專利名稱：葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于具有腫瘤靶向的金納米粒子的制備領域，特別涉及一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法。
背景技術：
癌癥已經成為危害全世界人類健康的主要殺手之一，但是如果癌癥可以在早期被檢測出來，則其被治愈的可能性就越高。因此發展癌癥的早期檢測技術已經成為亟待解決的難題。CT成像是目前臨床上用于診斷癌癥的常用手段之一，具有較高的空間和密度分辨率，因此受到了廣泛的研究。為了實施對癌細胞的精確診斷，發展合適的CT造影劑是必不可少的。貴重金屬納米粒子(NPs),如Au NPs和Ag NPs由于其獨特的光學、電子和量子尺寸相關的性能，在醫學領域的應用引起了相當大的科學和技術上的關注，尤其是在生物傳感、疾病的診斷、光熱療法以及藥物和基因傳遞領域。在眾多的以聚合物輔助合成的Au NPs的實例中，以樹狀大分子為模板或穩定劑合成的納米粒子已經引起人們大量的關注。這主要是由于這種新型的、高度支化的和單分散的合成性樹狀大分子的獨特結構和性能。樹狀大分子可定制的表面化學性能，容許研究者輕松地在其表面修飾用于不同生物醫學領域的生物功能團。例如，端基為氨基的樹狀大分子包裹的金納米顆粒(Au DENPs)可以進一步用染料(如熒光素染料)和靶向配體分子(如葉酸、RGD多肽)官能化，用于特異性地檢測癌細胞(Shi et al·，Small 2007，3，1245-1252)。一般情況下，以樹狀大分子為模板或穩定劑功能化金或銀納米顆粒往往涉及兩個步驟1)功能化樹狀大分子；2)合成金屬納米顆粒。這兩個步驟的順序可以根據與膠體顆粒穩定性和復合物的最終應用有關的技術過程顛倒過來。在某些特殊情況下，顆粒的功能化和合成可通過一個步驟同時實現。目前，Au納米顆粒由于具有良好的生物相容性、表面易于修飾、對X射線有較高的吸收等性質，已經被廣泛的研究以用于癌癥的早期檢測。利用樹狀大分子包裹/穩定的金納米顆粒不僅可以提高金納米顆粒的穩定性，而且可以用于CT成像(Wang etal. ,Biomaterials2011, 11 2979-2988)。史向陽等的工作表明，利用聚乙二醇修飾的樹狀大分子包裹納米金顆粒，不僅可以大大提高納米金的包裹量進而提高CT診斷的靈敏度，提高其生物相容性，而且可以進一步延長材料在血液中的循環周期進而延長成像時間(Penget al. ,Biomaterials2012, 4, 1107-1119 ;專利公開號CN102153871A，
公開日
2011 年 8 月17日)。因此聚酰胺-胺樹狀大分子作為CT成像納米造影劑的載體，使開發出具有靶向的、具有較高生物相容性的CT成像造影劑成為可能，從而為癌癥的早期診斷帶來了新的曙光。查找相關的專利和文獻發現，目前還未見使用基于葉酸修飾的聚乙二醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒用于靶向診斷腫瘤的CT成像造影劑的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，該方法制備的金納米顆粒不僅提高了金納米顆粒的穩定性，而且可以用于CT成像來靶向診斷小鼠的腫瘤部位，較好的降低了材料對正常組織的損傷，該制備エ藝簡單，反應條件溫和，具有產業化實施的前景。本發明ー種葉酸修飾聚こニ醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，包括(I)制備葉酸的ニ甲基亞砜溶液，然后用I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)活化2-5h，然后邊攪拌邊逐滴滴加聚こニ醇的ニ甲基亞砜溶液，反應7(T80h后，將反應產物透析，最后冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物FA-PEG-C00H ；(2)用ニ甲基亞砜溶解端基為氨基的樹狀大分子(G5. NH2),得到樹狀大分子溶液；將步驟(I)中所得的固體產物FA-PEG-C00H溶解在ニ甲基亞砜溶液中，并經EDC · HCl活化后逐滴加入上述樹狀大分子溶液中，反應60-80h后再加入使用EDC · HCl活化后的一端是 羧基的聚こニ醇單甲醚(mPEG-COOH)，反應60_80h后將反應產物透析，最后冷凍干燥得到固體 G5. NH2- (PEG-FA) -mPEG ；(3)將步驟(2)所得固體G5. NH2- (PEG-FA) -mPEG用ニ甲基亞砜或水溶解后，再加入氯金酸溶液，然后在室溫下攪拌20 40min,隨后加入NaBH4溶液，在室溫下攪拌反應I. 5
