專利名稱：一種高分子量靈芝多糖及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及藥用真菌領域，具體地說涉及一種高分子量靈芝多糖及其檢測方法。
背景技術：
靈芝多糖是藥用真菌靈芝中的主要藥效成分之一，具有免疫調節和抗腫瘤、抗衰老、抗高血壓等多種生物活性。靈芝中含有一種高分子量的靈芝多糖成份，分子量為IOOOkDa以上，該多糖可選擇性地刺激B細胞和巨噬細胞，顯著增強免疫球蛋白的產生，并
增強巨噬細胞的吞噬功能和刺激巨噬細胞產生細胞因子IL-I P和TNF-a的生成。這種多糖雖然在實驗室可以通過復雜的分離純化手段獲得，但大規模的制備方法卻沒有報道。同時靈芝多糖的含量測定基本運用苯酚硫酸法，可以測定出總多糖的含量，并不能反映出其中活性多糖的含量，因此建立準確測定靈芝中具有生物活性的多糖對于靈芝質量評價的十分重要。
發明內容
本發明首先提供了一種高分子量靈芝多糖，該高分子量靈芝多糖是通過如下步驟制備得到的①水提醇沉；②純化；③冷凍干燥；其中純化包括超濾和陰離子樹脂純化；其中超濾為將水提醇沉后的沉淀加水溶解后，用50萬的超濾膜進行超濾，得到分子量大于50萬的靈芝多糖；其中陰離子樹脂純化為將分子量大于50萬的靈芝多糖水溶液加入DEAE-Sepharose陰離子樹脂,去除水洗脫部分，收集0_0. 5NaCL洗脫部分,用I萬的超濾膜超濾脫鹽。其中水提醇沉為將靈芝子實體中加水，在80-120°C下熱提，水提液濃縮后再加乙醇沉淀；其中冷凍干燥為將純化后的靈芝多糖先放置于-20°C冷凍2-4小時，然后置于-80°C冷凍5-7小時，之后轉到冷凍干燥機中進行冷凍干燥處理，最后得到靈芝高分子量多糖(GLIS)。本發明還提供了一種制備上述高分子靈芝多糖的方法，該方法包括如下步驟①水提醇沉；②純化；③冷凍干燥；其中純化包括50萬超濾膜的超濾和DEAE-S印harose陰離子樹脂柱的分離純化。本發明還提供了一種檢測上述高分子量多糖的方法，能夠測定靈芝中活性多糖的含量，用于靈芝質量的評價，該方法包括如下步驟①標準品的制備權利要求I所述的高分子量靈芝多糖用水溶解，然后上Sephacryl 500凝膠層析柱,收集第一個峰,濃縮干燥得到；②將待測樣品進行HPLC測定；其中HPLC 的檢測條件為，TSKgel G6000PWXL (13) 7. 8*300 ;流動相0. 05mol/L 的NaH2PO4和0. 15mol/L的NaNO3水溶液；流速0. 5mL/min ;柱溫35°C ;示差檢測器。本發明使用的靈芝子實體為市售產品。本發明使用的超濾膜為高分子聚合卷式超濾膜，濾芯材質為聚砜PS、聚醚砜PES、聚偏氟乙烯PVDF，具體是購自上海弗立特實業有限公司的UF-3530超濾膜。 本發明使用的DEAE-Sepharose陰離子樹脂購自GE公司。本發明提供的高分子量靈芝多糖，制備方法簡便、適用于大規模生產，且多糖含量達到65%以上，并且該靈芝多糖的免疫活性顯著提高，可刺激巨噬細胞生成一氧化氮(NO)。制備的標準品多糖含量大于90%，本發明運用高效液相法建立了高分子量靈芝多糖的含量測定方法，該檢測方法準確，重現性好，為靈芝中活性多糖的含量提供了一種新的檢測方法。
圖I高分子量靈芝多糖標準品的HPLC圖譜。圖2實施例I制備得到的高分子量靈芝多糖的HPLC圖譜。
