專利名稱：懷牛膝水提物在制備雌激素類藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥新用途，特別是一種懷牛膝水提物在制備雌激素類藥物中的應用。
背景技術：
懷牛膝為覓科植物牛膝Achyranthes bibentata BI.的干燥根。牛膝，在四州、湖北、陜西等省均有生產，但懷牛膝質量最佳，數量也居全國之首，懷牛膝因產于歷史上的懷慶府而得名，位于今河南焦作一帶。懷牛膝的特點是條子粗壯、明亮、色澤鮮艷、油性多。歷代名家對其均有論述和研究，認為其性平，味苦、甘、酸。歸肝、腎經，具有補肝腎，強筋骨，利尿通淋，引血下行的功能。用于經閉，痛經，腰膝酸痛，筋骨無力，淋證，水腫，頭痛，眩暈，牙痛，口瘡，吐血，衄血等癥。現代藥理及臨床研究表明懷牛膝具有降壓，改善肝功能，增強體液免疫，抗炎與鎮痛，利尿，解痙，抗衰老等作用。婦女進入絕經期后，體內雌激素水平下 降，進而引起一系列癥狀，如骨質疏松癥，老年癡呆癥，心腦血管疾病等，其中骨質疏松癥和心腦血管疾病導致的死亡率呈逐年上升趨勢。懷牛膝的抗衰老作用，自《神農本草經》即有記載，諸多延年益壽方中應用比例極高。現代的研究報道亦較多，如懷牛膝對家蠶壽命及生長發育影響實驗表明懷牛膝可延長家蠶齡期，減輕家蠶體重，并有減緩家蠶身長增長的作用；懷牛膝還可明顯改善戊巴比妥鈉所致小鼠記憶障礙，明顯延長小鼠負荷游泳時間，從而增強記憶和提高耐力。以O. 4g/kg的懷牛膝粉拌食喂養Wistar雌性9月齡大鼠至19月齡，可明顯提高大鼠全血SOD活性，降低LPO的形成。但關于懷牛膝具有雌激素樣作用方面的研究尚未見報道。
發明內容
針對上述情況，本發明的目的就是提供一種懷牛膝水提物在制備雌激素類藥物中的應用，可有效解決由于體內雌性激素分泌異常而引起的疾病(如婦女更年期綜合癥等)用藥問題。本發明解決的技術方案是，將懷牛膝每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到懷牛膝浸膏狀水提物，該懷牛膝水提物可有效用于制備和預防由于體內雌激素分泌異常引起的相關疾病的藥物，實現懷牛膝水提物在制備治療由于體內雌性激素分泌異常而引起的相關疾病(如婦女更年期綜合癥等)藥物中的應用。本發明水提物制備方法簡單，穩定可靠，并經多次試驗，均取得了相同或相近似的結果，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌激素類藥物，開辟了懷牛膝藥用新用途，臨床意義巨大。
圖I為本發明的懷牛膝水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數的影響作用圖。圖2為本發明的懷牛膝水提物對MCF-7細胞增殖的影響作用圖。
圖3為本發明的懷牛膝水提物對ERE調控的報告基因載體ERa瞬時表達的誘導作用圖。圖4為本發明的懷牛膝水提物對ERE調控的報告基因載體ERi3瞬時表達的誘導作用圖。
具體實施例方式以下結合實施例和有關試驗資料對本發明的具體實施方式
作詳細說明。
實施例I本發明在具體實施中，所述的懷牛膝水提物是，將懷牛膝(Achyranthesbibentata BI.) IOOg用其10倍重量的水IOOOg (即IOOOmL)煎煮2次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到懷牛膝浸膏狀水提物，連續反復三次，平均得率為68. 76%，該水提物可制備雌激素類藥物，用于治療由于體內雌性激素分泌異常而引起的相關疾病，如婦女更年期綜合癥等。實施例2本發明在具體實施中，所述的懷牛膝水提物是，將懷牛膝(Achyranthesbibentata BI.) 200g用其10倍重量的水2000g (即2000mL)煎煮2次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到懷牛膝浸膏狀水提物，連續反復三次，平均得率為68. 58%，該水提物可制備雌激素類藥物。實施例3本發明在具體實施中，所述的懷牛膝水提物是，將懷牛膝(Achyranthesbibentata BI.) 300g用其10倍重量的水3000g (即3000mL)煎煮2次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到懷牛膝浸膏狀水提物，連續反復三次，平均得率為68. 29%，該水提物可制備雌激素類藥物。根據上述方法按懷牛膝和水的比例可以通過工業化生產制得任意量的懷牛膝水提物，用于制備雌激素類藥物，有效解決由于體內雌性激素分泌異常而引起的疾病(如婦女更年期綜合癥等)的用藥治療問題，并經試驗得到了充分證明，有關試驗資料如下首先，通過小鼠子宮增重實驗，證明懷牛膝能夠增加性未成熟雌性小鼠的子宮系數，說明其在體內具有雌激素樣作用。其次，通過MCF-7細胞增殖實驗(E-SCREEN)，發現懷牛膝能夠促進MCF-7細胞增殖，說明其在體外具有雌激素樣作用。最后，通過ERE調控的報告基因瞬時表達檢測技術，進一步驗證懷牛膝水提物是通過與雌激素受體ER β結合而發揮雌激素樣作用。