2.5h后加入三こ胺，攪拌混合20 40min后，再加入こ酸酐，在室溫下攪拌反應20 28h，隨后將反應產物透析，最后冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒({(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs )。步驟(I)中所述的葉酸的ニ甲基亞砜溶液中葉酸與ニ甲基亞砜的用量比為2(T30mg :20mL ;所述的葉酸與I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)的用量比為 20 30mg :8. 69 13. 03mg。步驟(I)中所述的聚こニ醇一端是羧基另一端是氨基，即為NH2-PEg-COOH ;所述的聚こニ醇的ニ甲基亞砜溶液中聚こニ醇NH2-PEg-COOH (干重)與ニ甲基亞砜的用量比為45. 31 67. 97mg lmL ；EDC · HCl活化的葉酸與的聚こニ醇NH2-PEG-C00H的摩爾比為2:1。步驟(2)中所述的樹狀大分子溶液中端基為氨基的樹狀大分子(干重)與ニ甲基亞砜的用量比為2(T30mg :15mL。步驟(2)中所述的固體產物FA-PEG-C00H與ニ甲基亞砜的用量比為14. 99 22. 49mg :5mL。步驟(2)中所述的樹狀大分子(干重)、固體產物FA-PEG-C00H與使用EDC · HCl活化后的一端是羧基的聚こニ醇單甲醚(mPEG-COOH)的用量比為2(T30mg :14. 99 22. 49mg 23. 19 34. 80mg。步驟(2)中所述的樹狀大分子為第5代聚酰胺-胺型樹狀大分子；固體產物FA-PEG-C00H、使用EDC · HCl活化后的一端是羧基的聚こニ醇單甲醚與樹狀大分子的摩爾比為 5:15:1。步驟(3)中所述的氯金酸溶液為10mg/mL的HAuCl4甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl4水溶液。步驟(3)中所述的NaBH4溶液中NaBH4與樹狀大分子的用量比為29. 25^43. 88mg 2(T30mg ；NaBH4 溶液為 NaBH4 的 H20/CH30H 溶液，H2O 與 CH3OH 的體積比為 2:1。
步驟(3)中所加入的氯金酸與樹狀大分子的摩爾比為300:1 ;所加入的NaBH4溶液中NaBH4與金元素的摩爾比為5:1。步驟(3)中所加入的三乙胺與樹狀大分子的摩爾比為550:1，所加入的乙酸酐與樹狀大分子的摩爾比為600:1。步驟(I)、(2)和(3)中所述的透析具體為將反應產物用透析膜在磷酸鹽緩沖液中透析24h，然后再用超純水透析48h ;所述的透析膜為纖維素透析膜，分子量截留為1000。本發明得到的基于葉酸修飾的聚乙二醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒用于制備靶向診斷腫瘤的CT成像造影劑。本發明使用核磁共振譜(1H NMR)、紫外一可見分光光度計(UV-Vis)、透射電子顯微鏡( Μ)、CT成像等方法表征本發明制備的葉酸修飾的聚乙二醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒，同時用Micro-CT測試來檢驗葉酸修飾的聚乙二醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒對小鼠活體腫瘤的靶向CT成像效果，具體測試結果如下 (I) 1H NMR 譜核磁共振氫譜結果證實了 {(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs的結構正確，見附圖I。(2)紫外一可見光分光光度計的測試結果在水溶液中合成的{(Au0)30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 在 280nm和 510nm左右都有一個特征吸收峰，這是分別是葉酸分子的紫外吸收峰和金納米顆粒的表面等離子體共振峰，參見附圖2 ;葉酸修飾的聚乙二醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒在水中具有良好的膠體穩定性，即使樹狀大分子表面多余的氨基被乙酰化修飾之后，材料在不同的PH值(pH=5. 0-9. O)和不同溫度(4°C -50°C)范圍內均具有良好的膠體穩定性，這說明合成的金納米顆粒在水溶液中具有良好的穩定性，參見附圖3 ；(4)透射電子顯微鏡測量在水中合成的{(Au0)30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 的 TEM 圖片和粒徑分布直方圖(參見附圖4)，表明了合成的金納米顆粒的粒徑分布均勻，平均粒徑約為4. 10±0· 99nm。{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 的高分辨 TEM 圖片(見附圖 4c)和選區電子衍射圖(見附圖4d)表明所合成的金納米顆粒晶化程度比較高。