，或重組轉錄至少兩種mRNA轉錄產物,其中每一種都編碼特定亞單位。當使用單一表達載體時,使用單一宿主細胞進行表達，且其將產生兩種亞單位。當使用一種以上表達載體時，可使用一種或一 種以上宿主細胞進行表達。舉例來說，單一細胞可用于所有載體，或一種細胞可用于每一載體，或一種細胞可用于一種載體且另一種細胞可用于一種或一種以上載體。因此，本發明涵蓋多種細胞系，其中每一種都重組表達特定亞單位。由一種細胞系表達的亞單位可經分離且隨后與已經表達且自另一細胞系分離的另一亞單位連接。在這個實施例中，兩種亞單位可經化學連接，諸如通過化學連結。當然，本發明也涵蓋由非重組方法獲得的PVL亞單位(諸如天然PVL的亞單位，或自細胞或模型葡萄球菌系統的基因組表達的亞單位)的化學連結。不考慮PVL融合蛋白是使用重組技術還是化學連結產生，LukF-PV和LukS-PV亞單位中的一種或兩種可包括一種或一種以上氨基酸突變，其包含相對于野生型序列的氨基酸取代、插入或缺失，諸如在下文中所述的那些。因此，PVL融合蛋白可包括(i)突變型LukF-PV和野生型LukS-PV，(ii)突變型LukS-PV和野生型LukF-PV，或(iii)突變型LukF-PV 和突變型 LukS-PV。在本發明的一些實施例中，PVL抗原是通過修飾PVL抗原以在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列中的至少一個氨基酸中含有突變而去毒。例示性突變可防止PVL與細胞膜結合，防止跨膜域的“主干”或細胞質末端為LukS-PV或LukF-PV而展開，阻斷LukF-PV亞單位和/或LukS-PV亞單位的裝配，阻斷Ca+2通道活性，阻斷PVL孔的活性，改變LukS-PV的磷酸化位點和/或破壞LukF-PV的膜結合槽。例示性突變可產生或消除內部二硫鍵，產生或消除磷酸化位點，或消除LukF-PV與Luks-PV亞單位之間的相互作用。突變可包含至少一個點突變、至少一個氨基酸缺失或其組合。在一個實施例中，LukS-PV亞單位的Thr28是經(例如)亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸或半胱氨酸取代。在此位置上的突變影響白細胞毒素的裝配。參看Guillet 等人，J. Biol. Chem.，279 :41028-41037 (2004)。在另一個實施例中，在來自Y-溶血素的LukS的Thr246處進行突變。已描述此氨基酸位置負責Y溶血素的白細胞溶解活性。參看Nariya等人，FEBS Letters,415 96-100(1997)，其是以引用的方式全部并入本文中。也可進行在假定磷酸化位點Thr244處的點突變或LukS-PV的殘基Thr240-Thr244的缺失，因而破壞LukS-PV的白細胞溶解活性。本文中涵蓋的其它突變包含在LukF-PV的跨膜域的“主干”或細胞質末端中(諸如在 ValllO, Valll4、Tyrll6、Tyrll8、Ilel22、Ilel24 和 / 或 Leul28 處)的至少一個點突變和/或至少一個缺失，和在LukS-PV的主干中的類似突變，其包含Vall03、Vall05、Leul09、Tyrlll、Ilell3 和 / 或 Phell7。本發明也涵蓋 Leul28_Serl35、Ilel24_Serl29 和/或Serl25-Leul28之間的一個或一個以上氨基酸缺失。這些突變能夠促成PVL的成孔活性的 Ca+2 誘導的斷開。參看 Moussa 等人,FEBS Letters, 461 :280-286 (1999)和 Werner 等人，Infect. Immun. ,70 :1310-1318 (2002)，其是以引用的方式全部并入本文中。本發明中涵蓋的其它突變包含產生PVL抗原的“氨基閂”的N末端缺失的那些突變，諸如在 LukF-PV 的 Alal-Vall2、LukF-PV 的 Ilel24_Serl29 和 / 或 LukS-PV 的Aspl-Ile7、Phell7-Serl22處的缺失。另外，產生半胱氨酸雙突變體以在P -夾層核心與主干前部之間產生二硫鍵以防止主干前部展開且插入膜中的突變也適用于本發明中。舉例來說，LukF-PV 半胱氨酸突變體(諸如 Vall3Cys_Lysl36Cys ；Asp43Cys-Tyr116Cys或 Ser45Cys_Glyll9Cys)或 LukS-PV 半胱氨酸突變體(諸如 Ile7Cys_Asnl30Cys ；和Asp38Cys-Ilell3Cys)或類似突變體涵蓋于本發明中。舉例來說，本發明涵蓋在LukS-PV的3 -夾層接觸區域中的突變。