專利名稱：一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，尤其是提供了一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制備方法與應用，屬于基因工程疫苗技術領域。
背景技術：
狂犬病是病死率幾乎100%的人獸共患傳染病。我國是狂犬病的高發地區，人狂犬病主要因被攜帶狂犬病病毒的犬或貓咬傷或抓傷(暴露)導致。我國流行的狂犬病毒株較多，雖然均屬于基因I型，相互間存在交叉保護，但目前狂犬病疫苗所使用毒株均為外國毒株(PV、PM、SAD)及中國早期流行株(CTN、aG)，數十年的進化已經使糖蛋白基因出現了明顯的差異。研究表明，不同狂犬病毒株的糖蛋白，其免疫原性存在差別。而此種差別主要由糖蛋白優勢抗原表位基因決定，糖蛋白的表達產量則受表達系統的基因密碼子偏好性所影響。通過表位優化及密碼子優化獲得的糖蛋白基因，可以表達獲得高免疫原性和高表達量的糖 蛋白，用于動物狂犬病的免疫預防，將對現有流行株產生完全且持久的免疫保護。
發明內容
本發明提供一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，對我國當前流行的狂犬病均具有良好的免疫原性，避免了以往狂犬病疫苗株和當前流行株因不同時具備全部優勢抗原表位而導致的免疫原性偏低的現象。本發明還公開了一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制備方法，適應于工業化生產。本發明提供的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，其特征在于
其氣基酸序列如SEQ No. I所不，其DNA序列如SEQ No. 2所不；
本發明所述的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制備方法，包括以下步驟
1)高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的人工合成
將SEQ No. I所示的基因分為l_730bp的A片段和710_1575bp的B片段兩部分，分別進行人工合成，合成后的基因片段克隆入PUC18質粒載體的BamHI位點；新質粒命名為PUC18-A 和 pUC18-B ；
2)高免疫原性狂犬病毒糖蛋白腺病毒表達載體的構建
酶切pUC18-A和pUC18-B質粒，獲得目的基因的A、B 二片段，同時連接入腺病毒穿梭質粒pacAd5 CMV內，所得質粒命名為pacAd5 CMV-optG ；
3)表達高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒的獲得
重組質粒pacAd5 CMV-optG與輔助質粒pacAd5 9. 2-100共轉染293AD細胞，待細胞出現明顯病變后凍融收取，即獲得攜帶并表達高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的重組腺病毒，重組腺病毒命名為rAD5-optG。高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的應用
I、病毒達到IO8TCID5tl以上的重組病毒rAD5-optG免疫犬或貓，每劑1ml，肌肉注射。2、肌肉注射后21天，采血分離血清，以熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢測血清狂犬病中和抗體，均達到0. 5IU/ml以上。
本發明基于狂犬病毒糖蛋白的優勢抗原表位分析和密碼子優化理論，經人工合成具備全部優勢抗原表位且經密碼子優化的狂犬病毒糖蛋白基因，以重組腺病毒、重組桿狀病毒或重組慢病毒為表達系統，制備基于哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系或家蠶系統的基因工程疫苗，直接或純化后用于動物狂犬病的預防。此類疫苗可以代替目前常規使用的狂犬病弱毒活疫苗或滅活疫苗，在提高免疫原性，避免狂犬病毒變異導致的疫苗失效的同時，可以大大降低疫苗生產過程中大量培養狂犬病毒導致的生物安全風險。本發明的積極效果在于高免疫原性狂犬病毒糖蛋白可對當前我國流行的所有狂犬病流行株提供完全的免疫保護，同時通過密碼子的優化實現蛋白表達量的大幅度提高，降低了動物狂犬病疫苗的生產成本。
圖I為pUC18質粒不意圖；
圖2為腺病毒重組穿梭質粒pacAd5 CMV示意 圖3為腺病毒重組輔助質粒pacAd5 9. 2-100示意 圖4為質粒pUC18-A示意 圖5為質粒PUC18-B示意 圖6質粒pacAd5 CMV-optG不意圖。
具體實施例方式實施例I
高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的人工合成
將SEQ No. I所示的基因分為l_730bp的A片段和710_1575bp的B片段兩部分，委托TaKaRa (大連)公司分別進行人工合成，合成后的A、B 二基因片段均克隆入pUC18質粒載體的BamHI位點，轉化大腸桿菌JM109感受態，篩選獲得正向連接的重組質粒，即片段上游靠近HindIII位點而下游靠近EcoRI位點，序列第721bp位置的SphI位點可用作下一步基因克隆。新質粒命名為PUC18-A (圖4)和pUC18-B (圖5)，質粒內A、B序列片段經過序列測定，與SEQ Nol.所示的DNA序列完全一致。實施例2
高免疫原性狂犬病毒糖蛋白重組腺病毒的構建