(111)、(200)、(220)和(311)環說明所合成的金納米顆粒呈面心立方(fee)晶體結構。(5)體外材料的X-射線吸收性將合成的材料{(Au°)3QQ-G5· NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs配制成一系列的濃度，通過CT測量計算材料的X-射線吸收性。結果發現，在Au和I相同摩爾濃度時，{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs較臨床常用造影劑Omnipaque具有更高的X-射線吸收性(見附圖5)。(6) MTT材料毒性檢測將不同濃度的材料與細胞共培養，通過MTT毒性檢測，可以看到在金納米顆粒的濃度高達300 μ M時也未見較為明顯的毒性(見圖6)，同時通過細胞形貌HE染色也可以看到細胞形貌也沒有明顯的變化(見圖7)。(7)銀染分析材料對KB細胞靶向吞噬作用
將高受體KB細胞(HFKB)和低受體KB細胞(LFKB)分別與{(Au0) 300_G5·NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs (金的濃度分別為100、300 μ Μ)共培養24h后，通過銀染檢測HFKB和LFKB細胞對金納米顆粒的吞噬量，結果發現高受體的KB細胞對材料的吞噬量要大于低葉酸受體KB細胞對材料的吞噬量，從而證明了已經合成的材料{(AU°)3CICI-G5.NHAc-(PEG-FA) -mPEG}DENPs對高受體的KB細胞具有特異性靶向作用(見圖8)。(8)小鼠活體腫瘤成像將100 μ L 的{(Au0) 3(I(I-G5· NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs ([Au] =0. lmol/L)尾部靜脈注射進體重為18g的小鼠體內，分別通過Micro-CT掃描診斷小鼠的腫瘤部位所得的圖片(圖9)，從CT成像圖片中均能夠看到小鼠的腫瘤部位的相對信號強度較高，且小鼠未發現死亡，證明本方法合成的{(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs具有較低的生物毒性和較好的CT成像靶向診斷小鼠腫瘤的效果。本發明的方法簡單，反應條件溫和，易于操作，具有產業化實施的前景；本發明提高了金和樹狀大分子之間的摩爾比，降低了材料的成本，同時提高了金納米粒子的穩定性，葉酸的修飾使得材料對腫瘤組織具有良好的靶向成像效果。有益效果(I)本發明的制備エ藝簡單，反應條件溫和，具有產業化實施的前景；(2)本發明設計合成的基于葉酸修飾的聚こニ醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒具有較好的水溶性、穩定性及水分散性，同時具有較低的細胞毒性，較高的X-射線衰減系數；(3)本發明的基于葉酸修飾的聚こニ醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒對葉酸受體過表達的腫瘤細胞具有較好的靶向性，同時可以用于CT成像，可以靶向診斷小鼠活體的腫瘤部位，因此使它們具有了應用于腫瘤的早期檢測領域的前景。
圖I 為本發明制備的 G5. NHAc-(PEG-FA)-mPEG Ca)和{(Au0) 300 - G5.NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs (b)的核磁共振氫譜圖；圖2 為本發明制備的 G5. NHAc-(PEG-FA)-mPEG 和{(Au。) 3(I(I-G5·NHAc-(PEG-FA) -mPEG}DENPs 在 25°C、pH=7. O 的紫外吸收光譜圖；圖3 為本發明制備的{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 在不同溫度(a)和不同pH值(b)下的紫外吸收光譜圖；圖4 為本發明制備的{(Au。) 3QQ-G5· NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 的(a) TEM 圖片；(b)粒徑分布圖；(c)高分辨TEM圖片；(d)選區電子衍射；圖5 為本發明制備的{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 材料在體外的X-射線吸收強度圖；圖6為本發明制備的{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs材料在金的濃度為0-400 μ M與KB細胞共培養24h后的MTT的檢測結果；圖7為本發明制備的{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs材料在金的濃度為100 