因此，在此區域中的某些突變包含(但不限于)T28F、T28N和 T28D，例如，在LukS-PV的第28位或在對應于第28位的氨基酸位置處的蘇氨酸經苯丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸置換。本發明也涵蓋在LukS-PV的磷酸化位點中的突變，其消除或降低在那個位點處的磷酸化。因此，那個區域的一個特定突變包含(但不限于)T244A。本發明中涵蓋的其它突變包含(例如)在假定磷脂酰膽堿結合槽中破壞LukF-PV的膜結合槽的那些突變。舉例來說，在位置N173、W176、Y179、E191和R197處的LukF-PV突變體涵蓋于本發明中。在這種情況下，本發明所涵蓋的一個特定突變包含(但不限于)E191A，例如，在LukF-PV的第191位或在對應于第191位的氨基酸位置處的谷氨酸經丙氨酸置換。類似地，其它特定LukF-PV突變包含N173A、W176A、R197A和Y179A。本發明涵蓋具有一個或一個以上上述突變的組合的PVL抗原，諸如，具有氨基閂缺失和在LukS-PV的磷酸化位點處的點突變體的PVL抗原。組合物/疫苗本發明提供包括PVL抗原和醫藥學上可接受的載劑的組合物(包含疫苗)。PVL抗原可為任何上述PVL抗原，其包含經純化野生型PVL抗原或重組PVL抗原。PVL抗原可包含LukF-PV亞單位、Luk-S PV亞單位或兩者,或可包括LukF-PV亞單位的PVL片段、Luk-SPV亞單位的PVL片段或兩種亞單位的PVL片段。PVL抗原可為如上所述的經修飾和/或去毒抗原，且可與另一 PVL抗原或另一分子(諸如另一細菌抗原)連結。PVL抗原可包含一個或一個以上上述突變，諸如兩個突變。所屬技術領域中通常已知用于制造疫苗的方法。例如參看Di Tommaso等人，Vaccine, 15 :1218-24(1997)和 Fattom 等人，Infect, and Immun. 58 :2367-2374(1990)和64 :1659-1665(1996)。根據本發明的疫苗通常包括醫藥學上可接受的載劑。醫藥學上可接受的載劑為可用作葡萄球菌抗原的媒劑的物質，因為在疫苗施用的情況下所述物質為惰性或另外醫學上可接受，以及可與活性劑相容。除適合賦形劑之外，醫藥學上可接受的載劑可含有常規疫苗添加劑，如稀釋劑、佐劑和其它免疫刺激劑、抗氧化劑、防腐劑和增溶劑。舉例來說，可添加聚山梨醇酯80以將聚集降到最低且充當穩定劑，且可添加緩沖劑以進行pH值控制。本文中所述的疫苗調配物允許相對容易地且在不改變組合物的情況下添加佐劑。
另外，本發明的疫苗可經調配以包含“儲槽”組分以增加抗原物質在投藥位點處的滯留。舉例來說，除佐劑(如果使用一種)之外，可添加明礬(氫氧化鋁或磷酸鋁)、QS_21、硫酸葡聚糖或礦物油來提供此儲槽效應。抗體本發明也提供包括與醫藥學上可接受的載劑一起調配的與金黃色葡萄球菌的PVL抗原(諸如任何上述PVL抗原)特異性結合的抗體(“PVL抗體”)的組合物。本發明的抗體組合物可包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段或其組合。如本文中所述，“PVL抗體”指的是全長(即，天然存在或由正常免疫球蛋白基因片段重組方法形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性結合)部分(包含抗體片段)。抗體片段為抗體的一部分，諸如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv等等。不考慮結構，抗體片段與由全長抗體識別的相同抗原結合，且在本發明的上下文中，與PVL抗原特異性結合。所屬技術領域中眾所周知制造和篩檢抗體片 段的方法。可由眾多不同方法來制備本發明的PVL抗體。舉例來說，PVL抗體可從經投與PVL抗原的個體獲得，或從如下文更詳細論述的PVL抗體篩檢血漿獲得。根據另一個實施例，PVL抗體是由重組方法制造。可由所屬技術領域中眾所周知的技術來制造重組單克隆抗體。可使用PVL抗原作為免疫原，由類似于美國專利申請案2002/0009453 (Haurum等人)中所述方法的方法來制備重組多克隆抗體。根據本發明的PVL抗體可為鼠類、人類或人源化抗體。人源化抗體是一種重組蛋 白，其中來自一個物種的抗體(例如，嚙齒動物抗體)的CDR從嚙齒動物抗體的重和輕可變鏈轉移到人類重鏈和輕鏈可變域中。抗體分子的恒定域來源于人類抗體的恒定域。用于制造人源化抗體的方法已為所屬技術領域所熟知。在一個實施例中，與LukS-PV特異性結合的抗體不與LukF-PV特異性結合。在另一個實施例中，與LukF-PV特異性結合的抗體不與LukS-PV特異性結合。