抗人il-4受體的高親和力人抗體的制作方法

專利名稱：：抗人il-4受體的高親和力人抗體的制作方法抗人IL-4受體的高親和力人抗體
背景技術：
：白細胞介素-4(IL-4，也稱為B細胞刺激因子或BSF-1)最初特征在于，其響應低濃度的針對表面免疫球蛋白的抗體，能夠刺激B細胞增殖。已證實IL-4具有廣泛的生物活性，包括刺激T細胞、肥大細胞、粒細胞、巨核細胞和紅細胞的生長。IL-4誘導靜止B細胞中II類主要組織相容性復合體分子的表達，增強受激B細胞對IgE和IgGl同種型的分泌。IL-4的生物活性由IL-4的特異性細胞表面受體介導。人IL-4受體a(hlL-4R)(SEQIDNO:l)在例如美國專利號5，599，卯5、5,767,065和5,840,869中有所描述。hlL-4R的抗體在美國專利號5,717,072中有所描述。IL-4的生物活性由IL-4的特異性細胞表面受體介導。人IL-4受體a(hlL-4R)(SEQIDNO:l)在例如美國專利號5,599,905、5,767,065和5,840,869中有所描述。hlL-4R的抗體在美國專利號5,717,072和7,186,809中有所描述。制備可用作人的治療劑的抗體的方法包括生成嵌合抗體和人源化抗體(見例如US6，949，245)。見例如WO94/02602(Abgenix公司)和US6,596,541(RegeneronPharmaceuticals)(兩者的公布均明確并入本文作為參考)，其中描述了生成能夠生產人抗體的非人轉基因小鼠的方法。使用抗hlL-4R的抗體的方法在美國專利號5,714,146;5,985,280和6,716,587中有所描述。發明簡述第一方面，本發明提供了特異性結合人白細胞介素-4受體(hlL-4R)的人抗體，優選重組的人抗體。該人抗體的特征在于，其以高親和力與hlL-4R結合，并且能夠中和hlL-4活性。在具體實施方案中，該人抗體能夠阻斷hIL-13/hIL-13Rl復合體與hlL-4R的結合，從而抑制hIL-13的信號傳導。該抗體可為全長(例如lgGl或IgG4抗體)或可以僅包含抗原結合部分(例如Fab、F(ab，)2或scFv片段)，可以經1奮飾以實現其功能性，例如消除殘留的效應功能(Reddy等人，(2000)J.Immunol.164:1925-1933)。在一個實施方案中，本發明提供了以約200pM或更小的Ko特異性結合hlL-4R(SEQIDNO:l)的抗體或其抗原結合片段，如用表面等離振子共振測量。在更具體的實施方案中，該抗體或其抗原結合部分顯示小于約150pM，或小于約50pM，或小于約20pM的Ku。在多種實施方案中，該抗體或抗原結合片段以約200pM或更小的IC5Q阻斷hlL-4活性，如用STAT6螢光素酶生物測定法測量。在更具體的實施方案中，該抗體或抗原結合片段顯示如用螢光素酶生物測定法測量的約150pM或更小，或約100pM或更小或甚至約500pM或更小的ICs。。在多種實施方案中，該抗體或抗原結合片段阻斷hIL-13活性，用STAT6螢光素酶生物測定法測量的ICso為約100pM或更小。在更具體的實施方案中，該抗體或抗原結合片段顯示ICso為約75pM或更小，或約50pM或更小，或甚至約20pM或更小。第二方面，本發明的抗體包含重鏈可變區(HCVR)，其選自SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、391、395、399、403、407、411、415、419、423、427、431、435、439、443、447、451、455、459、463、467、471、475、479、483、487、491、495、499、503、507、511、515、519、523、527、531、535、539、543、547、551、555、559、563、567、571、575、579和581,或與其基本上相似的序列。第三方面，本發明的抗體包含輕鏈可變區(LCVR)，其選自SEQIDNO:ll、27、43、59、75、91、107、123、130、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、389、393、397、401、405、409、413、417、421、425、429、433、437、441、445、449、453、457、461、465、469、473、477、481、485、489、493、497、501、505、509、513、517、521、625、529、533、537、541、545、549、553、557、561、565、569、573和577，或與其基本上相似的序列。在一個實施方案中，本發明的抗體或抗體片段包含HCVR和LCVR(HCVR/LCVR),所述HCVR/LCVR選自SEQIDNO:3/11、19/27、35/43、51/59、67/75、83/91、99/107、115/123、131/139、147/155、163/171、179/187、195/203、211/219、227/235、243/251、259/267、275/283、291/299、307/315、323/331、339/347、355/363、371/379、387/389、391/393、395/397、399/401、403/405、407/409、411/413、415/417、419/421、423/425、427/429、431/433、435/437、439/441、443/445、447/449、451/453、455/457、459/461、463/465、467/469、471/473、475/477、479/481、483/485、487/489、491/493、495/497、499/501、503/505、507/509、511/513、515/517、519/521、523/525、527/529、531/533、535/537、539/541、543/545、547/549、551/553、555/557、559/561、563/565、567/569、.571/573、575/577、579/59和581/59。在優選實施方案中，抗體或抗體片段包含選自SEQIDNO:51/59、259/267、275/283、291/299、579/59或581/59的HCVR/LCVR。第四方面，本發明提供編碼HCVR的核酸分子，其中該核酸分子為核苷酸序列，其選自SEQIDNO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、2卯、306、322、338、354、370、386、3卯、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、450、454、458、462、466、470、474、478、482、486、4卯、494、498、502、506、510、514、518、522、526、530、534、538、542、546、550、554、558、562、566、570、574、578和580，或與其具有至少95%同源性的基本上相同的序列。第五方面，本發明提供編碼LCVR的核酸分子，其中核酸分子為這樣的序列，其選自SEQIDNO:IO、26、42、58、74、卯、106、122、129、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、388、392、396、400、404、408、412、416、420、424、428、432、436、440、444、448、452、456、460、464、468、472、476、480、484、488、492、496、500、504、508、512、516、520、524、528、532、536、540、544、548、552、556、560、564、568、572和576，或與其具有至少95%同源性的基本上相同的序列。