μ M (b) 300 μ M (C)與KB細胞共培養24h后的HE染色后的細胞形貌，a為空白對照；圖8為本發明制備的{(Au°) 3QQ-G5· NHAc-(PEG-FA)-mPEG} DENPs材料在金的濃度為0,100,300 μ M分別與高受體KB細胞(HFKB)和低受體KB細胞(LFKB)共培養24h，隨后對細胞進行銀染后的效果圖；圖9 為本發明制備的{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs 材料和{(Au0) 30Q-G5. NHAc-mPEG} DENPs ([Au]均為 O. lmol/L, O. 5 μ L)經由兩種不同方式(分別為尾部靜脈注射和腹腔注射)注射入接種了 KB腫瘤模型的小鼠體內，不同時間下Micro-CT掃描成像診斷小鼠的腫瘤部位所得的圖片(a) ({(Au0) 300-G5. NHAc-(PEG-FA)4-PEG1JDENPs靜脈注射(I)和腹腔注射(2)，腫瘤部位葉酸阻斷后{(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) 4_PEGn}DENPs靜脈注射(3 )和腹腔注射(4 )、{(Au0) 3(I(I-G5. NHAc-mPEG} DENPs靜脈注射(5 )和腹腔注射(6))和腫瘤部位的CT信號值(b)；圖10 為本發明制備的{(Au。) 3QQ-G5· NHAc-(PEG-FA)-mPEG} DENPs 材料和{(Au0) 30Q-G5. NHAc-mPEG} DENPs ([Au]均為 O. lmol/L, O. 5 μ L)經由兩種不同方式(分別為尾部靜脈注射和腹腔注射)注射入接種了 KB腫瘤模型的小鼠體內，注射6h后小鼠的腫瘤部位的組織切片圖({(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) 4_PEGn} DENPs靜脈注射(a)和腹腔注射(b)，腫瘤部位葉酸阻斷后{(Au°)3CICI-G5. NHAc-(PEG-FA)4-PEG1JDENPs靜脈注射(c)和腹腔注射 (d)、{(Au0) 300-G5. NHAc-mPEG}DENPs靜脈注射(e)和腹腔注射(f)，g為空白對照)。圖11 為本發明的制備的{(Au°) 3QQ-G5· NHAc-(PEG-FA) -mPEG}DENPs 的簡易流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I(I)用20mL的二甲基亞砜溶液稀釋20mg的葉酸，使用8. 69mg的I-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC3h，然后邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL 二甲基亞砜的干重為45. 3Img的聚乙二醇(NH2-PEG-C00H)，反應7(T80h后，將反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用超純水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚乙二醇固體產物(FA-PEG-C00H) ο(2)用15mL的二甲基亞砜溶液溶解干重為30mg的樹狀大分子，然后取(I)中所得的固體22. 49mg，溶解在5mL 二甲基亞砜溶液并使用EDC. HCl活化過后逐滴加入樹狀大分子溶液，反應72h后再加入干重為34. 80mg的用EDC. HCl活化的一端是羧基的聚乙二醇單甲醚(mPEG-COOH)，反應72h后反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，隨后用超純水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得固體G5. NH2- (PEG-FA) -mPEG。合成過程中對樹狀大分子表面修飾用核磁進行表征，對各個峰進行積分計算可知樹狀大分子載體表面修飾了 4個PEG-FA和12個mPEG分子(附圖la)。對得到的產品G5. NH2-(PEG-FA)-mPEG進行紫外吸收表征(附圖2，曲線1)，FA中苯環的吸收峰在290nm，證明了 FA已經被成功地修飾在樹狀大分子表面。這些測試結果表明已成功制備了設計合成的功能化的樹狀大分子G5. NH2- (PEG-FA) -mPEG。實施例2
