專利名稱：裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠及其制備方法，利用生物素和中性親和素的特異結合，制備能夠裝載抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠，繼而實現抗癌藥物的靶向控釋，屬于高分子藥用材料技術領域。
背景技術：
透明質酸是一種糖胺聚糖，屬于酸性粘多糖，廣泛分布于人體各部位，可調節蛋白質，協助水電解質的擴散及運轉，潤滑關節，調節血管壁的通透性，促進傷口愈合。從醫學角度講透明質酸具有低抗原性、低毒性，在生物體內可降解吸收，且降解產物無毒。在實體腫瘤邊緣組織中有大量透明質酸富集，而且腫瘤細胞表面高度表達透明質酸受體⑶44和透明質酸介導自動性受體RHAMM。⑶44憑借對透明質酸的高親和力，RHAMM憑借介導胞吞作用，二者能夠將透明質酸內吞。⑶44雖然也在正常組織原代細胞中表達，但是，如此表達的⑶44大部分處于一種非活化的沉默狀態，其對透明質酸的親和力要弱得多。因此，透明質酸具有腫瘤靶向性，能夠作為一種抗癌藥物的靶向控釋載體，實現抗癌藥物的靶向控釋。然而，非凝膠態的透明質酸由于其水溶性，并不能用作藥物載體。由于透明質酸具有腫瘤靶向性，據此人們提出兩種實現抗癌藥物控制釋放的方案，一是將抗癌藥物鍵合在透明質酸分子上；二是先采用其它高分子膠束裝載抗癌藥物，之后在膠束表面修飾一層透明質酸分子。然而，抗癌藥物與透明質酸鍵合，藥物分子結構會發生部分改變，其藥理和藥效也會發生變化；而采用透明質酸修飾包裹有抗癌藥物的膠束雖然解決了鍵合存在的問題，但是，作為膠束的高分子材料屬于合成類，與透明質酸相比其生物相容性較差，因此，抗癌藥物藥效難以發揮。透明質酸宏觀凝膠是一種水凝膠。其制備方法包括將透明質酸大分子通過交聯劑交聯鎖住大量水分子，所述交聯劑包括環氧化合物、醛類、酰肼類、碳二亞胺、蛋白質類以及光和金屬離子；或者采用“點擊化學”技術制備透明質酸凝膠。雖然透明質酸宏觀凝膠能夠用于藥物控制釋放，但是，透明質酸宏觀凝膠的凝膠顆粒粒徑不在納米尺度范圍內，在人體中傳輸易被網狀內皮系統吞噬，作為藥物載體難以順利到達病灶。
發明內容
為了獲得一種透明質酸納米微凝膠，在所述透明質酸納米微凝膠裝載抗癌藥物后，抗癌藥物的藥理和藥效得以保持，并且能夠順利到達病灶，使透明質酸生物相容性發揮其應有作用，將抗癌藥物藥效充分發揮出來，我們發明了一種裝載有抗癌藥物靶的透明質酸納米微凝膠及其制備方法。本發明之裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠其特征在于，凝膠顆粒粒徑在10(T500nm尺度范圍內，水溶性抗癌藥物被鎖在透明質酸納米微凝膠空間網絡結構中。本發明之裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法其特征在于，首先用酰肼類化合物將透明質酸分子上的羧基轉化成氨基，得氨基化透明質酸；其次用琥珀酰亞胺活化生物素，得活化生物素；第三在I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將活化生物素接枝到氨基化透明質酸分子上，得生物素化透明質酸；第四將水溶性抗癌藥物和中性親和素與生物素化透明質酸溶解在水中，得裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠。本發明其技術效果在于，由于本發明之透明質酸納米微凝膠的凝膠顆粒粒徑在10(T500nm尺度范圍內，成為一種具有親水表面的納米載體，能夠避免在人體中傳輸時被網狀內皮系統所吞噬，從而順利攜帶藥物到達病灶。另外，抗癌藥物是被鎖在透明質酸納米微凝膠空間網絡結構中，抗癌藥物本身的結構并未發生變化，其藥理和藥效得以保持。并且，抗癌藥物是直接被鎖在透明質酸納米微凝膠空間網絡結構中，并未先行采用合成類高分子材料膠束裝載，因此，本發明依然具有原本的生物相容性，確保抗癌藥物藥效的發揮。在本發明之方法中，由于生物素與中性親和素能夠特異性結合，這使得透明質酸交聯形成空間網絡結構并呈納米微凝膠形態，同時將水溶性抗癌藥物裝載于所述空間網絡結構中并鎖住，這使得抗癌藥物在體內傳輸路徑和存在時間得以延長，并且，裝載于空間網 絡結構中的抗癌藥物實際上被透明質酸包裹，降低了抗癌藥物對非腫瘤部分的毒性，表現為前期靶向控釋。由于生物素與中性親和素結合蛋白不含糖鏈，避免因糖鏈產生的非特異性結合，因此，生物素與中性親和素的結合具有可逆性，使得生物素與中性親和素特異性結合特征還具有可開合的特點，使得所制備的裝載有抗癌藥物靶的透明質酸納米微凝膠具有開關效應。該效應表現在，鑒于透明質酸的腫瘤靶向性，本發明之方法最終產物會富集于腫瘤病灶,所述最終產物被腫瘤細胞通過受體CD44、介導自動性受體RHAMM內吞；給予外在干預，即人體攝入同樣的生物素使生物素過量繼而觸發交聯的透明質酸斷開，所裝載的抗癌藥物被解鎖，裝載其中的抗癌藥物突釋在腫瘤組織中，集中定點釋放，實現靶向控釋，避免對正常組織細胞的損害。在本發明之方法中，透明質酸呈納米微凝膠形態后，依然保持其低抗原性、低毒性，但其機械強度提高。