在一個實施方案中，本發明的抗體包含由核苷酸序列對編碼的HCVR和LCVR，該核苷紗列對選自SEQIDNO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386簡、390/392、394/396、398/400、402/404、406/408、410/412、414/416、418/420、422/424、426/428、430/432、434/436、438/440、442/444、446/448、450/452、454/456、458/460、462/464、466/468、470/472、474/476、478/480、482/484、486/488、490/492、494/496、498/500、502/504、506/508、510/512、514/516、518/520、522/524、526/528、530/532、534/536、538/540、542/544、546/548、550/552、554/556、558/560、562/564、566/568、570/572、574/576、578/59和580/59。在優選實施方案中，抗體或抗體片段包含由選自SEQIDNO:50/58、258/266、274/282、290/298、578/58或580/58的核苷酸序列編碼的HCVR/LCVR。第六方面，本發明提供特異性結合hlL-4R的抗體或抗體的抗原結合片段，其包含三個重鏈和三個輕鏈互補決定區(CDR)，其中重鏈CDR1包含式&-X2_X3-X4-X5—X6一X7_X8(SEQIDNO:582)的氨基^f列，其中X'-GIy;X2=Tyr或Phe;X3=Thr或I;X4=Phe;X、Asn或Arg;X6=Ser;X7=Tyr;X8=Gly;重鏈CDR2包含式Xi-X2_X3—X4一X5—X6一X7—X8(SEQIDNO:583)的氨基酸序列，其中^-Ile，x2-Ser或Arg，x3-Thr或Tyr,X4=Tyr或Asp，X5=Asn或Gly，X6=Gly或Ser，X7=Lys或Asn,X8=Thr;重鏈CDR3包含式Xi-X2-X3_X4—X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18_X19-X20-X21(SEQIDNO:584)的氨基斷列，其中X1=Ala或Val，X2=Argi^Lys，X3=Asp或Glu,x4:Gly或Glu,X5=Ala或Arg，X6=Arg或Ser，X7=lie或Gly，x8:Val或Ser，x9-Val或Trp，X10=Ala或Phe，X"-Gly或Asp，X^:Thr或Pro，X。-Thr或缺失，X14=Pro或缺失，X15=Tyr或缺失，X"-Tyr或缺失，X"-Tyr或缺失，X"-Gly或缺失，X19=Met或缺失，X^-Asp或缺失，X"-Val或缺失；輕鏈CDR1包含式X1—X2—X3—X4—X5—X6(SEQIDNO:585)的氨基酸序列，其中X'二Gln，X2=AspiSlAla，X3=Ile，X4=SerilAsn，X5=Asn或Ile，X^Trp或Phe;輕鏈CDR2包含式X1-X2-X3(SEQIDNO:586)的氨基酸序列，其中X"Ala或Val，X^Ala或Thr，X3=Ser;和輕鏈CDR3包含式X1—X2—X3-X4—X5—X6—X7—X8—X9(SEQIDNO:587)的氨基酸序列，其中X1=Gln，X2=Gln，X3=Ala或Tyr，X4=Asn,X5=Ser,x6-Phe或His，X7=Pro，x8-Ile或Trp，X9=Thr。第七方面，本發明提供包含重鏈CDR3和輕鏈CDR3的抗體或抗原結合片段，其中重鏈CDR3結構域選自SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361和377;輕鏈CDR3結構域選自SEQIDNO:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369和385。在優選實施方案中，重鏈和輕鏈CDR3選自序列對SEQIDNO:57和65;265和273;281和289;及297和305。在其它實施方案中，本發明提供人抗體或抗體片段，其包含重鏈CI)R1結構域，該CDR1結構域選自SEQIDNO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357和373，或與其基本上相似的序列；重鏈CDR2結構域，該CDR2結構選自SEQIDNO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359和375，或與其基本上相似的序列；重鏈CDR3結構域，該CDR3結構i或選自SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361和377，或與其基本上相似的序列；輕鏈CDR1結構域，該CDR1結構域選自SEQIDNO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365和381，或與其基本上相似的序列；輕鏈CDR2結構域，該CDR2結構域選自SEQIDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367和383，或與其基本上相似的序列；和輕鏈CDR3結構域，該CDR3結構域選自SEQIDNO:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369和385，或與其基本上相似的序列。在優選實施方案中，抗體或抗原結合片段包含重鏈CDRSEQIDNO:53、55、57和輕鏈CDRSEQIDNO:61、63、65;重鏈CDRSEQIDNO:261、263、265和輕鏈CDRSEQIDNO:269、271、273;重鏈CDRSEQII)NO:277、279、281和輕鏈CDRSEQIDNO:285、287、289;重鏈CDRSEQIDNO:293、295、297和輕鏈CDRSEQIDNO:301、303、305。第八方面，本發明提供了抗體或抗原結合片段，其包含來自HCVR的三個CDR和來自LCVR的三個CDR，其中HCVR/LCVR選自51/59、579/59、581/59、259/267、275/283和291/299。在一個實施方案中，本發明提供包含重鏈和輕鏈CDR3的人抗體或抗體片段，其中重鏈CDR3由核苷#列編碼，該核苷酸序列選自SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360和376;輕鏈CDR3由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列選自SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384。在其它實施方案中，本發明提供人抗體或抗體片段，其包含重鏈CDR1結構域，該重鏈CDR1結構域由選自SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356和372的核苷酸序列，或與其具有至少95%同源性的基本上相同的序列編碼；重鏈CDR2結構域，該重鏈CDR2結構域由選自SEQIDNO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358和374的核苷酸序列，或與其具有至少95%同源性的基本上相同的序列編碼；重鏈CDR3結構域，該重鏈CDR3結構域由選自SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360和376的核苷酸序列，或與其具有至少95%同源性的基本上相似的序列編碼；輕鏈CDR1結構域，該輕鏈CDR1結構域選自SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364和380的核苷酸序列，或與其具有至少95。/。