(I)用20mL的ニ甲基亞砜溶液稀釋30mg的葉酸，使用13. 03mg的I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽(EDC .HCl)活化3h，然后邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL ニ甲基亞砜的干重為67. 97mg的聚こニ醇(NH2-PEG-C00H)，反應7(T80h后，將反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用超純水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物(FA-PEG-C00H) ο(2)用15mL的ニ甲基亞砜溶液溶解干重為20mg的樹狀大分子，然后取(I)中所得的固體14. 99mg，溶解在5mL ニ甲基亞砜溶液并使用EDC · HCl活化過后逐滴加入樹狀大分子溶液，反應72h后再加入干重為23. 19mg的用EDC -HCl活化的一端是羧基的聚こニ醇單甲醚(mPEG-COOH)，反應72h后反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，隨后用超純水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得固體G5. NH2- (PEG-FA) -mPEG。實施例3 取的實施例I制備的G5. NH2-(PEG-FA) -mPEG,用20mL甲醇或水將其溶解后，再加入氯金酸溶液(10mg/mL)，在室溫下攪拌30min后加入冰的NaBH4溶液(43. 88mg, CH3OHiH2O(體積比)=2:1),在室溫下攪拌反應2h，向反應體系加入88. 9 μ L三こ胺，攪拌混合30min后，再向反應液中加入72. 4μ Lこ酸酐，在室溫下攪拌反應24h，隨后將反應產物用透析膜在PBS緩沖溶液和超純水中透析，最后將純化后的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒({(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs)。所述的氯金酸溶液為10mg/mL的HAuCl4甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl4水溶液；所述的NaBH4溶液為NaBH4的H20/CH30H溶液，H2O與CH3OH體積比的為2:1 ;所加入的氯金酸與樹狀大分子的摩爾比為300:1 ;所加入的NaBH4溶液中NaBH4與金元素的摩爾比為5:1 ;所加入的三こ胺與樹狀大分子的摩爾比為550:1，所加入的こ酸酐與樹狀大分子的摩爾比為600:1。合成過程中對所形成的Au DENPs用紫外吸收光譜(附圖2，曲線2)和TEM(附圖3)進行了表征。附圖2中，Au DENPs的表面等離子體共振(SPR)峰在520nm，證明了 Au DENPs已經被成功地制備。TEM圖片(附圖4)表明金納米顆粒直徑約3. 10nm，尺寸分布較窄，具有良好的形貌。這些測試結果表明已成功制備了設計合成的功能化的樹狀大分子包裹的納米金顆粒{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs。實施例4以體外CT測試的亨氏單位(HU)值來檢驗實施例3合成的材料{(Au°) 3(i(|-G5.NHAc-(PEG-FA) -mPEG}DENPs與傳統造影劑歐乃派克(Omnipaque)的CT值。取實施例3樣品8. 55mg溶解在200 μ L的PBS緩沖液中配制金濃度為O. IM的溶液，再分別稀釋到金濃度為O. 06Μ，0· 02Μ，0· ΟΙΜ,Ο. 005Μ的溶液各100 μし取歐乃派克42. 3mL(碘的濃度為300mg/mL)稀釋至ImL配置成碘濃度為0. IM的溶液，再分別稀釋到碘濃度為0. 06M，0. 02M，0. 01M,0. 005M的溶液各100 μし用CT測試儀測試各個樣品的HU值并得出X-射線衰減與金或碘濃度的線性關系。附圖5為{(Au°)3CICI-G5. NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs與歐乃派克在相同金或碘濃度下的X-射線衰減的線性關系圖。從圖5中可以看出在金和碘濃度相同的條件下，{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs比歐乃派克的HU值大，證明本方法合成的{(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs較單ー的碘造影剤具有更好的X-射線衰減強度。實施例5
