專利名稱：胡桃醌在制備治療自身免疫及炎癥性疾病藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥應用技術領域，涉及中藥單體胡桃醌(Juglone)在制備作為治療自身免疫性疾病、神經系統炎癥性疾病藥物方面應用。
背景技術：
核桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)為胡桃科胡桃屬落葉喬木,為珍貴的用材樹種和重要的藥源植物。胡桃醌(Juglone ；Nucin)又名5-羥基-1,4-萘醌;5_羥基-I,
4-萘二酮。是從胡桃楸新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物，是胡桃揪中主要的活性物質。胡桃揪皮為收斂藥，對細菌性痢疾，骨結核等有一定療效。近年來大量研究顯示，胡桃醌有抗真菌、抗衣原體或HIV病毒、降血糖和殺蟲等生物活性，而且具有抗腫瘤作用，其在對肝癌、肺癌、黑色素瘤、小鼠自發性胃癌等多種腫瘤細胞株有抑制作用，越來越被人們所重視。但是胡桃醌對自身免疫性疾病、神經系統炎癥性疾病的影響尚未報道。因此，進一步開發胡桃醌免疫調節和抗炎癥活性，有著非常重要的應用前景。多發性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是以中樞神經系統白質脫髓鞘病變為特點，好發于青壯年，發病年齡多在20 40歲，具有高致殘率、高復發性的特點，部分患者病情呈進行性加重。因多發性硬化癥會侵犯神經纖維的髓鞘、故臨床癥狀端看受損神經纖維為何而決定。一般而言運動、感覺以及視覺的影響都很常見；若腦干及小腦系統的神經纖維受損、復視、吞咽困難、步履不穩、暈眩的癥狀亦可能發生。如果脊髓發炎、除了運動、感覺功能外、排泄的功能亦發生障礙。少數病患還會有癲癇及智能障礙的發生。迄今尚無肯定有效的治愈辦法。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE, experimental autoimmuneencephalomyelitis)是多發性硬化(MS)的成熟動物模型，因其可模擬多發性硬化的病理發生和臨床表現而被廣泛應用。實驗室常用致敏原多為腦或脊髓組織勻漿、髓鞘堿性蛋白成分或其多肽片段等，免疫對象多為嚙齒類動物來構建EAE模型，不同的致敏原可產生發病癥狀不同的EAE模型，可根據其要建立的EAE模型的類型選擇不同的致敏原及不同的被免疫對象。本實驗選用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)作為抗原免疫C57BL/6小鼠制作M0G35-55-EAE小鼠模型。本實驗中用到的髓鞘少突膠質細胞糖蛋白雖然在髓鞘蛋白中含量很少，只占髓鞘蛋白成分的0. 01%-0. 05%，但由于MOG存在于髓鞘膜和少突膠質細胞的最外層，具有高度免疫原性，且在構建EAE過程中發現，MOG是唯一能引起脫髓鞘抗體反應又能引起T細胞反應的中樞神經系統髓鞘蛋白成分。因此，用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白去免疫小鼠可以建立發病機理及其臨床癥狀同MS極其相似的EAE模型。目前，EAE/MS的病理發生機制還沒有被完全了解，但是普遍認為EAE是由輔助性T細胞(THl和TH17)介導的自身免疫性炎癥引起的中樞神經系統炎癥性疾病，不同的輔助性T細胞的定向分化取決于樹突狀細胞來源的不同抗原信號刺激。樹突狀細胞是專職抗原提呈細胞，其主要功能是攝取、加工處理和提呈抗原，啟動特異性免疫應答。成熟樹突狀細胞表面特征性標志位⑶IaXDl Ic和⑶83，可高表達MHC II / I類分子(人的MHC稱為HLA)和共刺激分子(如CD80，CD86，其攝取、加工處理抗原能力弱，而提呈抗原、啟動免疫應答能力強。樹突狀細胞能誘導初始T細胞活化，因此是機體特異性免疫應答的始動者。我們通過監測樹突狀細胞表面標記物⑶83，⑶86以及HLA-DR的表達來研究胡桃醌是否影響樹突狀細胞的成熟及功能。T細胞是免疫細胞中的較大群體，分為不同亞群(如CD4陽性和CD8陽性兩大群體)。CD4陽性初始T細胞通過來源于樹突狀細胞的不同信號(如不同細胞因子)刺激，進而又定向分化為不同的T細胞亞型來行使不同的免疫功能。CD4陽性T細胞又分為輔助性T細胞和調節性T細胞。輔助性T細胞分為TH1，TH2，TH17三大群體。THl由IL-12或IFN- y刺激⑶4陽性初始T細胞，通過轉錄因子T-bet分化而來，THl細胞分泌IFN- y，可介導細胞免疫起始以及炎癥反應。研究顯示IFN-Y體內失衡可導致自身免疫性疾病的發生；TH2細胞由IL-4刺激⑶4陽性初始T細胞細胞，通過轉錄因子GATA-3分化而來，在機體中其主要通過分泌IL-4、IL-IO等抗炎因子來抑制炎性反應；TH17由TGF-P、IL-23及IL-6刺激⑶4陽性初始T細胞，通過轉錄因子ROR y t分化而來，TH17細胞分泌IL-17A，可介導炎癥反應。因此，抑制炎性因子的釋放和促進抗炎因子的分泌成為治療自身免疫性疾病的方向之一。