同源性的基本上相似的序列編碼；輕鏈CDR2結構域，該輕鏈CDR2結構域由選自SEQIDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、l卯、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366和382的核苷酸序列，或與其具有至少95%同源性的基本上相似的序列編碼；和輕鏈CDR3結構域，該輕鏈CDR3結構域由選自SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384的核苷酸序列，或與其具有至少95%同源性的基本上相似的序列編碼。在優選實施方案中，抗體或抗原結合片段包含由核苷酸序列SEQIDNO:52、54、56編碼的重鏈CDR和由核苷酸序列SEQIDNO:60、62、64編碼的輕鏈CDR;由核苷酸序列SEQIDNO:260、262、264編碼的重鏈CDR和由核苷酸序列SEQIDNO:268、270、272編碼的輕鏈CDR;由核苷酸序列SEQIDNO:276、278、280編碼的重鏈CDR和由核苷酸序列SEQIDNO:284、286、288編碼的輕鏈CDR;由核苷酸序列SEQIDNO:292、294、296編碼的重鏈CDR和由核苷酸序列SEQIDNO:300、302、304編碼的輕鏈CDR。本發明包括具有修飾的糖基化模式的抗hlL-4R抗體。在一些應用中，除去不期望的糖基化位點的修飾、或在寡糖鏈上缺乏巖藻糖部分的抗體，可以用于例如增加抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)功能(見Shield等人，(2002)JBC277:26733)。在其它應用中，可以進4亍半乳糖基化4奮飾以改變補體依賴性細胞毒性(CDC)。第九方面，本發明提供攜帶本發明的核酸分子的重組表達載體，和已包含有這樣載體的宿主細胞，以及通過培養本發明的宿主細胞制備本發明抗體或抗原結合片段的方法。宿主細胞可以是原核或真核細胞，優選宿主細胞是大腸桿菌細胞或哺乳動物細胞，如CHO細胞。第十方面，本發明提供包含特異性結合hlL-4R的重組人抗體和可接受的載體的組合物。第十一方面，本發明提供用本發明的抗體或其抗原結合部分抑制hlL-4活性的方法。在具體實施方案中，本發明的抗體還阻斷hlL-13/hlL-13Rl復合體與hlL-4R的結合。在一個實施方案中，該方法包含令hlL-4R與本發明的抗體或其抗原結合部分相接觸，從而抑制hlL-4或hIL-4/hIL-13活性。在另一實施方案中，該方法包含對患有病癥的人受試者施用本發明的抗體或其抗原結合部分，所述病癥可以通過抑制hlL-4或hIL-4/hIL-13活性得到改善。所治療的病癥是可以通過消除、抑制或降低hlL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到好轉、改善、抑制或預防的任何疾病或病癥。本發明還包括權利要求1至9任一項所述的抗體或抗體的抗原結合片段在生產藥物中的用途，所述藥物用于減輕或抑制人類中IL-4介導的疾病或病癥。用本發明的抗體或抗體片段治療的IL-4介導的或相關的病癥包括例如關節炎(包括膿毒性關節炎)、皰滲樣病(herpetiformis)、慢性特發性蕁麻滲、硬皮病、肥大性瘢痕、惠普爾病、良性前列腺增生、肺病癥、如輕微、中度或嚴重哮喘、炎性病癥如炎性腸病、變態反應、川崎氏病、鐮狀細胞病、丘-斯綜合征、格雷夫斯氏病、先兆子癇、干燥綜合征、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征、自身免疫性溶血性貧血、巴雷特食管、自身免疫性葡萄膜炎、肺結核和腎病。通過閱讀以下詳細說明，其它目的和優點將顯而易見。附圖簡述圖l(A-C).用基于OCTETTM的相繼結合測定法產生的抗體結合鐠圖評估。圖1(A)為柱形圖，表示當暴露于結合的抗原的一級抗體為對照抗體時所得到的結果。圖1(B)暴露于結合的抗原的一級抗體為VAB16F3-1。圖1(C)暴露于結合的抗原的一級抗體為VAK5H4-4。二級抗體1=對照；2=VX4E7-9;3=VX3F7畫6;4-VAB16G畫l;5=VAB16F3-1;6=VAB15C8-17;7=VAB11G8-1;8=VAB10C1-5;9=VAB10G8-19;10=VAB8G10-1;ll=VAB7B9-3;12=VAB6C10-14;13=VAB5C5-11;14=VAB3B4-10;15=VAB4D5-3;16=VAB1H1-2;17=VAK5H4隱4;18=VAK7G8-5;19=VAK8G11-13;20=VAK9C6-11;21=VAK10G6畫7;22=VAK11D4-1;23=VAK12Bll-9;24=VAK10G12-5。空心條形表示一級抗體的結合水平，實心條形表示二級抗體的額外結合。發明詳述在描述本發明的方法之前，應理解本發明不限于所描述的具體方法和實驗條件，因為這些方法和條件可以改變。還應理解本文使用的術語目的僅在于說明具體的實施方案，而非限制性的，因為本發明的范圍僅由隨附的權利要求書限定。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學用語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同。盡管在對本發明的實施或測試中，可以使用與本文所描述的相似或等同的任何方法和材料，現仍對優選方法和材料加以說明。定義本文中使用的術語"人IL4R，，(hlL-4R)，旨在指特異性結合白細胞介素-4(IL-4)的人細胞因子受體IL-4Ra(SEQIDNO:l)。術語"人白細胞介素-13"(hlL-13)指特異性結合IL-13受體的細胞因子，"HL-13/hlL-13Rl復合體"指hIL-13與hlL-13Rl復合體結合形成的復合體，該復合體結合hlL-4受體以起始生物活性。本文中使用的術語"抗體"，旨在指免疫球蛋白分子，其包含四條多肽鏈用二硫鍵互聯的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區。重鏈恒定區包含三個結構域CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區。輕鏈恒定區包含一個結構域(CL1)。VH和VL區還可以再細分為高度可變區，稱為互補決定區(CDR)，分散在更保守的、稱為構架區(FR)的區域中。各VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端以下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中使用的術語抗體的"抗原結合部分"(或簡單的"抗體部分"或"抗體片段")，指保留了與抗原(例如hlL-4R)特異性結合能力的抗體的一個或多個片段。已證實抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段完成。術語抗體的"抗原結合部分"所涵蓋的結合片段的實例包括(i)Fab片段，為由VL、VH、CL1和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，為包含由鉸鏈區的二硫鍵連接的兩個F(ab)，片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH結構域組成，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature241:544-546)，由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH由分離的基因編碼，可以用重組方法將它們連接起來，使用合成接頭可以將它們制成單個連續鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);見例如，Bird等人，(1988)Science242:423-426;和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也旨在涵蓋于術語抗體的"抗原結合部分"中。