以人口腔上皮癌細胞(KB)為模型細胞，通過MTT法考察其與不同金濃度的{(Au0) 300-G5. NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs共培養后的細胞活力(附圖7)。取實施例3樣品8. 55mg溶解在200 μ L的PBS緩沖液中配制金濃度為O. IM的溶液，再分別稀釋到金濃度為100 μ Μ，200 μ Μ, 300 μ Μ, 400 μ M的溶液各I. OmL。隨后將配置好的溶液與KB細胞共培養24h后，利用HE染色(圖7)觀察細胞形貌，并用MTT (附圖6)法檢測細胞活力。結果表明{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs在金濃度達到300 μ M時對細胞形貌和細胞活力仍無明顯的影響。因此，本研究設計合成的{(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs具有良好的生物相容性。實施例6以人口腔上皮癌細胞(KB)為模型細胞，通過銀染檢測葉酸阻斷實驗中不同金濃度的{(Au°)3CICI-G5. NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs分別與高、低葉酸受體表達的KB細胞共培養24h后的吞噬效果(附圖8)。取實施例3樣品8. 55mg溶解在 200 μ L的PBS緩沖液中配制金濃度為O. IlM的溶液，再分別稀釋到金濃度為100μΜ，200μΜ，300μΜ，400μΜ的溶液各I. OmL。隨后將配置好的溶液分別與高、低葉酸受體表達的KB細胞共培養24h后，利用銀染色(圖8)觀察細胞形貌。結果表明隨著金濃度的増加，KB細胞對{(Au°) 3(i(i-G5.NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs的吞噬量逐漸增多(細胞銀染效果更黑)，且相較于低葉酸受體表達的KB細胞而言，在相同金濃度情況下，高葉酸受體表達的KB細胞對{(AU°)3CICI-G5.NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs具有更強的吞噬能力。因此，本研究設計合成的{(Au0) 3(I(I-G5·NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs對高葉酸受體表達的KB細胞具有良好的靶向性。實施例7將IOOyL 實施例 3 中得到的{(Au0) 300-G5. NHAc-(PEG-FA)-mPEG} DENPs([Au]=0. lmol/L)分別經尾部靜脈注射、腹腔注射進體重為18_20g的構建了高、低葉酸受體表達的腫瘤模型的小鼠體內，同時將{(Au°)3QQ-G5.NHAc-mPEG}DENPs ([Au]=0. lmol/L)分別經尾部靜脈注射、腹腔注射進體重為18-20g的腫瘤模型的小鼠體內，分別于用藥后2h、4h、6h和24h通過Micro CT掃描小鼠腫瘤部位的CT圖片(附圖9)。從圖中可以明顯觀察到小鼠的腫瘤部位在不同注射方式注射后6h內，腫瘤部位的CT信號均有所增強，但是通過尾靜脈注射的{(Au°)3CICI-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs在小鼠高葉酸受體表達的腫瘤部位具有更高的CT信號，對腫瘤部位組織用藥6h后切片銀染處理的結果(圖10)也證實了圖9的結論，圖10中通過尾靜脈注射的{(Au°)3QQ-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs在小鼠高葉酸受體表達的腫瘤部位具有更多的金納米顆粒(圖中黒色部分)。圖9和圖10均說明本發明制備的{(Au0) 300-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs對高葉酸受體表達的腫瘤部位具有更好的靶向聚集效果。
權利要求
1.一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，包括 (O制備葉酸的二甲基亞砜溶液，然后用EDC · HCl活化2-5h，然后邊攪拌邊逐滴滴加聚乙二醇的二甲基亞砜溶液，反應7(T80h后，將反應產物透析，最后冷凍干燥得到葉酸修飾的聚乙二醇固體產物FA-PEG-COOH ； (2)用二甲基亞砜溶解端基為氨基的樹狀大分子，得到樹狀大分子溶液；將步驟(I)中所得的固體產物FA-PEG-C00H溶解在二甲基亞砜溶液中，并經EDC -HCl活化后逐滴加入上述樹狀大分子溶液中，反應60-80h后再加入使用EDC -HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇單甲醚，反應60-80h后將反應產物透析，最后冷凍干燥得到固體G5. NH2-(PEG-FA) -mPEG ； (3)將步驟(2)所得固體G5.NH2- (PEG-FA) -mPEG用二甲基亞砜或水溶解后，再加入氯金酸溶液，然后在室溫下攪拌20 40min,隨后加入NaBH4溶液,在室溫下攪拌反應I. 5 2.5h后加入三乙胺，攪拌混合20 40min后，再加入乙酸酐，在室溫下攪拌反應20 28h，隨后將反應產物透析，最后冷凍干燥得到葉酸修飾的聚乙二醇化的樹狀大分子包裹的金納米顆粒{(Au0) 30Q-G5. NHAc- (PEG-FA) -mPEG} DENPs。