發明內容
本發明的目的是公開一種胡桃醌(Juglone )在制備作為治療自身免疫性、神經系統炎癥性疾病藥物方面的應用。其中胡桃醌在治療自身免疫性疾病、神經系統炎癥性疾病藥物中的口服有效劑量優選為3 mg/Kg體重/天。按照人50-60Kg體重0. 15-0. 18g/天。本發明進一步公開了胡桃醌在制備治療器官移植抑制免疫排斥藥物中的應用。實驗結果表明胡桃醌(Juglone)抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎脾臟中CDllb+抗原提呈細胞⑶83和MHC II的表達即抑制樹突細胞表型成熟；它可以抑制免疫系統的激活，因此可以治療自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥。本發明所述的自身免疫性疾病指的是免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫性疾病。本發明所述的免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫疾病指的是多發性硬化癥(圖1-8)、自身免疫性視網膜炎(圖5-7)、視神經脊髓炎(圖5-7)、系統性紅斑狼瘡(圖
5-7)、橋本氏甲狀腺炎(圖5-7)、自身免疫性溶血性貧血(圖5-7)、自身免疫性血小板減少癥(圖5-7)、重癥肌無力(圖5-7)、原發性膽汁性肝硬變(圖5-7)、侵襲性慢性肝炎(圖5-7)、慢性腎小球炎(圖5-7)、肌炎(圖5-7)、系統性硬化癥(圖5-7)。本發明所述的神經系統炎癥性疾病指的是多發性硬化癥(圖1-8)、視神經脊髓炎(圖5-7)和急性播散性腦脊髓炎(圖5-7);因為本發明中所用實驗性自身免疫腦脊髓炎動物模型是研究這三種疾病的動物模型。其口服有效劑量優選為3 mg/Kg體重/天。本發明運用實驗動物模型進行了大量的藥理實驗，實驗結果表明胡桃醌可以降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病率、臨床評分平均分、臨床評分最高分和臨床評分總分；降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的脊髓中IFN-Y分泌相關Thl細胞和IL-17A分泌相關Thl7細胞占CD4+T細胞的百分數；抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎MOG誘導的T細胞的增殖；降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎脾臟中CDllb+抗原提呈細胞CD83和MHC II的表達。實驗性自身免疫腦脊髓炎是多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎的實驗動物模型，也是研究自身免疫和炎癥性疾病的典型的動物模型。因此，本發明有望在臨床上成為治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。
圖I為口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病率圖；說明胡桃醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發性硬化癥、神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎等神經系統炎癥性疾病；
圖2為口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病臨床評分平均分數圖；說明胡桃醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發性硬化癥、神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎等神經系統炎癥性疾病；