單鏈抗體的其它形式，如雙抗體，也涵蓋于其中(見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯:6444-6448)。本文中使用的"中和"或"阻斷"抗體，旨在指這樣的抗體，其與hIL-4R的結合導致對hlL-4和/或hIL-13生物活性的抑制。這樣的對hlL-4和/或hIL-13生物活性的抑制可以通過測量本領域中已知的hlL-4和/或hIL-13生物活性的一個或多個指標來評估，如hlL-4和/或IL-13誘導的細胞活化和hlL-4與hlL-4R的結合(見下文的實施例)。"CDR"或互補決定區為分散在更保守的、稱為構架區(FR)的區域中的高度可變區。在本發明的抗ML-4R抗體或片段的不同實施方案中，FR可以與人種系序列相同，或可以經過天然或人工4務飾。本文中使用的術語"表面等離振子共振"指這樣的光學現象，其允許例如4吏用BIAcoreTM系統(PharmaciaBiosensorAB),通過檢測生物傳感器基質中的蛋白質濃度變化來分析蛋白質的實時相互作用。術語"表位"為抗原決定簇，其與抗體分子可變區中稱為互補位的特定抗原結合位點相互作用。單個抗原可以有不止一個表位。表位可以是構象表位或線性表位。構象表位由來自線性多肽鏈的不同區段的空間上并列的氨基酸產生。線性表位由多肽鏈中相鄰的氨基酸殘基產生。在某些情況下，表位可以包括抗原上的糖類、磷酰基或磺酰基部分。當指核酸或其片段時，術語"實質同一性"或"實質上同一"表明，當以適當的核苷酸插入或缺失，與另一核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，用任何眾所周知的序列同一性算法，如下文討論的FASTA，BLAST或Gap測定，核苷酸堿基的核苷酸序列同一性為至少約95%，更優選至少約96%、97%、98%或99%。當用在多肽上時，術語"實質相似性"或"實質上相似"指當兩個肽序列用如GAP或BESTFIT程序使用默認空位權重進行最佳比對時，具有至少95%的序列同一性，甚至更優選至少98%或99%的序列同一性。優選不相同的殘基位置的差別是保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"指氨基酸殘基被具有相似化學性質(例如電荷或疏7jc性)的側鏈(R基團)的另一氨基酸殘基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能性質。在兩個或多個氨基酸序列與彼此的差別在于保守取代的情況下，序列同一性百分比或相似性程度可以由于取代的保守性而向上校正。做此調整的方法為本領域技術人員所熟知。見例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331。側鏈具有相似化學性質的氨基酸組的例子包括(l)脂肪族側鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(2)脂肪族羥基側鏈絲氨酸和蘇氨酸；(3)含酰胺的側鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族側鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)堿性側鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(6)酸性側鏈天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫側鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。可選地，保守替換為在Gonnet等人，(1992)Science256:144345中公開的PAM250對數似然性矩陣具有正值的任何改變。"適度保守性"替換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值的任何改變。多肽的序列相似性，也稱為序列同一性，通常用序列分析軟件進行測定。蛋白質分析軟件使用對包括保守氨基酸取代的多種取代、缺失和其它修飾賦值的相似性測量方法來匹配相似序列。例如，GCG軟件包含程序如Gap和Bestfit，可用于以缺省參數測定密切相關的多肽之間的序列同源性或序列同一性，所述多肽如來自不同物種生物的同源多肽，或野生型蛋白和其突變蛋白。見例如GCG版本6.1。還可用FASTA以缺省或推薦的參數比較多肽序列，GCG版本6.1.中的程序FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區域的比對和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同前)。當用本發明的序列與包含大量來自不同生物序列的數據庫相比較時，另一優選算法是計算機程序BLAST,特別是BLASTP或TBLASTN，使用缺省參數。見例如Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402。人抗體的制備產生人抗體的方法包括例如VeloclmmuneTM(RegeneronPharmaceuticals)、XenoMouseTM技術(Green等人,(1994)NatureGenetics7:13-21;Abgenix公司)、"微小基因座(minilocus)"方法和噬菌體展示(見，例如，US5,545,807，US6,787,637)。VeloclmmuneTM技術(US6,596,541)包含產生針對選定抗原的高特異性完全人抗體的方法。可以用本領域已知的任何方法免疫嚙齒類動物(見例如Harlow和Lane(1988)，同前；Malik和Lillehoj(1994)Antibodytechniques,AcademicPress,CA)。在優選實施方案中，將hIL-4R抗原與佐劑直接施用于小鼠以刺激免疫反應，該小鼠包含編碼人Ig重鏈可變區和k輕鏈可變區的DNA基因座(VelocImmuneTM，RegeneronPharmaceuticals,Inc.;US6,596,541)，所述佐劑為例如完全和不完全弗氏佐劑、MPL+TDM佐劑系統(Sigma)、或RIBI(胞壁酰二肽)(見O，Hagan(2000)VaccineAdjuvant,HumanPress,NJ)。佐劑通過將抗原隔離在局部藥庫可防止多肽的快速擴散，且可包含能刺激宿主免疫反應的因子。VelocImmuneTM技術包括建立轉基因小鼠，其基因組包含人重鏈和輕鏈可變區，其與小鼠內源性恒定區基因座有效連接，從而小鼠響應抗原刺激產生包含人可變區和小鼠恒定區的抗體。分離編碼抗體重鏈和輕鏈可變區的DNA，與編碼人重鏈和輕鏈恒定區的DNA有效連接。而后DNA在能夠表達完整人抗體的細胞中表達。在具體實施方案中，細胞為CHO細胞。抗體可在治療上用于阻斷配體-受體相互作用或抑制受體組分相互作用，而不是通過補體結合(補體依賴性細胞毒性)(CDC)和參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)殺死細胞。抗體的恒定區對抗體結合補體和介導細胞依賴性細胞毒作用的能力十分重要。因此，可依據是否期望抗體介導細胞毒作用而選擇抗體的同種型。人免疫球蛋白可以以與鉸鏈區異質性相關的兩種形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含約150-160kDa的穩定的四條鏈結構，其中二聚體通過鏈間的重鏈二硫鍵結合在一起。在第二種形式中，二聚體不通過鏈間的二硫鍵連接，并且形成約75-80kDa的分子，其包含共價偶聯的輕鏈和重鏈(半抗體)。即使在親和純化之后，也極其難以分離這些形式。第二種形式在多種完整IgG同種型中出現的頻率是由于但不限于與抗體的鉸鏈區同種型相關的結構差異。