因此，例如，抗LukS-PV抗體可能不與LukF-PV交叉反應且抗LukF-PV抗體可能不與LukS-PV交叉反應。在一些實施例中，本發明的抗體(例如)通過與天然或融合蛋白上的構象抗原決定部位特異性結合而與當其以天然狀態(例如，其天然折疊狀態和/或其與其它PVL亞單位復合的天然狀態)存在時PVL上存在的PVL亞單位(例如，LukF-PV或LukS-PV)上的抗原決定部位、或與包括那個PVL亞單位的融合蛋白上存在的抗原決定部位特異性結合。在其它實施例中，本發明的抗體(例如)通過與線性抗原決定部位特異性結合而與一個PVL亞單位(無論其三維構型如何)特異性結合。 在一些實施例中，本發明的抗體與一種或一種以上本文中所揭示的突變型PVL抗原特異性結合，但不與那種抗原的野生型形式交叉反應。因此，本發明包含與本文中所述的重組或化學連結融合蛋白中的一種特異性結合的抗體。此外，本發明的抗體可與一種或一種以上本文中所揭示的突變型PVL抗原特異性結合，但不與那種抗原的野生型形式交叉反應。在一些實施例中，突變型PVL抗原經設計以具有天然存在PVL突變體或變異體的突變，且對這種突變型PVL抗原具特異性的抗體適用于靶向天然存在PVL突變體或變異體的診斷和治療方法中。本發明的一種方法需要向個體投與一種或一種以上這些抗體。在一個實施例中，抗體為抗LukS-PV抗體。在另一個實施例中，抗體為抗LukF-PV抗體。在另一個實施例中，一種或兩種這些抗體(例如，抗LukF-PV抗體和/或抗LukS-PV抗體)是同時或依次投與。或者，僅向個體投與一種抗體。
可由常規方法來獲得上述抗體。舉例來說，可向個體投與PVL抗原(如上所定義)且可由標準方法自從個體采集的血漿純化所得IgG。用于獲得PVL抗體的PVL抗原可為任何上述PVL抗原。在一個實施例中，根據上述教示(包含通過突變或連結)使用于獲得PVL抗體的PVL抗原無毒。或者，可重組制備抗體。抗體組合物本發明包含適于投藥的抗體組合物，諸如包括抗體和醫藥學上可接受的載劑的組合物。可由所屬技術領域中已知的方法針對任何投藥途徑(包含靜脈內、肌肉內、皮下和經皮)調配抗體組合物。在一個實施例中，抗體組合物為IVIG組合物。如本文中所述，“IVIG”指的是適于靜脈內投藥的免疫球蛋白組合物。如本文中所用的“特異性IVIG”指的是對一種或一種以上PVL抗原(諸如任何上述PVL抗原)具特異性的IVIG。根據一個實施例，本發明提供PVL抗體組合物，其包括包含與金黃色葡萄球菌的PVL抗原(諸如任何上述PVL抗原)特異性結合的抗體的IVIG組合物和醫藥學上可接受的載劑。根據一個實施例，包括PVL抗體的IVIG組合物是獲自來源于經PVL抗原刺激的供體個體的血漿。根據此實施例，PVL抗原(諸如任何上述)經投與個體(諸如人類或其它動物(包含小鼠))以刺激PVL抗體的產生。在一個實施例中，PVL抗原是以疫苗形式投與。作為疫苗的組分，諸如通過任何上述方式將PVL抗原去毒。隨后(例如)通過經由常規血漿分餾方法從血漿獲得免疫球蛋白而從個體獲得與PVL抗原特異性結合的抗體。在此實施例的一個特定方面中，獲得呈超免疫特異性免疫球蛋白(IGIV)制劑形式的PVL抗體。“超免疫特異性IVIG”指的是含有高滴度的PVL抗體的IVIG制劑。可通過向個體投與PVL抗原，自個體采集血漿且經由常規血漿分餾方法從血漿獲得超免疫特異性IVIG來獲得超免疫特異性IVIG組合物。或者，可從自未經投與PVL抗原的個體(即，未經刺激個體)獲得的血漿來獲得超免疫特異性IVIG組合物。在這個實施例中，對來自未經刺激個體的血漿篩檢PVL抗原(包含僅包括LukS-PV、LukF-PV中的一種或兩種的PVL抗原)的高滴度抗體。根據一個實施例，對血漿篩檢比在標準IVIG制劑中通常存在的含量高兩倍或更高的PVL抗體滴度，且使用這種血漿來制備超免疫特異性IVIG組合物。此外，個體可為人或動物。用于獲得PVL抗體組合物的PVL抗原可為任何上述PVL抗原，其包含經純化野生型PVL抗原，重組PVL抗原，包括LukF-PV亞單位和LukS-PV亞單位中的一個或兩個的PVL抗原，具有一個或一個以上氨基酸插入、取代的PVL抗原，在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一個中具有缺失的PVL抗原，經修飾PVL抗原，PVL抗原的片段或去毒PVL抗原(包含通過與另一 PVL抗原或另一分子連結而去毒的PVL抗原)。根據一個實施例，本發明的PVL抗體組合物(包含IVIG和超免疫特異性IVIG組合物)進一步包括一種或一種以上葡萄球菌抗原(諸如下文所述的那些)的一種或一種以上抗體。如下所述，例示性金黃色葡萄球菌抗原包含5型、8型和336型葡萄球菌抗原。例示性表皮葡萄球菌抗原包含PSl和GP1。