圖3為口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病臨床評分的最高分數圖；說明胡桃醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發性硬化癥、神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎等神經系統炎癥性疾病；
圖4為口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病臨床評分的總分數圖。說明胡桃醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發性硬化癥、神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎等神經系統炎癥性疾病；
圖5為口服胡桃醌(Juglone，3mg/kg)降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的脊髓中IFN- y分泌相關Thl細胞占CD4陽性T細胞的百分數；說明胡桃醌可以治療以輔助性T細胞THl亞群介導為特點的疾病；
圖6為口服胡桃醌(Juglone，3mg/kg)降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的脾臟中IL-17A分泌相關Thl7細胞占CD4陽性T細胞的百分數；說明胡桃醌可以治療以輔助性T細胞TH17亞群介導為特點的疾病；
圖7為口服胡桃醌(Juglone, 3mg/kg)抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎不同濃度MOG誘導的脾臟中T細胞的增殖；說明胡桃醌可以治療以T細胞介導為特點的自身免疫性疾病；
圖8為口服胡桃醌(Juglone，3mg/kg)降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎脾臟中⑶Ilb+抗原提呈細胞⑶83和MHC II的表達；說明胡桃醌可以抑制抗原提呈細胞尤其是樹突狀細胞的成熟；可以抑制免疫系統的激活，因此可以治療自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥(n=8只小鼠，圖表示為平均值土標準差，*p〈0. 05, ** p〈0. 01, ***p〈0. 001，t 檢驗)。
具體實施例方式 下面結合實施例說明本發明，這里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定，其中胡桃醌(Juglone)有市售，其它所用的試劑，除特別標注外均有市售。實施例I
I.I EAE小鼠模型的構建方法
(I)實驗動物及來源
雌性野生型C57BL/6無病原體(SPF級)小鼠30只，6_8周齡，體重18_20g，購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于天津醫科大學實驗動物中心，小鼠的飼養環境為室溫20-25°C，相對濕度為40%-60%。
(2)抗原佐劑乳化物的制備
100 Ii g M0G35-55 多妝和 500 u g 滅活的分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,結核桿菌，購自Difco公司)與100 ill生理鹽水和100 ill Freund’s佐劑(購自SIGMA公司)完全混合，乳化。⑶實驗分組
為研究胡桃醌在小鼠EAE動物模型中的藥物作用，小鼠隨機分四組，每組8只小鼠，分別為兩個生理鹽水對照組和兩個3mg/kg/天胡桃醌給藥組。一個對照組和一個胡桃醌給藥組每天檢查記錄小鼠EAE發病情況和臨床神經功能分級至免疫誘導后35天；另一個對照組和一個胡桃醌給藥組在小鼠EAE發病高峰期即免疫誘導后第15天處死，取脊髓和脾臟。 (4)實驗方法和步驟
a.小鼠后背皮下分2個點注射乳化劑(100 U I/點)。b.同時在當天尾靜脈注射200ng的百日咳毒素。c.免疫48小時后每只小鼠再次尾靜脈注射200ng百日咳毒素(pertussis toxin,購自 List Biological Laboratories)。d.胡桃醌給藥組從免疫誘導后第7天開始每天用胡桃醌灌胃給藥，劑量為3mg/kg/ 天。e. 7-14天后小鼠開始發生EAE。每天檢查記錄小鼠EAE發病情況和臨床神經功能分級。(5) EAE小鼠模型臨床評分標準