事實上，人IgG4鉸鏈的鉸鏈區中單個氨基酸取代可顯著減少第二種形式的出現(Angal等人，(1993)MolecularImmunology30:105),減少至使用人IgGl鉸鏈時通常觀察到的水平。本發明包含在鉸鏈、CH2或CH3區具有一個或多個突變的抗體，其在例如制備中可期望提高期望抗體形式的產量。本發明的抗體優選用VeloclmmuneTM技術制備。用目的抗原攻擊這樣的轉基因小鼠其中內源免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區被替換為相應的人可變區，從表達抗體的小鼠中回收淋巴細胞(如B細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞系融合以制備永生的雜交瘤細胞系，篩選和選擇這樣的雜交瘤細胞系，以鑒定生產特異于目的抗原的抗體的雜交瘤細胞系。可分離重鏈和輕鏈可變區的編碼DNA，與重鏈和輕鏈的期望的同種型恒定區相連。可在細胞中，如CHO中制備這樣的抗體蛋白。備選地，編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變區的DNA可直接從抗原特異性淋巴細胞中分離。在一個實施方案中，轉基因小鼠包含多達18種有功能的人可變重鏈基因和12種有功能的人可變k輕鏈基因。在另一實施方案中，轉基因小鼠包含多達39種人可變重鏈基因和30種人可變k輕鏈基因。在又一實施方案中，轉基因小鼠包含多達80種人可變重鏈基因和40種人可變k輕鏈基因。一般而言，本發明的抗體具有非常高的親和力，通過與固定在固相或處在溶液中的抗原的結合測定，通常具有Kd約10力到約10"2M。首先，分離具有人可變區和小鼠恒定區的高親和力嵌合抗體。如下文所述，表征并選擇具期望特征的抗體，所述特征包括對hlL-4R的結合親和力、阻斷hlL-4與hlL-4R的結合的能力、和/或對人類蛋白質的選擇性。用期望的人恒定區替換小鼠恒定區，以產生本發明的完全人抗體，例如野生型或修飾的IgG4或IgGl(例如，SEQIDNO:588,589，5卯)。盡管選擇的恒定區可才艮據具體用途有所不同，但高親和力的抗原結合和靶特異性特征位于可變區中。表位作圖和相關技術為篩選與特定表位結合的抗體，可使用常規交叉封閉測定法(cross-blockingassay)，如在Antibodies:ALaboratoryManual1988ColdSpringHarborLaboratory(Harlow和Lane編著)中描述的方法。其它方法包括丙氨酸掃描突變體、肽印跡(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)、或肽切割分析。此外，可使用諸如表位切除、表位提取和抗原的化學1'務飾(Tomer(2000)ProteinScience:9:487-496)等方法。修飾輔助分型(Modification-AssistedProfiling)(MAP)，也稱為基于抗原結構的抗體分型(AntigenStructure-basedantibodyProfiling)(ASAP)，是根據各抗體與經化學或酶促修飾的抗原表面結合特點的相似性，將大量針對相同抗原的單克隆抗體(mAb)加以分類的方法(美國專利申請公開號2004/0101920)。各種類可反映與另一種類表示的表位明顯不同或部分重疊的獨特的表位。此技術能夠快速過濾遺傳上相同的抗體，從而表征可以集中于遺傳上不同的抗體。當用于雜交瘤篩選時，MAP可幫助鑒定具有期望特征的稀有雜交瘤克隆。可使用MAP將本發明的hIL-4R抗體分類為結合不同表位的抗體組。可用于改變固定抗原的結構的物質有酶，如蛋白水解酶和化學試劑。抗原蛋白可固定于生物傳感器芯片表面或聚苯乙烯珠上。后者可用例如多路LuminexTM檢測法(multiplexLuminexTMdetectionassay)(盧明內斯公司(LuminexCorp.)，美國德州)處理。由于具有可處理多達100種不同類型小珠的多路分析容量，LuminexTM提供了幾乎無限的具有多種修飾的抗原表面，使得抗體表位分型的分辨率高于生物傳感器測定法。治療性給藥和劑型根據本發明的治療實體的施用可以用摻入制劑中以提供改善的轉移、遞送、耐受性等性質的適合載體、賦形劑和其它試劑實現。許多適合的劑型可在所有藥劑師均知的如下處方集中找到Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(2003,20版，LippincottWilliams&Wilkins)。這些劑型包括，例如，粉劑、糊劑、軟膏劑、膠凍劑、蠟類、油類、脂類、含脂類(陽離子或陰離子)的嚢泡(如LIPOFECTINTM)、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油乳劑和油包水乳劑、碳蠟(多種分子量的聚乙二醇)乳化劑、半固體凝膠劑、和含碳蠟的半固體混合物。只要制劑中的活性成份不由于配制失活，且制劑對于給藥途徑是生理相容和耐受的，那么任何上述混合物均可適合根據本發明的治療和療法。關于藥劑師所熟知的賦形劑和載體的額夕卜"f言息，也見Powell等人,"Compendiumofexcipientsforparenteralformulations"PDA(1998)JPharmSciTechnol.52:238-311和其中引述的文獻。本發明的治療分子可以用適合適應癥的方式對患者施用，例如，腸胃外、局部或通過吸入施用。如果注射的話，拮抗劑可以通過例如，關節內、靜脈內、肌內、損傷內、腹膜內或皮下路徑，通過快速濃注或連續輸注進行施用。在疾病或損傷處的局部給藥被認為是經皮遞送和從植入物中持續釋放。通過吸入遞送包括，例如，鼻或口腔吸入、使用噴霧器、吸入氣霧劑形式的拮抗劑等。其它的選擇包括眼藥水；口服制劑，包括丸劑、糖漿劑、錠劑或口香糖；和局部制劑如洗劑、凝膠劑、噴霧劑和軟膏劑。給藥的具體劑量和頻率可以根據如下因素而改變，如給藥途徑、待治療的疾病的性質和嚴重性、病癥是急性或慢性、及患者的身材和整體狀況。適宜的劑量可以用相關領域中已知的方法確定，例如在可以包括劑量遞增研究的臨床試驗中確定。本發明的治療分子可以單次或重復給藥。在具體實施方案中，抗體或抗體片段的給藥期間為至少一個月或更長，例如，一個月、兩個月、或三個月、或甚至不確定的時間。對于治療慢性狀況，長期治療通常最有效。然而對于治療急性狀況，較短時間的用藥，例如一至六周，可能就足夠了。一般而言，將治療劑施用直到患者對于選定的一種或多種指標表現出超過基線的、醫學上相關的程度的改善。IL-4的水平可以在用本發明的治療分子治療的過程中和/或之后進行監測。測量IL-4血清水平的方法為本領域已知，例如通過ELISA等。治療用途和組合治療本發明的抗體和抗體片段可以用于治療通過降低IL-4活性能夠得到改善、抑制或好轉的疾病和病癥。這些病癥包括特征在于異常或過量表達IL-4、或對于IL-4的生產產生異常宿主反應的病癥。用本發明的抗體或抗體片段治療的IL-4相關的病癥包括，例如，關節炎(包括膿毒性關節炎)、皰疹樣病、慢性特發性蕁麻滲、硬皮病、肥大性瘢痕、惠普爾病、良性前列腺增生、肺病癥如哮喘(輕微、中度或嚴重)、炎性病癥如炎性腸病、變態反應、川崎氏病、鐮狀細胞病、丘-斯綜合征、格雷夫斯氏病、先兆子癇、干燥綜合征、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征、自身免疫性溶血性貧血、巴雷特食管、自身免疫性葡萄膜炎、肺結核、特應性皮炎、潰瘍性結腸炎、纖維癥和腎病(見U.S.7,186,809)。本發明包含組合治療，其中抗IL-4R抗體或抗體片段與第二治"物質組合給藥。共同給藥和組合治療不限于同時給藥，但包括這樣的治療方案，其中抗IL-4R抗體或抗體片段在療程中給藥至少一次，該療程包含對患者施用至少一種其它的治療物質。第二治療物質可以是另一種IL-4拮抗劑如另一種抗體/抗體片段、或可溶細胞因子受體、IgE拮抗劑、抗哮喘藥物(皮質類固醇、非類固醇類物質、P激動劑、白三烯拮抗劑、黃噤呤、氟替卡松、沙美特羅、沙丁胺醇)，其可以通過吸入或其它適當方法遞送。