舉例來說，組合物可包括選自由金黃色葡萄球菌抗原組成的群組的抗原的抗體，所述抗原為諸如選自由5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌、336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、a -毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白、其它保護性抗原或毒素和其組合組成的群組的抗原。因此，在一個實施例中，本發明的IVIG組合物包括至少一種與PVL抗原結合且也與不同葡萄球菌抗原結合的抗體，或至少一種與PVL抗原結合的抗體和至少一種與不同葡萄球菌抗原結合的抗體。其它可選抗原/抗體組分除上述PVL抗原或抗體之外，本發明的PVL抗原或PVL抗體組合物還可包括其它抗原或抗體，諸如一種或一種以上金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗原(諸如在Fattom等人，Infec. and Immun. ,58 :2367-2374(1990)和 Fattom 等人，Infec. and Immun. , 64 1659-1665(1996)中所述的5型和8型抗原)或其抗體。另外或其它，組合物可包括美國專利第5，770，208號；第6，194，161號；第6，537，559號中所述的336型金黃色葡萄球菌抗原或美國專利第5，770，208號和第6，194，161號中所述的336型葡萄球菌CPS抗原，或其抗體。所屬技術領域中已知其它金黃色葡萄球菌抗原,例如參看Adams等人，J. Clin.Microbiol，26 :1175-1180 (1988) ；Rieneck 等人，Biochim.Biophys. Acta.，1350 :128-132(1977)和 0' Riordan 等人，Clin. Microbiol Rev. , 17 :218-34 (2004)，且包括那些抗原或其抗體的組合物也適用于本發明中。類似地，也可根據本發明使用表皮葡萄球菌抗原(或其抗體)。表皮葡萄球菌II型抗原(也被稱作PSl)揭示于美國專利第5，961，975號和第5，866，140號中。此抗原為酸性多糖抗原，其可由包括使凝集ATCC 55254的抗血清的表皮葡萄球菌的分離物(II型分離物)的細胞生長的方法獲得。適用于本發明中的另一種葡萄球菌抗原描述于WO 00/56357中。此抗原包括呈a構型的氨基酸和N-乙酰化氨基己糖，不含0-乙酰基且不含己糖。其與以ATCC202176寄存的葡萄球菌菌株的抗體特異性結合。對抗原的氨基酸分析展示存在約39 25 16 10 7的摩爾比率的絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、纈氨酸和蘇氨酸。氨基酸構成抗原分子的約32重量％。此抗原或其抗體可包含在本發明的PVL抗原(或PVL抗體)組合物中。用于本發明中的另一種葡萄球菌抗原描述于已公開美國專利申請案2005/0118190中，且被稱作表皮葡萄球菌“GP1”抗原。許多凝固酶陰性葡萄球菌菌株(包含表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)和人葡萄球菌(Staphylococcus hominis))中常見這種抗原。該抗原可從以ATCC 202176寄存的表皮葡萄球菌菌株獲得。此抗原或其抗體可包含在本發明的PVL抗原(或PVL抗體)組合物中。抗原也包含屬于脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白和其它保護性抗原或毒素的那些抗原。方法用于治療和預防細菌感染的方法本發明提供使用包括PVL抗體或PVL抗原的組合物來治療或預防金黃色葡萄球菌感染的方法。本文中所述治療和預防方法的目標患者群體包含已經感染細菌病原體(諸如金黃色葡萄球菌(包含CA-MSRA)或表皮葡萄球菌)或處于細菌病原體感染風險中的哺乳動物(諸如人類)。根據一個實施例，本發明提供使用包括PVL抗體的組合物來治療或預防金黃色葡萄球菌感染的方法。根據這種方法，向有需要的患者投與包括與金黃色葡萄球菌的PVL抗原特異性結合的抗體和醫藥學上可接受的載劑的組合物。抗體組合物可包括任何上述PVL抗體，且視情況可為IVIG組合物、超免疫特異性IVIG組合物、包括重組PVL抗體(包含包括PVL抗體片段的組合物)的組合物或包括人源化PVL抗體的組合物。PVL抗體組合物可與抗感染劑、抗生素或抗菌劑組合投與。例示性抗感染劑包含(但不限于)萬古霉素、克林霉素和溶葡萄球菌素。