發明人已通過實驗證明了本發明藥物在制備雌激素類藥物中的新用途。其主要實施方案如下一、實驗材料與方法I.實驗藥物采用本發明懷牛膝水提物。2.實驗動物與細胞株及質粒昆明種小鼠，雌性，出生21d (剛斷乳)，體重9 12g，購于河南省實驗動物中心。人乳腺癌細胞(MCF-7)由中國軍事醫學科學院生物工程研究所提供。HEK293細胞株購于中國典型培養物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)對照質粒P β gal-Control、重組報告基因 pERE-TAL-luc、重組人 ER a (humanER α，hER α )表達載體pCXN2-hER α和重組人ER β (humanER β，hER β )表達載體pCXN2_hER β由軍事醫學科學院生物工程研究所葉棋濃博士惠贈。3.主要試劑RPMI1640 培養基、小牛血清(Newborn Calf Serum, NCS)和脂質體Lipofectamine 2000Reagent 購自 Gibco Invitrogen 公司；胎牛血清、無酌·紅 RPMI1640 培養基、17 β -雌二醇(17 β -estrogen, E2)、氨節青霉素(Amp)、Tris 堿和活性炭(Charcoal)均購自Sigma公司；葡聚糖T-70 (Dextran-70)購自上海化學試劑公司；己烯雌酹片(合肥久聯制藥)；鄰-硝基苯-β -D-半乳卩比喃糖苷(O-Nitrophenyl-β -D-galactopyranoside, 0NPG)、EDTA, MTT 及 DMSO 為 Amresco 公司產品；17-β 雌二醇(E2)為 Sigma
公司產品；Steady-GloB穩定突光素酶檢測系統試劑盒(Steady-Glo^ Luciferase Assay Systerm)、閃亮裂解緩沖液(Glo lysis Buffer)購自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉購自OXOID 公司；感受:態大腸桿菌 DH5 α (E. coli Competent Cells DH5 α )購自 Solarbio 公司；西班牙瓊脂糖為Biowest生產；質粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit I )購自OMEGA公司；其余試劑均為國產分析純。4.所用主要儀器普通手術器械；二氧化碳培養箱(REVCO);倒置顯微鏡(NIKON ECLIPSE TS100)；KDC-160HR高速低溫冷凍離心機(科大創新股份有限公司)；酶標儀(BI0-RAD680);純水儀(Sartorius 611VF) ;90_3磁力攪拌器(上海振捷實驗設備有限公司);ZRD_7080全自動新型鼓風干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(Nichipet EX PLUS) ；AB204-N電子讀數分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品);10cm培養皿、96孔培養板、凍存管均為Corning公司生產；超凈工作臺(江蘇蘇凈集團);UV_7504PC型紫外-可見分光光度計(福州健洋科技儀器有限公司)；Veritas 微板光度計(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；電泳儀，電泳槽(北京市六一儀器廠)；HZS-H型水浴振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；SHP-150型生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)。5.實驗方法5. I小鼠子宮增重實驗將小鼠按體重均衡和隨機的原則分組。給藥持續7d。空白對照組每日蒸餾水O. 2mL · log-1灌胃；陽性對照組每日己烯雌酚懸濁液(O. 35mg · kg-1 · cf1)灌胃；懷牛膝水提物按臨床用藥的20倍量X提取率計算，配成相應濃度的混懸液，每日按O. 2mL · lOg—1灌胃。最后一次給藥24h后，脫頸處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計算子宮系數(子宮濕重X(體重^XIOO。/。)。實驗平行重復三次。結果與空白組相比，計算P值考察有無統計學意義。5. 2MCF-7細胞增殖實驗MCF-7細胞經無酚紅含10%去激素血清的RPMI1640培養基培養2周后，選取對數生長期細胞，PBS洗兩次，用O. 25%胰蛋白酶消化后，加入無酚紅含2%去激素血清的RPMI1640培養基吹打均勻，以2X IO3個/孔的濃度接種于96孔板內，每孔培養總體積為200 μ L0培養24h待細胞貼壁后，換為含藥培養液繼續培養。