在具體實施方案中，本發明的抗IL-4R抗體或抗體片段可以與IL-1拮抗劑如利納西普(rilonacept)，或IL-13拮抗劑一起施用。第二物質可以包括一種或多種白三烯受體拮抗劑以治療病癥如過敏性炎性疾病，例如，哮喘和過敏。白三烯受體拮抗劑的例子包括但不限于孟魯司特、普侖司特和扎魯司特。第二物質可以包括細胞因子抑制劑如TNF(依那西普，ENBRELtm)、IL-9、IL-5或IL-17拮抗劑中的一種或多種。實施例下列實施例意在為本領域普通技術人員提供如何制備和使用本發明的方法和組合物的完整公開和說明，而不是限制發明人所認為的本發明的范圍。就使用的數字(例如，量、溫度等)而言，已盡力確保精確，但應說明有一定實驗誤差和偏差。除非另有說明，份為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，壓力等于或接近大氣壓。實施例1.產生抗人IL-4受體的人抗體將包含編碼人Ig重鏈可變區和k輕鏈可變區的DNA基因座(VelocImmuneTM，RegeneronPharmaceuticals,Inc.;美國專利號6,596,541)的小鼠用人IL-4R(hlL-4R，SEQIDNO:l)免疫。hlL-4R的施用是通過直接注射佐劑中的純化抗原，或通過提供DNA質粒中的hlL-4R的DNA序列間接進行，該DNA質粒包含hIL-4R基因，并用宿主細胞的蛋白質表達機器表達hIL-4R以在體內生產抗原多肽。為得到最佳的免疫反應，隨后每3-4周對動物進行增強免疫，每次增強的10天后采血用于評估抗-抗原反應的進程。當小鼠的免疫反應達到最大時，收獲表達抗體的B細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤。通過篩選雜交瘤或轉染細胞的條件培養基在特異性、抗原結合親和力和阻斷hlL-4與hlL-4R結合中的功效來選擇具期望功能的單克隆抗體(說明如下)。顯示期望的抗原結合親和力、功效、和/或阻斷hlL-4與hlL-4R結合的能力的選定抗體包括(HCVR/LCVR):VX4E7-9(SEQIDNO:3/ll;387/389;391/393);VX3F7國6(SEQIDNO:19/27;395/397;399/401);VAB16G1-1(SEQIDNO:35/43;403/405;407/409);VAB16F3-1(SEQIDNO:51/59、411/413、415/417、579/59和581/59);VAB15C8-17(SEQIDNO:67/75、419/421、423/425);VAB13A1-6(SEQIDNO:83/91、427/429、431/433);VAB11G8-1(SEQIDNO:99/107、435/437、439/441);VAB10G8-19(SEQIDNO:115/123、443/445、447/449);VAB10C1-5(SEQIDNO:131/139、451/453、455/457);VAB8G10-1(SEQIDNO:147/155、459/461、463/465);VAB7B9-3(SEQIDNO:163/171、467/469、471/473);VAB6C10-14(SEQIDNO:179/187、475/477、479/481);VAB5C5國11(SEQIDNO:195/203、483/485、487/489);VAB3B4-10(SEQIDNO:211/219、491/493、495/497);VAB4D5-3(SEQIDNO:227/235、499/501、503/505);VAB1H1-2(SEQIDNO:243/251、507/509、511/513);VAK5H4-4(SEQIDNO:259/267、515/517、519/521);VAK7G8-5(SEQIDNO:275/283、523/525、527/529);VAK8G11-13(SEQIDNO:291/299、531/533、535/537);VAK9C6-11(SEQIDNO:307/315、539/541、543/545);VAK10G6-7(SEQIDNO:323/331、547/549、551/553);VAK11D4-1(SEQIDNO:339/347、555/557、559/561);VAK12B11-9(SEQIDNO:355/363、563/565、567/569);和VAK10G12曙5(SEQIDNO:371/379、571/573、575/577)。實施例2.抗原結合親和力測定用實時生物傳感器表面等離振子共振測定法(BIAcoreTM2000)測定選定抗體與hlL-4R的結合親和力(Ko)。簡言之，抗體^皮捕獲在山羊抗小鼠(GAM)IgG多克隆抗體表面上以形成被捕獲的抗體表面，該多克隆抗體表面經由GAMIgG與BIAcoreTM芯片的直接化學偶聯形成。將多種濃度(范圍為12.5nM到0.625nM)的單體hlL畫4R(R&DSystems)或二聚體hlL-4R-hFc注入到被捕獲的抗體表面上。實時監測抗原與抗體的結合和結合的復合體的解離。用BIA評估軟件進行動力學分析以確定平衡解離常數(Kd)和解離速率常數。BIA評估軟件還用于計算抗原/抗體復合體解離的半壽期(U。結果在表I中顯示。對照完全人抗IL-4R抗體(美國專利號7,186，809;SEQIDNO:10和12)。動力學分析的結果顯示選定抗體包括能夠以低于1nM的Ku與二聚體受體結合的高親和力抗體。還測試了抗hlL-4R抗體與小鼠或猴(食蟹猴(A^c"oi/Mdcw/"Ws))IL-4R的結合親和力。選定的抗體(1)不與小鼠1L-4R交叉反應；(2)不與猴IL-4R結合或以非常低的親和力與猴IL-4R結合。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>還使用基于ELISA的溶液竟爭測定法評估抗體-抗原結合親和力。簡言之，抗體(i或3.3ng/ml的純化蛋白質)與抗原蛋白(單體或二聚體)O到10網/ml范圍的系列稀釋液預混合。然后抗體和抗原混合物溶液在室溫孵育2到4小時以達到結合平衡。然后用定量夾心式ELISA測定混合物中的游離抗體。簡言之，MaxisorpTM96孔板(VWR公司，西切斯特市，賓州)用處于PBS中的2i!g/mlhlL-4R-hFc蛋白質包被，4。C過夜，然后用BSA封閉非特異性結合。然后將抗體-抗原混合物溶液轉移至包被的MaxisorbTM板，之后孵育一小時。然后用洗滌液洗滌平板，用HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體試劑(JacksonImmunoResearch)檢測板上結合的抗體，或用HRP-綴合的山羊抗人IgG多克隆抗體試劑(JacksonImmunoResearch)檢測對照抗體，用比色底物如BDOptEIATM(BDBiosciencesPharmingen乂>司，圣地亞哥，力口州)顯影。用1M磷酸或硫酸停止反應之后，記錄450nm的吸光度，用GraphPadTMPrism軟件分析數據。用4參數擬合分析(fourparameterfitanalysis)信號對溶液中抗原濃度的依賴性，并報告為IC50，即在溶液中不存在抗原的情況下，令來自抗體樣品的信號減少50%所需的抗原濃度。依上述測定ICso，在表2中進行總結。在優選實施方案中，本發明的抗體或抗體片段顯示如用ELISA溶液竟爭測定法測量的，二聚體hIL-4R的IC5o為約20pM或更小，單體hIL-4R的IC5。為約150pM或更小，或約100pM或更小。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例3.對hlL-4和hlL-4R相互作用的抑制如下所述，用BIAcoreTMhlL-4阻斷測定法篩選選定抗體阻斷hlL-4與hlL-4R結合的能力，用如下述定量hlL-4阻斷免疫測定法測定效力。結果在表3中進行總結。用表面等離振子共振測定抗體阻斷hlL-4與hlL-4R受體結合的能力。用固定在CM-5上的山羊抗人IgG多克隆抗體捕獲純化的hlL-4R-hFc分子至濃度為260RU，以制備受體包被的表面。