例示性抗生素和抗菌劑包含(但不限于)青霉素酶抗性青霉素、頭孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯類(carbapenem),其包含萬古霉素、溶葡萄球菌素、青霉素G、氨比西林(ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、頭抱噻吩 (cephalothin)、頭抱唑啉(cefazolin)、頭抱氨節(cephalexin)、頭抱拉定(cephradine)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢西丁(cefoxitin)、亞胺培南(imipenem)、美洛培南(meropenem)、慶大霉素(gentamycin)、替考拉寧(teicoplanin)、林可霉素(Iincomycin)和克林霉素。所屬技術領域中眾所周知這些抗生素的劑量。例如參看MERCK MANUAL OFDIAGNOSIS AND THERAPY, § 13，Ch. 157，第 100 版(Beers 和 Berkow 編，2004)。抗感染劑、抗生素和/或抗菌劑可在投藥之前組合，或與所揭示IVIG組合物同時或依次投與。在一些實施例中，投與相對較少劑量的PVL抗體組合物(諸如一個或兩個劑量)，且使用常規抗生素療法，其通常涉及在數天或數周時期內的多個劑量。因此，抗生素可在一段時期(諸如至少5天、10天或甚至14天或更多天)內每日服用一次、兩次或三次或更多次，而PVL抗體組合物通常僅投與一次或兩次。然而，所屬領域的一般技術人員可選擇且調節PVL抗體組合物和抗生素的不同劑量、給藥時限和相對量。本發明的PVL抗體組合物適于治療社區獲得性甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)感染，其包含(但不限于)壞死性肺炎、乳腺炎、壞死性筋膜炎、沃-弗綜合征、CA-MRSA敗血癥和皮膚與軟組織感染。所屬領域的一般技術人員可由常規方法來確定適當劑量。劑量可取決于眾多因素，諸如感染的嚴重性、所用特定PVL抗體組合物、投藥頻率和個體詳情(諸如個體的年齡、體重和免疫狀況)。在一些實施例中，劑量將為每公斤體重至少50mg PVL抗體組合物(mg/kg)，其包含至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少 250mg/kg、至少 500mg/kg、至少 750mg/kg 和至少 1000mg/kg。給藥頻率和給藥次數也取決于眾多因素，諸如感染的嚴重性和患者免疫狀態。然而，熟練醫師可使用所屬技術領域中已知的常規方法來確定適當給藥方案。在一些實施例中，可至少每隔一天一次(包含至少每天一次和至少每天兩次)投與劑量。有效治療感染所需的劑量數也可改變。舉例來說，可能需要投與一個、兩個、三個、四個或更多劑量的PVL抗體組合物。具有弱化免疫系統或尤其嚴重感染的個體可能需要更多劑量和/或更頻繁給藥。本發明中也揭示使用本文中所述的抗原組合物來治療和/或預防金黃色葡萄球菌感染的方法。這些方法包括向有需要的個體投與包括PVL抗原(如上所述)和醫藥學上可接受的載劑的組合物(諸如疫苗)。本文中所述治療和預防方法的目標個體群體包含已經感染細菌病原體(諸如金黃色葡萄球菌)或處于感染其的風險中的哺乳動物(諸如人類)。這些方法包含預防CA-MRSA感染，其包含皮膚和軟組織感染、壞死性肺炎、乳腺炎、壞死性筋膜炎、沃-弗綜合征和CA-MRSA敗血癥。如上所述，根據本發明的疫苗包括PVL抗原和醫藥學上可接受的載劑。根據一個實施例，PVL抗原如上所述經去毒。根據一個特定實施例，PVL是通過與另一分子連結(包含通過與另一 PVL抗原或另一細菌抗原連結)來去毒。本發明也提供使用包括與另一細菌抗原(諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌抗原，諸如葡萄球菌抗原或其它細菌多糖)連結的PVL抗原(如上所述)的抗原組合物(諸如疫苗)來治療和/或預防細菌感染的方法。本文中所述治 療和預防方法的目標個體群體包含已經感染細菌病原體(諸如金黃色葡萄球菌)或處于感染其的風險中的哺乳動物(諸如人類)。根據一個實施例，PVL抗原如上所述經去毒。根據一個特定實施例，PVL是通過與另一分子連結(包含通過與另一 PVL抗原或另一細菌抗原連結)來去毒。抗原組合物或疫苗可與諸如一種或一種以上金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗原(諸如上述5型、8型和336型抗原)和/或所屬技術領域中已知的其它金黃色葡萄球菌的其它抗原一起投與。