圖I是透明質酸、氨基化透明質酸和生物素化透明質酸紅外光譜圖。圖2是鹽酸阿霉素在磷酸鹽緩沖溶液中的釋放行為示意圖，該圖同時作為摘要附圖。
具體實施例方式本發明之裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠其凝膠顆粒粒徑在10(T500nm尺度范圍內。水溶性抗癌藥物被鎖在透明質酸納米微凝膠空間網絡結構中。所述水溶性抗癌藥物包括鹽酸阿霉素。本發明之裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法包括以下步驟首先用酰肼類化合物將透明質酸分子上的羧基轉化成氨基，得氨基化透明質酸。所述透明質酸為高分子量透明質酸，分子量為1.5 1.8 MDa，所述酰肼類化合物為己二酸二酰肼。具體方法為己二酸二酰肼和高分子透明質酸的質量比為1:5，己二酸二酰肼的用量為O. I mo I equiv,分別溶于水中，透明質酸的濃度為2. 5 mg/ml,然后將二者各自的水溶液混合，再加入己二酸二酰肼質量的十五分之一的固體I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，室溫攪拌f 4小時，在改性反應過程中用O. I mol/L的鹽酸調節反應溶液的pH值，使其保持在3. 5^4. 7范圍內，得氨基化透明質酸。在這一過程中應當避免反應產物成為酰肼交聯透明質酸水凝膠，成為酰肼交聯透明質酸水凝膠的臨界條件見下表。
透明質酸狀態透明質酸濃度反應溶液pH值范圍己二酸二酰肼用量 氨基化透明質酸 2.5 mg/ml3.5-4.7O. I rnol equiv
透明質酸水凝膠8 mg/ml<3.51.5 mol equiv其次用琥珀酰亞胺活化生物素，得活化生物素。所述琥珀酰亞胺為N-羥基琥珀酰亞胺。具體方法為生物素與N-羥基琥珀酰亞胺等摩爾，與二環己基碳二亞胺一同溶于二甲基甲酰胺溶液中，50°C水浴縮合反應1(Γ20小時。用布氏漏斗濾除不溶性N，N’-二環己基脲(DCU)白色沉淀雜質。在濾液中逐漸加入乙醚進行琥珀酰亞胺活化生物素的沉降，當·不再明顯出現琥珀酰亞胺活化生物素白色沉淀物時，將該白色沉淀物放入冰浴中I小時，·搖勻，過濾，收集白色沉淀物。將白色沉淀物用5(T60°C的熱異丙醇溶解，再將其置于冰浴中超過3小時至沉降完全，過濾，收集沉降物。用二甲基甲酰胺溶解該沉降物，再加入乙醚并放在冰浴中I小時以上，過濾收集沉降物，再用乙醚提取一次。最后用干燥劑五氧化二磷對過濾收集的沉降物進行干燥處理，得到N-羥基琥珀酰亞胺活化生物素。活化反應式為
^ h —
y~mDY" '『L·O Jy
0O00
4翁素琥《SHE胺物素第三在I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將活化生物素接枝到氨基化透明質酸分子上，得生物素化透明質酸。具體方法是將質量比為22:1的氨基化透明質酸和N-羥基琥珀酰亞胺活化生物素用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液溶解，室溫下反應24小時，將反應產物用MWCO of 10000透析袋于二次水中透析24小時以上，凍干，得到生物素化透明質酸。第四將水溶性抗癌藥物和中性親和素與生物素化透明質酸溶解在水中，得裝載有抗癌藥物靶的透明質酸納米微凝膠。所述水溶性抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素。具體方法是將質量比為5:1的生物素化透明質酸和鹽酸阿霉素在水中均勻混合，磁力攪拌逐滴加入中性親和素水溶液，磁力攪拌速度4(T800r/min，中性親和素滴加速度5秒鐘I滴，借助大分子量透明質酸自身構象卷曲控制中性親和素與生物素的結合，實現凝膠結構形態從宏觀到納米微觀的過渡。在納米微凝膠形成過程中，鹽酸阿霉素被透明質酸大分子鎖在納米微凝膠空間網絡結構中。由以下公式計算抗癌藥物的理論載藥量和包封率載藥量(％)=[裝載的抗癌藥物質量/納米微凝膠質量]X 100,包封率(％)=[實際載藥量/理論載藥量]X 100。采用干重比方法測試實際載藥量，采用紫外分光光度法測試實際包封率。從透明質酸(HA)到氨基化透明質酸(HA-ADH)、再到生物素化透明質酸(HA-Biotin)的變化能夠從三者對應的紅外光譜吸收峰位置的變化看出，見圖I所示。從透明質酸(HA)到氨基化透明質酸(HA-ADH)、再到生物素化透明質酸(HA-Biotin)、最后到透明質酸納米微凝膠(HA nanohydroxygel)的反應式如下
權利要求
1.一種裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠，其特征在于，凝膠顆粒粒徑在10(T500nm尺度范圍內，水溶性抗癌藥物被鎖在透明質酸納米微凝膠空間網絡結構中。
2.根據權利要求I所述的裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠，其特征在于，所述水溶性抗癌藥物包括鹽酸阿霉素。