然后將人IL-4(0.25m1，50nM)注入到受體包被的表面上，記錄結合的hlL-4的量(笫一次注入hlL-4)。然后用3MMgCl2脈沖及隨后的條件緩沖液除去結合的hlL-4。然后將純化的抗hlL4R抗體注入到受體表面上，隨后以同樣濃度第二次注入hlL-4(第二次注入hlL-4)。表3中報告了由于預形成的抗體和受體復合體而導致的hlL-4的結合降低的百分比。為進一步評價阻斷hlL-4與hlL-4R結合的能力，進行了定量免疫測定。簡言之，25pMhlL-4R-Fc溶液與范圍在50nM到OnM的抗體蛋白系列稀釋液預混合，然后在室溫孵育一小時。用hlL-4R特異性夾心式ELISA測定游離hlL-4R-Fc(未結合抗體)的濃度。通過將生物素化的hIL-4(0.5照/ml)結合在鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板上制備hlL-4R的檢測板。將預結合的抗體-抗原樣品轉移到hlL-4包被的檢測板上。室溫孵育一小時后，洗滌檢測板，用HRP綴合的山羊抗hFc多克隆抗體檢測板上結合的hlL-4R-hFc，用比色底物如BDOptEIATM(BDBiosciencesPharmingen公司，圣地亞哥，加州)顯影。用1M磷酸或硫酸停止反應之后，記錄450nm的吸光度，用GraphPadTMPrism軟件分析數據。IC50測定為令可檢測的IL-4R-hFc與板上結合的hlL-4之間的結合減少50%所需的抗體量。在優選實施方案中，本發明的抗體或抗體片段顯示，如用ELISA測量，阻斷25pMhlL-4R的IC5{)小于約50pM，或小于約40pM，或小于約30pM，或小于約20pM。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例4.體外中和hlL-4的生物效應文獻中廣泛記載了IL-4介導的信號轉導途徑(例如，見Hebenstreit等人，2006CytokineGrowthFactorRev.l7(3):173-88,2006的綜述)。IL-4可以刺激兩種受體復合體，I型和II型。I型受體復合體由IL-4與IL-4R結合和隨后用共有y鏈異二聚化形成。備選地，IL4/IL4R復合體可以與IL-13受體1異二聚化形成II型受體復合體。I型和II型復合體都主要通過STAT6傳導信號。因此，如下文所述評估選定抗體阻斷經STAT6的信號傳導的能力。建立對hlL-4和hIL-13高度敏感的細胞系。HEK293細胞用人STAT6和STAT6螢光素酶報道質粒轉染，在生長培養基(DMEM，10%FBS，L-谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素)中維持。當在STAT6轉染的HEK293細胞的生長培養基中加入10pMhlL-4時，得到強烈的IL-4受體介導的反應。為進行hlL-4反應的生物測定，細胞在測定培養基中洗滌一次(OptimemI(Gibco公司)加0.1%FBS)，以lxl04個細胞/孔(96孔板)于80pl測定培養基中鋪板。在測定培養基中連續稀釋純化的抗體(終濃度范圍為20nM至0),將10pl各試驗抗體與10hIL-4(10pM恒定終濃度)一起加入細胞中。細胞在37。C，5。/oC02孵育6小時。用螢光素酶測定法(PromegaBiotech)測量細胞反應程度。結果在表4中顯示。也用人成紅血細胞細胞系TF1,或修飾的、過表達U-13Ra的TF1細胞系(TF1/A12)確認依賴IL-4的生物活性的體外抑制。在此生物測定法中，在96孔板的各孔中的RPMI1640培養基中接種20,000個細胞，該培養基含10。/。FBS、2mML-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素。加入25pl濃度范圍在0到50nM(終濃度)的純化抗體，同時加入25plhlL-4重組蛋白至終濃度50pM(對于細月包系TF1),或20pM(對于細胞系TF1/A12)。令細胞在37。C生長3天，用CCK8試劑盒(Dojindo，日本)測定最終細胞計數。表4中報告了抗體阻斷TF-1細胞生長的能力，其以減少50%的細胞增殖所需的抗體濃度表示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例5.體外中和hIL-13的生物效應由于已證實IL-4R通過與IL-13/IL-13R復合體的結合調節IL-13的活性，在上述的HEK293STAT6螢光素酶測定法的j，務改方法中測試選定抗體阻斷IL-13活性的能力，所述修改為用40pMhIL-13替換10pMIL-4。并且在上述TF-1細胞系測定法中，用150pM的hIL-13，在0-50nM抗體存在下評估抗體阻斷hIL-13活性的效力。結果于表5中顯示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例6.抗體結合譜圖的評估通過測定抗體(與其抗原結合)對于一組不同抗體隨后與相同抗原結合的能力可以具有的影響，可以建立抗體結合譜圖。例如，抗原可以固定在支持物上以形成抗原包被的表面，可以用抗體飽和抗原包被的表面，而后可以將被抗體飽和的抗原包被的表面暴露于一組其它抗體。該組其它抗體與被抗體飽和的抗原表面結合的程度即提供了抗體結合i普圖。使用基于()CTETTM的相繼結合測定法產生抗體結合譜圖。簡言之，24個鏈霉抗生物素蛋白高結合FA生物傳感器(ForteBio公司，門羅-帕克，加州)的組首先與抗原即2照/ml生物素-hlL-4R-hFc在30。C孵育10min以達到飽和，結合的抗原的量測定為由于結合的蛋白質造成的生物層的厚度(nm)變化，其通過波長移動直接進行測量。結合了生物素-hlL-4R-hFc的生物傳感器而后與50pg/ml的一級抗體(對照抗體)在30。C孵育15min以達到飽和，結合的對照抗體的量測定為生物層厚度(nm)變化。而后各結合了對照抗體的傳感器與50pg/ml的24種不同的抗hlL-4R抗體的組中的其中之一(二級抗體)在30。C孵育15min，結合的二級抗體的量測定為生物層厚度變化。用VAB16F3-1或VAK5H4-4抗hlL-4R抗體作為一級抗體重復同樣的測定法。結果于圖1A-C中顯示。并且用蛋白質印跡評估選定的抗hlL-4R抗體(數據未顯示)。簡言之，hlL-4R單體(每泳道200ng)和mflL-4RHis-標記的單體(每泳道200ng)用還原和非還原樣品緩沖液在SDS-PAGE凝膠上進行電泳。將4塊單獨的凝膠分別轉移到PVDF膜上，每張膜各自暴露于四種一級抗體之一抗HismAb(Qiagen公司)、VAB16F3-1、VAK5H4-4或抗hlL畫4R對照抗體，用HRP綴合的山羊抗mlgG或抗hlgG(Pierce公司)作為二級抗體。全部三種抗hlL-4R抗體均識別非還原形式的hlL-4R。只有VAB16F3-1和VAK5H4-4檢測到還原形式的hlL-4R。沒有一種抗hlL-4R抗體檢測到猴IL-4R。權利要求1.特異性結合hIL-4R(SEQIDNO1)的抗體或其抗原結合片段，用表面等離振子共振測量KD為約200pM或更小，優選約150pM或更小。2.權利要求l所述的抗體或抗原結合片段，包含重鏈可變區(HCVR)，其選自SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、391、395、399、403、407、411、415、419、423、427、431、435、439、443、447、451、455、459、463、467、471、475、479、483、487、491、495、499、503、507、511、515、519、523、527、531、535、539、543、547、551、555、559、563、567、571、575、579和581;和輕鏈可變區(LCVR)，其選自SEGIDNO:ll、27、43、59、75、91、107、123、130、155、m、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、389、393、397、401、405、409、413、417、421、425、429、433、437、441、445、449、453、457、461、465、469、473、477、481、485、489、493、497、501、505、509、513、517、521、625、529、533、537、541、545、,549、553、557、561、565、569、573和577。