小鼠經MOG免疫后，隔日采用盲法由兩名觀察者，采用國際通用的5分評分制對小鼠進行臨床評分，每天檢查并記錄疾病的臨床神經功能分級，直至MOG免疫后35天。小鼠EAE動物模型神經功能評分具體標準如下0分，無明顯異常，沒有明顯的臨床癥狀；0. 5分，部分尾巴無力松弛；1分，完全尾巴癱瘓可見輕度笨拙；2分，后肢無力，行動遲緩，輕度共濟失調；2. 5分，一條后肢癱瘓；3分，雙側后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可挪動；3. 5分，雙側后肢癱瘓，前肢無力；4分，雙側后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態或死亡。I. 2取脊髓做細胞內染色
(1)細胞準備
a.麻醉小鼠，無菌分離脊髓組織。b.用注射器活栓輕輕研磨脊髓完全破碎
c.細胞懸液用40 iim篩網過濾，并加2-3ml無血清RPMI1640培養基沖洗篩網兩次。d. 1500轉/分鐘，離心5分鐘收集細胞，棄上清，重懸細胞。e.用6mlRPMI1640完全培養基重懸細胞，調整細胞密度為5x107ml
(2)刺激細胞因子分泌
a.每孔加入濃度為fcefeldin A(BFA) I u I/ml，100ng/ml佛波醇酯(PMA)和終濃度
IV- g/ml I丐離子霉素(Ionomycin) , 37。。，5% CO2 刺激 5 小時。(3)收集細胞進行細胞因子染色
a.1500rpm/min離心收集細胞,棄上清。b.充分重懸細胞后加入熒光標記表面抗體⑶4，4°C避光反應30分鐘。
c.每管加入staining buffer (SB) lml, 1500轉/分鐘洗兩次,棄上清。d.每管加入BD cytofix/prem試劑250 ii 1,4°C避光反應30分鐘 e.每管加入BD cytoprem/wash試劑，1800轉/分鐘洗一次,棄上清。f.每管加入封閉液25 ill (其中包括20 U I 10%BSA和5 大鼠血清)，4°C避光反應30分鐘。g.加入熒光標記的細胞因子抗體IFN-Y和IL-17A (及同型對照)，4°C避光反應30分鐘。h.每管加入BD cytoprem/wash試劑，1800轉/分鐘洗一次,棄上清。i.每管加入SB Iml, 1800轉/分鐘洗一次，棄上清， j.細胞用2%PFA 200 u I重懸。
k.上流式細胞儀檢測
I.3 MOG重刺激T細胞增殖 (I)脾細胞準備
a.麻醉小鼠，無菌分離脾臟組織。b.將脾臟放在40 篩網上，用注射器活栓輕輕研磨脾臟至完全破碎。c.加2_3ml無血清RPMI1640培養基沖洗篩網兩次，將細胞懸液轉移至15ml管中。d. 1500轉/分鐘，離心5分鐘收集細胞，棄上清。e.加入I. 8ml無菌超純水,迅速混勻后加入200 U I無菌的IOxPBS迅速混勻，裂
解紅細胞。f. 1500轉/分鐘，離心5分鐘離心收集細胞，棄上清。g.用預溫的IXPBS (含0. 1%BSA)重懸細胞，調整細胞密度為lxl06/ml。 (2)標記CFSE標記細胞
a.每ml細胞中加入0. 4 ill的CFSE貯存液，終濃度為2 y M。b. 37 °C 孵育 10 分鐘。c.加入5倍體積的預冷培養基，終止染色。d.冰上孵育5分鐘。e. 1300轉/分鐘，離心5分鐘收集細胞。f.用新鮮培養基洗3次。g.轉移細胞至孔板中培養
(3)MOG重刺激細胞
a.加入不同濃度的MOG刺激(0，2，5，10，15,20 u g/ml)
b.72h后收集細胞，做流式檢測。I. 4 CDllb 陽性 APC 表染 C083, CD86, MHC II
(I)脾細胞準備
a.麻醉對照組及胡桃醌治療組小鼠，無菌分離脾臟組織。b.將脾臟放在40 篩網上，用注射器活栓輕輕研磨脾臟至完全破碎。c.加2-3ml無血清RPMI1640培養基沖洗篩網兩次，將細胞懸液轉移至15ml管中。d. 1500轉/分鐘，離心5分鐘離心收集細胞，棄上清。e.加入I. 8ml無菌超純水,迅速混勻后加入200 U I無菌的IOxPBS迅速混勻，裂解紅細胞。f. 1500轉/分鐘，離心5分鐘離心收集細胞，棄上清。g.用1640RPMI完全培養基重懸細胞，調整細胞密度為lxl06/ml。(2) MOG重刺激細胞
a.加入同濃度的MOG刺激(20ii g/ml)
b.48h后收集細胞。(3)加入抗體染色