3.一種裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法，其特征在于，首先用酰肼類化合物將透明質酸分子上的羧基轉化成氨基，得氨基化透明質酸；其次用琥珀酰亞胺活化生物素，得活化生物素；第三在I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將活化生物素接枝到氨基化透明質酸分子上，得生物素化透明質酸；第四將水溶性抗癌藥物和中性親和素與生物素化透明質酸溶解在水中，得裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠。
4.根據權利要求3所述的裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法，其特征在于，所述透明質酸為高分子量透明質酸，分子量為1.5 1.8 MDa，所述酰肼類化合物為己二酸二酰肼；獲得氨基化透明質酸的具體方法為己二酸二酰肼和高分子透明質酸的質量比為1:5，己二酸二酰肼的用量為O. I mo I equiv，分別溶于水中，透明質酸的濃度為2. 5 mg/ml，然后將二者各自的水溶液混合，再加入己二酸二酰肼質量的十五分之一的固體I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，室溫攪拌廣4小時，在改性反應過程中用O. Imol/L的鹽酸調節反應溶液的pH值，使其保持在3. 5^4. 7范圍內，得氨基化透明質酸。
5.根據權利要求3所述的裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法，其特征在于，所述琥珀酰亞胺為N-羥基琥珀酰亞胺；獲得活化生物素的具體方法為生物素與N-羥基琥珀酰亞胺等摩爾，與二環己基碳二亞胺一同溶于二甲基甲酰胺溶液中，50°C水浴縮合反應1(Γ20小時；用布氏漏斗濾除不溶性N，N’-二環己基脲(DCU)白色沉淀雜質；在濾液中逐漸加入乙醚進行琥珀酰亞胺活化生物素的沉降，當不再明顯出現琥珀酰亞胺活化生物素白色沉淀物時，將該白色沉淀物放入冰浴中I小時，搖勻，過濾，收集白色沉淀物。將白色沉淀物用5(T60°C的熱異丙醇溶解，再將其置于冰浴中超過3小時至沉降完全，過濾，收集沉降物；用二甲基甲酰胺溶解該沉降物，再加入乙醚并放在冰浴中I小時以上，過濾收集沉降物，再用乙醚提取一次。最后用干燥劑五氧化二磷對過濾收集的沉降物進行干燥處理，得到N-羥基琥珀酰亞胺活化生物素。
6.根據權利要求3所述的裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法，其特征在于，獲得生物素化透明質酸的具體方法是將質量比為22:1的氨基化透明質酸和N-羥基琥珀酰亞胺活化生物素用PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液溶解，室溫下反應24小時，將反應產物用MWCO of 10000透析袋于二次水中透析24小時以上，凍干，得到生物素化透明質酸。
7.根據權利要求3所述的裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠制備方法，其特征在于，所述水溶性抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素；獲得裝載有抗癌藥物靶的透明質酸納米微凝膠具體方法是將質量比為5:1的生物素化透明質酸和鹽酸阿霉素在水中均勻混合，磁力攪拌逐滴加入中性親和素水溶液，磁力攪拌速度4(T800r/min，中性親和素滴加速度5秒鐘I滴，借助大分子量透明質酸自身構象卷曲控制中性親和素與生物素的結合，實現凝膠結構形態從宏觀到納米微觀的過渡。
全文摘要
裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠及其制備方法屬于高分子藥用材料技術領域。現有透明質酸宏觀凝膠作為藥物載體難以順利到達病灶。本發明之裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠的凝膠顆粒粒徑在100~500nm尺度范圍內，水溶性抗癌藥物被鎖在透明質酸納米微凝膠空間網絡結構中。本發明之制備方法首先用酰肼類化合物將透明質酸分子上的羧基轉化成氨基，得氨基化透明質酸；其次用琥珀酰亞胺活化生物素，得活化生物素；第三在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將活化生物素接枝到氨基化透明質酸分子上，得生物素化透明質酸；第四將水溶性抗癌藥物和中性親和素與生物素化透明質酸溶解在水中，得裝載有抗癌藥物的透明質酸納米微凝膠。
文檔編號A61K31/704GK102871951SQ20121033474
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者李艷輝, 崔媛, 段潛, 常晶晶 申請人:長春理工大學