另外或其它，組合物或疫苗可與一種或一種以上表皮葡萄球菌抗原(諸如上述PSl抗原)或與任何其它葡萄球菌抗原(諸如在WO 00/56357中所述的抗原和在已公開美國專利申請案2005/0118190中所述的抗原(GPl)(上述))一起投與。本發明的組合物或疫苗也可包括諸如a-毒素、脂磷壁酸(LTA)或微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白或其它保護性抗原或毒素的抗原。所述一種或一種以上其它抗原可與PVL疫苗組合物分別投與或可包含在PVL疫苗組合物中。在如上文所提供的組合療法中，抗原組合物或疫苗可與抗感染劑、抗生素和/或抗菌劑組合投與。同樣，可在存在或不存在佐劑的情況下投與根據本發明的組合物或疫苗。如果使用佐劑，那么其經選擇以避免佐劑誘發的毒性。根據本發明的組合物或疫苗可另外包括P -葡聚糖或粒細胞集落刺激因子(尤其，如在1999年9月14日申請且在2002年3月12日頒予的美國專利第6，355，625號中所述的P -葡聚糖)。可由所屬技術領域中的常規方法來確定本發明的抗原組合物或疫苗的治療有效量。熟練技術人員將了解量可隨著疫苗的組成、特定個體的特性、所選投藥途徑和所治療的細菌感染的性質而改變。通用指導可見于(例如)國際協調會議(InternationalConference on Harmonisation)的公開案和 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第27和28章,第484-528頁(Mack Publishing Company 1990)中。典型疫苗劑量可在約Iu g至約400 ii g的范圍內。組合物或疫苗可以任何所需劑型(包含可經靜脈內、肌肉內、皮下或經皮投與人的劑型)提供。組合物或疫苗可以單一劑量投與或根據多劑量方案投與。投藥可通過許多途徑進行，其包含皮下、皮內和靜脈內。在一個實施例中，使用肌肉內投藥。熟練技術人員將認識到投藥途徑將視欲治療的細菌感染和疫苗的組成而改變。用于鑒別PVL感染的方法本發明也提供用于篩檢樣品中PVL抗原的存在的方法。根據本發明的這個方面，任何上述PVL抗原都可與樣品接觸，且可評估樣品中存在的抗體與任何PVL抗原之間的結合。所屬技術領域中眾所周知以抗體為基礎的檢定，且本發明涵蓋使用本發明的抗體來檢測PVL抗原(包含天然PVL類毒素和任何上述PVL抗原)的定性與定量檢定。可測試PVL抗原的樣品未加限制且包含(例如)來自患者的生物樣品(諸如血液或血清樣品)、細胞培養物上層清液樣品、細菌樣品和懷疑含有PVL抗原的任何其它樣品。參考以下實例對本發明進行進一步描述，這些實例僅為說明目的而提供。本發明并不限于這些實例，而是包含從本文中所提供的教示顯而易見的所有改變。實例實例I. rLukF-PV和rLukS_PV野牛型鈍系的產牛通過使用具有微小更改(將溶葡萄球菌素添加到再懸浮緩沖液中)的根據制造商(Promega)的方案，從ATCC以寄存編號49775寄存的金黃色葡萄球菌菌株(產生高含量PVL的PVL原型菌株)來分離基因組DNA。 使用已公開PVL基因序列(GenBank寄存編號X72700和AB006796)來設計寡核苷酸引物以將LukF-PV和LukS-PV基因分別分類。正向引物經設計以消除假定信號肽且并A NcoI位點。NcoI位點的ATG經設計以充當翻譯的起始密碼子,從而避免添加由載體編碼的N末端氨基酸。反向引物經設計在終止密碼子下游不遠處并入BamHI位點。使用標準PCR擴增條件由PCR從金黃色葡萄球菌ATCC 49775來擴增Iuks-PV和Iukf-PV基因。使用NcoI和BamHI位點將PCR產物克隆入pTrcHisB中。另外，含有Iuks-PV和Iukf-PV基因的NcoI-BamHI插入物隨后經亞克隆入pET28 (Novagen)中。實例2. rLukF-PV和rLukS_PV融合蛋白鈍系的產牛使用PCR克隆技術來建構PVL融合蛋白，其為由通過將Iukf-PV和Iuks-PV基因剪接在一起而得到的核苷酸序列編碼的人類改造蛋白。通過具有構型rLukF-PV-aa連接子-rLukS-PV或rLukS-PV-aa連接子-rLukF-PV的短氨基酸連接子將PVL亞單位共價連接。這種融合蛋白不具有細胞毒性，因為兩種亞單位不能以展現毒性所需的方式(例如，以正確插入白細胞膜中所需的方式)裝配和/或相互作用。融合蛋白適用于將宿主中的抗體刺激為PVL的兩種亞單位(例如，LukS-PV和LukF-PV)和作為整體的PVL毒素。