具體實施例方式實施例I高分子量靈芝多糖的制備I.水提醇沉靈芝子實體5Kg加入10倍的水50L100。C加熱I小時，過濾，殘渣加入10倍水再100° C加熱I小時，過濾，合并濾液160L，旋轉蒸發儀濃縮至5L，加無水乙醇5L至50%的濃度，靜置過夜，沉淀離心后去除上清。2.靈芝多糖的純化沉淀加水溶解后，上截留值為50萬的超濾膜進行超濾，獲得大于50萬的高分子量的靈芝多糖36g。3.進一步純化和濃縮大于50萬的靈芝多糖0. 5g加入裝填50_X300_的裝有的DEAE-Sepharose陰離子樹脂柱(GE公司)中進行進一步分離純化，收集0-0. 5NaCl洗脫部分，并進行超濾濃縮脫鹽。4.冷凍干燥將超濾濃縮后多糖先放置于_20°C冷凍3小時，然后置于-80攝氏度冷凍6小時，之后轉到冷凍干燥機中進行冷凍干燥處理，最后得到高分子量靈芝多糖0. 253g。實施例2生物活性檢測，所用的高分子量靈芝多糖為實施例I中制備得到的。I小鼠H22移植瘤模型的建立生長良好的H22腹水瘤小鼠(購自南京中醫藥大學)，無菌條件下抽取腹水，并用生理鹽水稀釋調整瘤細胞數為3 XlOVml的細胞懸液，用75%乙醇消毒實驗BALB/c小鼠(購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)右腋下皮膚，每只小鼠右腋皮下注射0.2ml H22腹水瘤細胞懸液(含瘤細胞6 X IO6)。2分組和給藥30只BALB/c小鼠接種24小時后，隨機分成3組給藥模型組給予等量生理鹽水、5-FU組20mg/kg、高分子量靈芝多糖25mg/kg+5-FU20mg/kg,每組10只。5-FU及靈芝高分子量多糖25mg/kg劑量均每日一次。各組均腹腔注射給藥，持續8天。3指標測定給藥期間，測定小鼠體重和攝食量，末次給藥后24小時分離瘤塊，稱重，計算腫瘤生長抑制率，腫瘤抑制率(％ ) = (I-藥物組平均瘤重/模型平均瘤重)X 100%。4統計方法所有實驗數據均以I ±SD表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行統計分析，P
<0. 05認為有統計學差異。5實驗結果如表I所示，與模型組相比,5-FU組、5-FU+高分子量靈芝多糖組的腫瘤重量均極顯著減輕(P<0.01)。與5-FU組相比，5-FU+高分子量靈芝多糖組的腫瘤重量顯著減輕(P
<0. 05)。5-FU與高分子量靈芝多糖合用，腫瘤抑制率明顯高于單用5-FU時，對化療藥物5-FU有明顯的增效作用。表I高分子量靈芝多糖組對H22移植瘤小鼠瘤重的影響
權利要求
1.一種高分子量靈芝多糖，其特征在于該高分子量靈芝多糖是通過如下步驟制備得到的 ①水提醇沉； ②純化； ③冷凍干燥； 其中純化包括超濾和陰離子樹脂純化； 其中超濾為將水提醇沉后的沉淀加水溶解后，用50萬的超濾膜進行超濾，得到分子量大于50萬的靈芝多糖； 其中陰離子樹脂純化為將分子量大于50萬的靈芝多糖水溶液加入DEAE-Sepharose陰離子樹脂，去除水洗脫部分，收集0-0. 5NaCL洗脫部分，I萬的超濾膜超濾脫鹽。
2.本發明還提供了一種檢測權利要求I所述高分子量多糖的方法，其特征在于該方法包括如下步驟 ①標準品的制備權利要求I所述的高分子量靈芝多糖用水溶解，然后上Sephacryl500凝膠層析柱，收集第一個峰，濃縮干燥得到； ②將待測樣品進行HPLC測定； 其中 HPLC 的檢測條件為，TSKgel G6000PWXL (13) 7. 8*300 ;流動相0. 05mol/L 的NaH2PO4和0. 15mol/L的NaNO3水溶液；流速0. 5mL/min ;柱溫35°C ;示差檢測器。
全文摘要
本發明提供了一種高分子量靈芝多糖及其檢測方法，該高分子量靈芝多糖是通過水提醇沉、純化、冷凍干燥得到的。本發明的高分子量靈芝多糖，制備方法簡便、適用于大規模生產，且多糖含量達到65%以上，可刺激巨噬細胞生成一氧化氮(NO)。
文檔編號A61P35/00GK102718880SQ20121020970
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月23日 優先權日2012年6月23日
發明者劉艷芳, 周帥, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 張圣龍, 楊焱, 王晨光 申請人:上海市農業科學院, 上海百信生物科技有限公司