a. 1500轉/分鐘，離心5分鐘離心收集細胞，棄上清。 b.每管加入封閉液25 ill (其中包括20 U I 10%BSA和5 大鼠血清)，4°C避光反應30分鐘。c.每管加入熒光標記的細胞因子抗體⑶I Ib+和⑶83 (或⑶86，或MHC
II)(及同型對照)，4°C避光反應30分鐘。d.每管加入I XPBS，1500轉/分鐘，離心5分鐘洗2次，棄上清。e.細胞用 2%PFA 200 U I 重懸。f.流式細胞儀檢測
實驗結果胡桃醌可以降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病率(圖I)、臨床評分平均分(圖2)、臨床評分最高分(圖3)和臨床評分總分(圖4);降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的脊髓中IFN- y分泌相關Thl細胞和IL-17A分泌相關Thl7細胞占⑶4+T細胞的百分數(圖5，6);抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎MOG誘導的T細胞的增殖；降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎脾臟中⑶Ilb+抗原提呈細胞⑶83和MHC II的表達。因此，本發明涉及制備抑制免疫系統的藥物，有望在臨床上成為治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。實施例2
胡桃醌50g與280g淀粉混合均勻，用淀粉漿(取淀粉220g用水制成淀粉漿)制顆粒，過篩，干燥，裝膠囊。實施例3
胡桃醌80g與淀粉340g混合均勻，用淀粉漿(取淀粉2IOg用水制成淀粉漿)制顆粒，過篩，干燥，加6%。硬脂酸鎂，混勻，壓制成片，包薄膜衣即得。實施例4
胡桃醌100g、淀粉400g和纖維素適量過篩，并充分混合，將適量聚乙烯吡咯烷酮溶液與上述的粉混合，過篩，制得濕顆粒于60°C干燥，將羧甲基淀粉鈉鹽，6%。硬脂酸鎂和滑石粉預先過篩，然后加入到上述的顆粒中壓片。
權利要求
1.胡桃醌在制備作為治療自身免疫性疾病、神經系統炎癥性疾病藥物方面的應用。
2.胡桃醌在制備作為治療器官移植抑制免疫排斥藥物中的應用。
3.權利要求I所述的應用，其中所述的自身免疫性疾病指的是免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫性疾病。
4.權利要求3所述的應用，其中免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫疾病指的是多發性硬化癥、自身免疫性視網膜炎、視神經脊髓炎、系統性紅斑狼瘡、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、肌炎、系統性硬化癥。
5.權利要求I所述的應用，其中神經系統炎癥性疾病指的是多發性硬化癥、視神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎。
6.權利要求5所述的應用，其胡桃醌有效劑量按照人體50-60Kg體重0.15-0. 18g/天。
全文摘要
本發明公開了胡桃醌(Juglone)在制備治療自身免疫疾病藥物方面的應用。本發明的實驗結果表明胡桃醌可以降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病率、臨床評分平均分、臨床評分最高分和臨床評分總分；降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的脊髓中IFN-γ分泌相關Th1細胞和IL-17A分泌相關Th17細胞占CD4+T細胞的百分數；抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎MOG誘導的T細胞的增殖；降低小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎脾臟中CD11b+抗原提呈細胞CD83和MHCⅡ的表達。因此，本發明涉及制備抑制免疫系統的藥物，有望在臨床上成為治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。
文檔編號A61P21/04GK102793690SQ201210329059
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者張榮信, 葛禛禛, 張凱, 薛振毅 申請人:天津醫科大學