實例3. rLukF-PV和rLukS_PV突變體純系的產牛使用由制造商(Stratagene)所述的方案且使用pTrcHisBLukF-PV和/或PTrcHisBLukS-PV作為模板，使用QuickChange突變誘發試劑盒來建構以下突變體rLukF-PV 突變體A I124-S129 ；E191A ；N173A ；R197A ；W176A 和 Y179A。rLukS-PV 突變體:A Dl-117 ; A Fl 17-S122 ；T28D ；T28F ；T28N 和 T244A。遺傳學技術領域中的一般技術人員了解這種命名為標準術語。也就是說，“ A I124-S129”意謂在rLukF-PV突變體中缺失(“ A”)在第124位由異亮氨酸終止且在第129位由絲氨酸終止的區域。類似地，“ AD1-I17”表明在rLukS-PV突變體中缺失殘基I (天冬氨酸)至17 (異亮氨酸)。同樣，熟練技術人員知道“E191A”意謂在第191位的谷氨酸由丙氨酸置換，“N173A”表明rLukF-PV突變體具有在第173位代替天然存在天冬酰胺(N)的丙氨酸(~，且11974”意謂在第197位的精氨酸(R)被丙氨酸(A)取代；等等。其它特定涵蓋的突變體包含rLukF-PV突變體產生內部二硫鍵的雙突變體V12C/K136C ； AW176 ；AG175-G177 ； A R197 和 A S196-Q198。
rLukS-PV突變體消除磷酸化位點的T244A或A T244 ;產生穩定二硫鍵的雙突變體 I7C/N130C 或雙突變體 D38/I113C，A T28 ； AV27-Q29 ; A G115-G124，和其它雙突變體，諸如 T28D/AD1-I7。使用制造商的方案(Gene Choice)將所有構筑體轉化入大腸桿菌GClO細胞中。使用ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing進行測序。將具有正確序列的所有純系轉化入大腸桿菌GClO或大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS中進行表達。實例4. rLukS-PV和rLukF-PV野牛型和突奪型杭原的表汰和鈍化在振蕩燒瓶中，將含有rLukS-PV或rLukF-PV質粒的大腸桿菌菌株GClO或BL21 (DE3)pLysS在37°C下在選擇性培養基中培養至對數中期階段且使用最終濃度為ImM的異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導2-3小時。通過離心收集細胞。通過SDS-PAGE和Western印跡分析對振蕩燒瓶培養物進行的分析展示在約33_34kDa下的譜帶，其在誘導之前不明顯。將丸粒狀細胞再懸浮于細胞溶解緩沖液(20mM Na2HPO4,50mM NaCl、5%甘油，pH6. 5)中，且在室溫下用2mg/g溶菌酶處理,接著用Misonix超聲波儀進行超聲波降解。通過離心收集細胞溶菌液的上層清液。將可溶性蛋白質裝載于經細胞溶解緩沖液預平衡的陽離子交換柱上。用于20mM Na2HP04、5%甘油(pH 6.5)緩沖液中的50mM至500mM NaCl的線性梯度來洗提經結合LukS-PV或LukF-PV蛋白。將含有rLukS-PV或rLukF-PV的洗提部分匯集且施加于陶瓷羥磷灰石柱上。自于20mM Na2HP04、5%甘油(pH 6.8)緩沖液中的50mMNaCl至750mM NaCl的線性梯度來洗提純rLukS-PV或rLukF-PV。已使用同一方法將rLukF-PV和rLukS_PV重組蛋白和突變體純化且發現其純度極高(對于rLukF-PV和rLukS-PV來說分別為約33或34kDa單一譜帶；根據SDS-PAGE/考馬斯藍(Coomassie Blue)染色,純度大于95% )。對于Western印跡分析來說,蛋白質經轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上且使用所屬技術領域中已知的標準程序使用rLukF-PV 或rLukS-PV的一級單克隆抗體進行處理。印跡證實存在大致在約33-34kDa下具有譜帶的rLukS-PV和rLukF-PV抗原。另外,rLukS-PV和rLukF-PV的N末端測序證實存在IukS-PV和Iukf-PV基因產物。實例5. rLukF-PV或rLukS_PV多克降抗體的制備和表征間隔兩周三次將以I : I比率的rLukS-PV或rLukF-PV (各50 ii g)與佐劑(CFA，接著IFA)注射入新西蘭白兔中。在針對抗原的免疫擴散檢定中LukS-PV抗血清將rLukS-PV識別為相同抗原，而rLukF-PV抗血清識別LukF-PV。rLukS-PV或rLukF-PV不與異種抗血清反應。