37°C、5%C02培養72h后，每孔加入MTT溶液(5mg ι Γ1) 20 μ L，37°C繼續培養4h，小心吸凈培養液，每孔加入150 μ L DMSO,震蕩100s，使結晶物完全溶解。以DMSO調零，用酶標儀在570nm下測定各孔吸光度值(A)，計算平均A值和增殖率(Proliferation Rate, RP)。實驗平行重復三次。RP=(實驗組A值/空白組A值一I) X 100%5. 3ERE調控的報告基因瞬時表達檢測5. 3. I細胞接種于轉染前48h將處于對數生長期的HEK293細胞接種于24孔板，密度為16. OXlO4個/孔，且培養液為無抗生素、含10%CDT-FBS的無酚紅1640培養液，分別設置空白對照孔、雌二醇孔及待測藥物孔。5. 3. 2質粒的轉染 (1)36 48h后開始轉染，小心吸出原培養基，加入400μ L含10%去雌激素血清、無慶大霉素和酚紅的新鮮RPMI1640培養基。(2)取 3 只 EP 管，ERa 管中加 500 μ L 無酚紅 RPMI1640 培養基、8 μ LpCXN2_hERa質粒、8 μ LpERE-TAL-luc 質粒、8 μ Lp β gal-Control 質粒；ER^ 管中加 500 μ L 無酹紅RPMI1640 培養基、8 μ LpCXN2-hER β 質粒、8 μ L pERE-TAL-Iuc 質粒、8 μ I β gal-Control 質粒；脂質體管中加入1000 μ L無酚紅RPMI1640培養基和24 μ L脂質體。(3)倒轉混勻脂質體管，室溫放置5min，取500 μ L分別加入ER α和ER β管，室溫放置20min ；(4)倒轉混勻ER α和ER β管，取80 μ LER α管中脂質體/DNA復合物分別加入24孔板ERa實驗孔，取80 μ LERii管中脂質體/DNA復合物分別加入24孔板ER β實驗孔。前后搖勻，放入培養箱。(5)6h后加入對照藥物和檢測藥物。5. 3. 3ERE調控的報告基因瞬時表達檢測加藥后24h的細胞，吸去培養液，用ImL PBS洗一次，并棄去PBS。按照Steady-GloR穩定突光素酶檢測系統試劑盒(Steady-GloaLuciferaseAssay Systerm)及閃亮裂解緩沖液(Glo lysis Buffer)改良操作步驟操作，收集細胞裂解上清液，加入熒光素酶反應底物(熒光素)，置于暗處，用VeritasTM微板光度計檢測熒光強度。5. 3. 4 β -gal 活性檢測為了考察轉染效率，對內參照β -gal活性進行了檢測。(I) 54μ LP -巰基乙醇加入40mL Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800 μ L ;
(2)每管加20 μ L裂解上清液；(3 )每管加400 μ L ONPG,倒轉混勻；(4)放置37°C溫箱，至顯黃色；(5)加 Na2CO3 ImL 終止反應；(6)測 OD42。值；(7 )計算標準化熒光素酶活性。二、統計處理實驗數據以i±s表示，SPSS17. O進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)統計處理。
三、實驗結果I.懷牛膝水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數的影響結果顯示，懷牛膝水提物組與空白對照組相比極顯著地增加了性未成熟雌性小鼠子宮系數(P <0.01)。見表1，圖I。說明懷牛膝水提物在體內具有雌激素樣作用。表I懷牛膝水提物對性未成熟小鼠子宮系數的影響(]^s, n=6)
權利要求
1.一種懷牛膝水提物在制備雌激素類藥物中的應用，所述的懷牛膝水提物是，將懷牛膝每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2 h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到懷牛膝浸膏狀水提物。
全文摘要
本發明涉及懷牛膝水提物在制備雌激素類藥物中的應用，可有效解決由于體內雌性激素分泌異常而引起的疾病用藥問題，其解決的技術方案是，將懷牛膝每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到懷牛膝浸膏狀水提物，該懷牛膝水提物可有效用于制備和預防由于體內雌激素分泌異常引起的相關疾病的藥物，實現懷牛膝水提物在制備治療由于體內雌性激素分泌異常而引起的相關疾病藥物中的應用，本發明水提物制備方法簡單，穩定可靠，并經多次試驗，均取得了相同或相近似的結果，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌激素類藥物，開辟了懷牛膝藥用新用途，臨床意義巨大。
文檔編號A61P15/12GK102805760SQ201210251389
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者鄭曉珂, 馮衛生, 蔣贇, 劉朝妍, 王小蘭 申請人:河南中醫學院