2.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的葉酸的二甲基亞砜溶液中葉酸與二甲基亞砜的用量比為2(T30mg 20mL ;所述的葉酸與1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的用量比為20 30mg 8. 69 13. 03mg。
3.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的聚乙二醇一端是羧基另一端是氨基，即為NH2-PEg-COOH ;所述的聚乙二醇的二甲基亞砜溶液中聚乙二醇NH2-PEg-COOH與二甲基亞砜的用量比為45. 31 67. 97mg lmL ；EDC *HC1活化的葉酸與的聚乙二醇NH2-PEG-C00H的摩爾比為2:1。
4.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的樹狀大分子為第5代聚酰胺-胺型樹狀大分子；步驟(2)中所述的樹狀大分子溶液中端基為氨基的樹狀大分子與二甲基亞砜的用量比為2(T30mg 15mL ;步驟(2)中所述的固體產物FA-PEG-C00H與二甲基亞砜的用量比為14.99 22. 49mg :5mL。
5.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的樹狀大分子、固體產物FA-PEG-C00H與使用EDC · HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇單甲醚的用量比為2(T30mg :14. 99 22. 49mg 23.19 34. 80mg。
6.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的固體產物FA-PEG-C00H、使用EDC · HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇單甲醚與樹狀大分子的摩爾比為5:15:1。
7.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的氯金酸溶液為lOmg/mL的HAuCl4甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl4水溶液；所述的NaBH4溶液中NaBH4與樹狀大分子的用量比為29.25 43. 88mg 20^30mg ；NaBH4 溶液為 NaBH4 的 H20/CH30H 溶液，H2O 與 CH3OH 的體積比為2:1。
8.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(3)中所加入的氯金酸與樹狀大分子的摩爾比為300:1 ;所加入的NaBH4溶液中NaBH4與金元素的摩爾比為5:1。
9.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(3)中所加入的三乙胺與樹狀大分子的摩爾比為550:1，所加入的乙酸酐與樹狀大分子的摩爾比為600:1。
10.根據權利要求I所述的一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，其特征在于步驟(I)、(2)和(3)中所述的透析具體為將用透析膜在磷酸鹽緩沖液中透析24h，然后再用超純水透析48h ;所述的透析膜為纖維素透析膜，分子量截留為1000。
全文摘要
本發明涉及一種葉酸修飾聚乙二醇化樹狀大分子包裹的金納米顆粒的制備方法，包括(1)制備葉酸修飾的聚乙二醇固體產物FA-PEG-COOH；(2)依次用FA-PEG-COOH、mPEG-COOH修飾G5.NH2，得固體G5.NH2-(PEG-FA)-mPEG；(3)將步驟(2)所得固體G5.NH2-(PEG-FA)-mPEG溶解后，加入氯金酸溶液，攪拌后加入NaBH4溶液，反應后加入三乙胺、乙酸酐，反應結束后將反應產物透析，最后冷凍干燥即可。本發明的方法簡單，反應條件溫和，易于操作，具有產業化實施的前景；本發明得到的金納米顆粒具有較好的水溶性、穩定性及水分散性，具有應用于腫瘤的早期檢測領域的前景。
文檔編號A61K49/04GK102861344SQ20121033529
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者史向陽, 彭琛 申請人:東華大學