3.權利要求1或2所述的抗體或抗原結合片段，其包含HCVR/LCVR對，所述HCVR/LCVR對選自SEQIDNO:3/11、19/27、35/43、51/59、67/75、83/91、99/107、115/123、131/139、147/155、163/171、179/187、195/203、211/219、227/235、243/251、259/267、275/283、291/299、307/315、323/331、339/347、355/363、371/379、387/389、391/393、395/397、399/401、403/405、407/409、411/413、415/417、419/421、423/425、427/429、431/433、435/437、439/441、443/445、447/449、451/453、455/457、459/461、463/465、467/469、471/473、475/477、479/481、483/485、487/489、491/493、495/497、499/501、503/505、507/509、511/513、515/517、519/521、523/525、527/529、531/533、535/537、539/541、543/545、547/549、551/553、555/557、559/561、563/565、567/569、571/573、575/577、579/59和581/59。4.權利要求3所述的抗體或抗原結合片段，其優選包含選自SEQIDNO:5固、259/267、275/283、291/299、579/59或581/59的HCVR/LCVR。5.權利要求l所述的抗體或抗原結合片段，包含重鏈CDR1，其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQIDNO:582)的氨基,列，其中X'-Gly，x2-Tyr或Phe，X3=Thrill,X4=Phe，x5二Asn或Arg,X6=Ser，X7=Tyr,X8=Gly;重鏈CDR2，其包含式X1-X2—X3—X4—X5—X6—X7—X8(SEQIDNO:583)的氨基,列，其中^-Ile，X2=Ser或Arg，x3二Thr或Tyr，X4=Tyr或Asp,X5=Asn或Gly，X6=Gly或Ser，X7=Lys或Asn,X8=Thr;重鏈CDR3，其包含式X1—X2—X3—X4—X5—X6—X7—X8—X9-X10—x"一XU_XU—x"—X5_x"一X17——X,9一X2C一x"(seQIDNO:584)的氨基酸序列，其中X1=Ala或Val，X2=Arg_^Lys,X3=Asp或Glu,x4^Gly或Glu，X5=Ala或Arg,X6=Arg或Ser，X7=lie或Gly,x8-Val或Ser，x9-Val或Trp，X10=Ala或Phe，X"-Gly或Asp,X12=Thri^Pro，X'3:Thr或缺失，X14=Pro或缺失，X15=Tyr或缺失，X"-Tyr或缺失，X"^^Tyr或缺失，X"-Gly或缺失，X19=Met或缺失，X2Q-Asp或缺失，X"-Val或缺失；輕鏈CDR1，其包含式X1—X2—X3-X4—X5-X6(SEQIDNO:585)的氨基酸序列，其中X!:Gln，X2=AspilAla，X3=Ile，x4-Ser或Asn，X、Asn或Ile，X6=Trp或Phe;輕鏈CDR2，其包含式X1-X2—X3(SEQIDNO:586)的氨基酸序列，其中X1=AlailVal，x2:Ala或Thr，X3=Ser;和輕鏈CDR3，其包含式X1—X2-X3—X4—X5—X6—X7—X8—X9(SEQII)NO:587)的氨基紗列，其中X1=Gin,X2=Gln，X3=Ala或Tyr，X4=Asn，X5=Ser，X6=Phe或His,X7=Pro,X8=lie或Trp，X9=Thr。6.權利要求1所述的抗體或抗原結合片段，其包含重鏈CDR3和輕鏈CDR3,其中重鏈CDR3結構域選自SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361和377;輕鏈CDR3結構域選自SEQIDNO:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369和385。7.權利要求6所述的抗體或抗原結合片段，還包含重鏈CDR1結構域，其選自SEQIDNO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357和373;重鏈CDR2結構域，其選自SEQIDNO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359和375;輕鏈CDR1結構域，其選自SEQIDNO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365和381;和輕鏈CDR2結構域，其選自SEQIDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367和383。8.權利要求1所述的抗體或抗原結合片段，其包含來自HCVR和LCVR序列的CDR，其中所述HCVR/LCVR序列選自51/59、579/59、581/59、259/267、275/283和291/299。9.分離的核酸分子，其編碼前述權利要求任一項所述的抗體或抗原結合片段。10.包含權利要求9所述的核酸序列的載體。11.用于產生特異性結合IL-4受體的抗體或抗體的抗原結合片段的宿主-載體系統，其在適當宿主細胞中包含權利要求10所述的載體。12.權利要求11所述的宿主-載體系統，其中所述宿主細胞為選自大腸桿菌或CHO細力包之一的原核或真核細胞。13.產生抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的方法，包括在允許產生所述抗體或其片段的條件下培養權利要求11或12所述的宿主-載體系統的細胞，并回收表達的抗體或片段。14.權利要求1至9任一項所述的抗體或抗體的抗原結合片段在生產藥物中的用途，所述藥物用于減輕或抑制人類中IL-4介導的疾病或病癥。15.治療疾病或病癥的方法，其中通過施用;f又利要求1至9任一項所述的抗體或抗原結合片段，通過消除、抑制或降低人白細胞介素-4(hlL-4)活性使所述疾病或病癥得到好轉、改善或抑制。16.4又利要求15所述的方法，其中所述疾病或病癥選自關節炎、皰滲樣病(herpetiformis)、慢性特發性蕁麻滲、硬皮病、肥大性瘢痕、惠普爾病、良性前列腺增生、肺病癥、炎性病癥、變態反應、川崎氏病、鐮狀細胞病、丘-斯綜合征、格雷夫斯氏病、先兆子癇、干燥綜合征、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征、自身免疫性溶血性貧血、巴雷特食管、自身免疫性葡萄膜炎、肺結核和腎病。全文摘要本發明提供與人白細胞介素4受體α(hIL-4Rα)結合的分離的人抗體或其抗體片段，用表面等離振子共振測量的親和常數(K_D)小于200pM。文檔編號C07K16/28GK101522716SQ200780036872公開日2009年9月2日申請日期2007年10月2日優先權日2006年10月2日發明者A·拉菲克,D·M·阿倫茨,E·希,J·A·溫莎,J·H·馬丁,J·L·費爾赫斯特,K·J·波博斯基,M·托里斯,N·J·帕帕多普洛斯,R·W·萊伊迪遲,S·史蒂文斯,T·T·黃,W·R·米庫爾卡申請人:瑞澤恩制藥公司