這表明rLukS-PV疫苗或rLukF-PV疫苗都不產生與異種蛋白質亞單位交叉反應的抗體。因此，本發明的疫苗適用于獲得不與LukF-PV交叉反應的抗LukS抗體，和不與LukS-PV交叉反應的抗LukF抗體。將陽性血液組合且用蛋白質G柱純化IgG。經純化的抗PVL IgG用于如下所述的動物模型中。實例6. rLukF-PV或rLukS~PV抗原的免疫化學分析進行雙免疫擴散以測定LukS-PV和LukF-PV抗血清的特異性，以及測定PVL亞單位抗原的抗原性。簡單地說，將每孔10 ill的200ii g/ml各PVL抗原(外部孔)和每孔IOiU抗血清(中心孔)裝載于I %瓊脂糖凝膠中且使其在潮濕環境中擴散整夜。隨后將瓊脂糖凝膠在PBS中洗滌且連續壓縮三次，隨后干燥且用考馬斯藍染色。對凝膠分析沉淀帶，其是在抗原與抗體反應且形成免疫復合物時形成。如圖I中所示，rLukF-PV抗原與具有抗LukF-PV抗體的單一沉淀帶反應，而rLukS-PV抗原不與此抗血清交叉反應。類似地，rLukS-PV抗原與具有抗LukS-PV抗體的單一沉淀帶反應，而rLukF-PV抗原不與這些抗體交叉反應。因此這些抗體對同源PVL抗原具特異性。測試以下抗原
權利要求
1.一種組合物,其包括金黃色葡萄球菌的Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)抗原的LukS-PV亞單位和醫藥學上可接受的載劑,但不包括LukF-PV亞單位,所述組合物進ー步包括一種或多種選自金黃色葡萄球菌抗原的細菌抗原，所述細菌抗原選自如下群組5型金黃色葡萄球菌、8型金黃色葡萄球菌和336型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PSl、表皮葡萄球菌GP1、α-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分識別粘附基質分子(MSCRAMM)蛋白。
2.根據權利要求I所述的組合物，其中所述LukS-PV亞單位經分子去毒。
3.根據權利要求I所述的組合物，其中所述LukS-PV亞單位通過化學方式去毒。
4.根據權利要求I所述的組合物，其中所述LukS-PV亞單位與另ー抗原連結。
5.根據權利要求I所述的組合物，其中所述LukS-PV亞單位相對于野生型序列包括一個或多個氨基酸突變，所述氨基酸突變包括氨基酸取代、插入或缺失。
6.根據權利要求5所述的組合物，其中LukS-PV亞單位的Thr28是經亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸或半胱氨酸取代。
7.權利要求1-6中任一所述的組合物，其用于治療或預防金黃色葡萄球菌感染。
8.權利要求1-6中任一所述的組合物在制備治療或預防金黃色葡萄球菌感染的藥物中的用途。
9.根據權利要求8所述的用途，其中包括投予選自由抗感染劑、抗生素和抗微生物劑組成的群組的藥劑。
10.根據權利要求9所述的用途,其中所述抗生素藥劑選自由萬古霉素(vancomycin)、克林霉素(clindamycin)和溶葡萄球菌素(Iysostaphin)組成的群組。
11.根據權利要求8-10中任一所述的用途，其中所述金黃色葡萄球菌感染選自由以下組成的群組社區獲得性甲氧西林(methicillin)抗性金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)感染、皮膚或軟組織感染、壞死性肺炎、乳腺炎、壞死性筋膜炎、沃-弗綜合征(WaterhouseFriderichsen Syndrome)、CA-MRSA敗血癥和由表達PVL抗原的金黃色葡萄球菌菌株引起的感染。
全文摘要
本發明涉及用于治療金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；S.aureus)感染的組合物和方法。具體來說，本發明提供包括Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)抗原的疫苗、與PVL抗原結合的抗體和含有其的組合物，制造這些組合物的方法和用于治療金黃色葡萄球菌感染(包含那些社區獲得性甲氧西林(methicillin)抗性感染)的方法。本發明還提供PVL抗體，包含對單一PVL亞單位具特異性的PVL抗體；和PVL抗原，包含經連結及經突變的PVL抗原。
文檔編號A61K45/00GK102698261SQ20121014150
公開日2012年10月3日 申請日期2006年6月13日 優先權日2005年6月13日
發明者金伯利·路易斯·泰勒, 阿里·易卜拉欣·法托姆 申請人:葛蘭素史密斯克藍生物品公司