以限制性內切酶HindIII和SphI雙酶切質粒PUC18-A，回收730bp的A片段，以SphI和EcoRI雙酶切pUC18-B，回收870bp的B片段。再以Hindi 11和EcoRI雙酶切腺病毒穿梭質粒pacAd5 CMV，回收6. 2kb的載體片段。載體片段與A、B 二基因片段在T4 DNA連接酶作用下連接，轉化大腸桿菌JM109感受態，篩選獲得正確連接的重組質粒pacAd5 CMV-optG(圖6)。質粒 pacAd5 CMV-optG 與 pacAd5 9. 2-100 各 100 u g,與脂質體(Invitrogen Iipofectamine2000)混合后轉染293AD單層細胞。繼續培養5d，至出現明顯的細胞變圓、聚集成葡萄串樣，收獲細胞培養物。細胞培養物經PCR鑒定，表明攜帶高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因；PAGE電泳后進行Western印跡,結果顯示,狂犬病糖蛋白得到高效表達。實施例3
表達高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒的制備實施例2獲得的重組腺病毒rAD5-optG種毒按5%體積接種293AD單層細胞，37 °C，5%C02條件下培養4 一 6天，待細胞明顯變圓、聚集成葡萄串樣時凍融收獲培養物。收獲后病毒可以再按此方法擴大接種，大量制備重組腺病毒rAD5-optG。取各批次制備的重組病毒，按I、10 、102、103、IO4......IO11進行梯度稀釋，接種96孔
板內的293AD單層細胞，每個梯度接種8個重復孔，每孔培養基量為100 ill。接種后37°C，5%C02條件下培養7天，觀察并記錄各孔內是否出現細胞病變。根據Kaber法計算重組的滴度。結果表明，各批次重組病毒的產毒滴度均超過108_5TCID5qij試驗例
表達高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒rAD5-optG對犬的免疫取實施例3制備的重組腺病毒rAD5-optG，將病毒滴度稀釋為IO8TCID5tl，肌肉注射免疫3月齡比格犬10只(試驗組)。同時設不免疫犬6只作為對照。正常飼養21天后，全部16只犬抽血分離血清，以熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)法測定血清狂犬病中和抗體水平。結果顯示，試驗組10只犬的血清抗體均超過0. 5IU/ml保護水平，平均水平為3. 42IU/ml。以10萬LD5tl狂犬病強毒BD06株咬肌注射上述16只犬，攻毒后正常飼養觀察，記錄各組犬發病和死亡情況。死亡犬取腦組織進行免疫熒光染色(DFA)確認是否死于狂犬病。結果顯示，觀察至攻毒后28天，試驗組全部10只犬均未發病；而對照組6只犬于攻毒后第9天至22天先后發病，出現明顯的、沉郁和肌肉麻痹等精神癥狀。死后腦組織DFA檢測顯示各犬腦組織內均出現狂犬病病毒。上述結果表明，重組腺病毒rAD5-optG注射犬后，可產生足夠強的抗狂犬病免疫保護。
權利要求
1.一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ No. I所示，其DNA序列如SEQ No. 2所示。
2.根據權利要求I所述的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制備方法，包括以下步驟 1)高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的人工合成 將SEQ No. I所示的基因分為l-730bp的A片段和710-1575bp的B片段兩部分，分別進行人工合成，合成后的基因片段克隆入PUC18質粒載體的BamHI位點，新質粒命名為PUC18-A 和 pUC18-B ； 2)高免疫原性狂犬病毒糖蛋白腺病毒表達載體的構建 酶切pUC18-A和pUC18-B質粒，獲得目的基因的A、B 二片段，同時連接入腺病毒穿梭質粒pacAd5 CMV內，所得質粒命名為pacAd5 CMV-optG ； 3)表達高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒的獲得 重組質粒pacAd5 CMV-optG與輔助質粒pacAd5 9. 2-100共轉染293AD細胞，待細胞出現明顯病變后凍融收取，即獲得攜帶并表達高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的重組腺病毒，重組腺病毒命名為rAD5-optG。
3.根據權利要求I所述的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白在制備動物狂犬病免疫預防藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制備方法與應用，以人工合成方式獲得包含全部優勢中和抗原表位并經密碼子優化的狂犬病毒糖蛋白基因，再以重組腺病毒、重組桿狀病毒或慢病毒為表達載體，在哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系或家蠶表達系統內高效表達，獲得對目前國內流行狂犬病毒株具有高免疫原性的狂犬病毒糖蛋白，用于動物狂犬病的免疫預防。
文檔編號A61K39/205GK102964433SQ201210220610
公開日2013年3月13日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者張守峰, 扈榮良, 劉曄, 王穎, 陳奇, 張菲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所