專利名稱：一種預防及治療瘢痕的疫苗及制備方法
技術領域：
本發明涉及ー種疫苗，特別是一種預防及治療瘢痕的疫苗及制備方法，屬于醫藥領域。
背景技術：
白細胞介素10 (IL-10)是多種細胞產生的重要免疫調節細胞因子，具有廣泛的生物學活性，包括免疫抑制、抗炎及免疫調節特性，主要生物學功能是限制和終止炎癥反應，調節多種免疫細胞的分化和増殖。體內外和動物實驗表明IL-10在炎癥、惡變和自身免疫性疾病方面都發揮了重要功能。在臨床上應用于治療急、慢性炎癥疾病、自身免疫性疾病如炎性腸炎、類風濕性關節炎、克隆病、多發性硬化癥、銀屑病等。IL-10作為ー種炎癥反應調節抑制因子，具有①調整炎癥細胞的募集和分化，減 少前炎癥細胞因子的分泌減少胞外基質(ECM)的產生，上調蛋白水解酶(如基質金屬酶)増加ECM的降解；③下調TGF-β I的活性及表達，拮抗瘢痕增生的作用。Renovo公司利用重組hIL-ΙΟ作為治療瘢痕增生，改善瘢痕外觀的候選藥物已進入III期臨床研究，但存在著缺乏對病理部位的特異性、用藥次數多、時間長及純化工藝繁雜等缺點。膠原蛋白過度沉積是瘢痕組織的重要特征，而CBD多肽(TKKTLRT，7肽)是能夠特異結合膠原蛋白的多肽序列。將編碼人hIL-ΙΟ基因、CBD基因與真核表達載體pcDNA3. I (+)在基因水平融合，構建了預防和治療瘢痕的核酸疫苗。經Balb/C小鼠傷ロ愈合模型試驗證實，該疫苗在一定時間內能夠誘導小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD蛋白能夠與傷ロ愈合過程中細胞產生的膠原蛋白特異結合，既可以降低疫苗量及治療成本，又能夠在瘢痕部位有效地發揮藥理作用，從而達到預防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕外觀的療效。
發明內容
本發明的目的是提供一種預防及治療瘢痕的疫苗及制備方法，該疫苗是ー種核酸疫苗，是由編碼人白細胞介素10 (human interlenkin 10，hIL_10)基因、膠原特異結合的多肽CBD基因與真核表達載體pcDNA3. 1(+)在基因水平融合后構成。經Balb/C小鼠傷ロ愈合模型試驗證實，該疫苗在一定時間內能夠誘導小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD蛋白能夠與傷ロ愈合過程中細胞產生的膠原蛋白特異結合，從而阻止了胞外基質的過度沉積而造成的纖維化。該疫苗用于預防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕的外觀的作用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種預防及治療瘢痕的疫苗，其特征是它是由編碼人白細胞介素10基因、膠原特異結合的多肽CBD基因與真核表達載體pcDNA3. I (+)在基因水平融合后構成，其中，編碼人白細胞介素10基因簡稱hIL-ΙΟ基因；融合后的hiL-10-CBD重組基因的核酸序列Nol 5，atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagac c ctccgcacc3’，其中 3’，5’ 分別代表重組核酸鏈的3，，5，端。所述的hIL-ΙΟ基因，其相應的核酸序列No2 5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaag ctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3’其中，3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。所述膠原特異結合的多肽CBD基因，其核酸序列No3 5’ accaagaagaccctccgcacc3’，其中 3’ , 5’ 分別代表核酸鏈的 3’ , 5’ 端。所述的融合后的hIL-10-CBD重組基因在制備用于預防或治療瘢痕的疫苗中的應用。本發明與現有技術相比，本發明通過基因工程手段把人白細胞介素10 (humaninterlenkin 10，hIL-10)與膠原特異結合的CBD多肽在基因水平融合與真核表達載體pcDNA3. I (+)在基因水平融合后組成。經Balb/C傷ロ愈合模型試驗證實，該疫苗在一定時間內能夠持續誘導小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD能夠與傷ロ愈合過程中產生的膠原特異結合，既可以降低疫苗的用量、減少毒副作用，同時更為重要的是該疫苗能夠特異地在瘢痕部位發揮藥理作用，最大程度地預防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕的外觀。
下面結合實施例及附圖對本發明作進ー步詳細說明，但不作為對本發明的限定圖I是愈合切ロ及愈合組織中膠原分布(A-C為疫苗治療組；D_F為空白對照組；箭頭示意創緣大小)。
具體實施例方式本發明通過基因工程手段把人白細胞介素10 (human interlenkin 10, hIL-10)基因與膠原特異結合多肽CBD在基因水平融合后的重組基因hIL-10-CBD核酸序列。所述的hIL-ΙΟ基因，其相應的核酸序列No2 5，atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactt
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gaaac3’其中，3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。所述膠原蛋白特異結合多肽CBD (TKKTLRT，7肽)，其核酸序列No3 5’ accaagaagaccctccgcacc3’，其中 3’，5’ 分別代表核酸鏈的 3’，5’ 端。融合后的hIL-10-CBD重組基因的核酸序列Nol 5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagacc ctccgcacc3’其中，3’，5’分別代表重組核酸鏈的3’，5’端。所述的融合后的hIL-10-CBD重組基因真核表達載體在制備用于預防或治療瘢痕疫苗中的應用。實施例I :hIL-10_CBD重組基因的獲得(一)hIL-10cDNA 的獲得I.總RNA的提取人外周血經淋巴細胞分離液分離單個核細胞，PBS洗滌2次，重懸于10%RPMI 1640培養液，加入終濃度為10g/l的ConA，置5%C02培養箱，37°C培養48h，收集細胞。參照RNA抽提試劑盒的方法，抽提總RNA，_80°C保存備用。2.總RNA的提取及hIL-10cDNA的擴增用Takara公司RNA提取及反轉試劑盒，按說明抽提總RNA，進行RT-PCR反應 總RNA 500ng，5X 逆轉錄Buffer2y l，oligo dT O. 5 μ l,6mer O. 5 μ 1，AMV 逆轉錄酶 O. 5 μ 1，DEPC 水加至 10 μ I。37°C溫育 30min，后 85°C溫育 3min，得 cDNA。(ニ)載體的構建及鑒定I. pMD18-T克隆載體的構建按真核細胞慣用密碼子設計含CBD基因序列、相應的酶切位點(Nhel/EcoRI)以及linker (G4S)的堿基序列,合成如下2條引物Pf、Pr。所述膠原蛋白特異結合多肽CBD (TKKTLRT，7肽)，其核酸序列No3 5’ accaagaagaccctccgcaccj’ ；引入的linker(G4S)核酸序列 No4 5' ggtggtggtggtagc3> ；Pf :5’ gctagcatgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcac3’ (77mer, 5’ -3’ )Pr:5 ’ gaattctcaggtgcggagggtcttcttggtgctaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtc3，(64mer, 5’ -3，)以Pf、Pr 為引物，以 cDNA 為模板，隨之按 95°C 30s，58°C 30s，72°C lmin，30 個循環后72°C進行延伸12min，得到PCR產物，產物回收連入pMD18_T載體，進行酶切鑒定和序列測定，得到pMD18T-hIL10-CBD重組克隆載體。2. pcDNA-hIL10-CBD真核表達載體的構建測序正確的pMD18T-IL10-CBD重組克隆載體及原核pcDNA3. I (+)表達載體，分別經Nhel/EcoRI雙酶切，回收目的片段進行連接，連接產物轉化DH5 α，挑取克隆，同樣回收質粒，酶切鑒定，進ー步經核酸測序鑒定，構建成pcDNA-hIL10-CBD真核表達載體，即本專利所述的核酸疫苗。 實施例2 :核酸疫苗的制備及質量標準控制(一)疫苗的制備I.疫苗的擴增上述pcDNA-hIL10_CBD/DH5 α菌接種于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C振蕩培養7-8h，次日以2%的接種量接種到同樣的培養基中，繼續在37°C過夜培養。2.疫苗的制備按照北京康為生物技術有限公司生產的“金牌超量無內毒素質粒大提試劑盒”使用說明操作。制備提取無內毒素的質粒ー即核酸疫苗，具體操作步驟如下①取150ml過夜培養的菌液，加入離心管中，IOOOOrpm離心2_3min收集細菌，盡量吸棄全部上清。②向菌體沉淀的離心管中加入12ml Buffer Pl使用移液器或振蕩器充分混勻，懸浮細菌沉淀。③向離心管中加入12ml Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻6_8次，使菌體充分裂解，室溫放置3-5min。此時溶液應變得清亮粘稠。④向離心管中加入12ml Buffer E3，立即上下顛倒混勻6_8次，此時出現白色絮狀沉淀，室溫放置5min。IOOOOrpm離心lOmin。將上清全部倒入除內毒素過濾器中，濾液收集在潔凈的50ml離心管中。⑤向濾液中加入Ilml異丙醇，上下顛倒混勻。將混合液轉移到平衡好的吸附柱中(向已裝入收集管中的吸附柱加入2ml Buffer PS, IOOOOrpm離心2min即可)。6000-10000rpm離心2min,棄收集管中的廢液。⑥向吸附柱中加入IOml Buffer PW, 6000-10000rpm離心2min,棄收集管中的廢
液，重復操作I次。⑦將吸附柱重新放回收集管中，IOOOOrpm離心5min，棄廢液，將吸附柱置于室溫干燥IOmin。⑧將吸附柱置于ー個新的收集管中，向吸附膜的中間部位加入l-3mlEndo_freeBufer EB,室溫放置2_5min, IOOOOrpm離心5min,將質粒溶液收集到收集管中。(ニ)制備疫苗的質量控制I.疫苗的純度及含量測定
取純化好的疫苗溶液5 μ 1，加入95 μ I純水(即按20倍稀釋)。應用DU800Nucleicacid/Protein analyzer,利用軟件中的程序測定分析稀釋樣品中疫苗DNA在波長260nm、280nm、320nm的OD值，分析測定出稀釋樣品中疫苗DNA的純度(260nm/280nm)及濃度含量，并計算出所制備疫苗的濃度(μ g/ml)。2.疫苗的質量標準樣品中疫苗溶液的濃度應彡500μ g/ml,260nm/280nm的比值在I. 8左右。實施例3 Balb/C小鼠傷ロ愈合模型的建立(一)Balb/C小鼠傷ロ愈合模型的建立
I. Balb/C小鼠的預處理及第一次疫苗的注射7周齡，18只Balb/C雄性小鼠，利用電推剪及強效脫毛膏去除背部軟毛，均分為3組。在小鼠背部正中用印度墨水畫出O. 4cmXlcm長方形區域。24h后沿區域兩側皮下分別注射①空白對照組注射50 μ I體積的生理鹽水；②陰性對照組注射50 μ g/50 μ I (用生理鹽水稀釋制備的空載體PCDNA3. I (+))的PCDNA3. I (+)空載體實驗組注射50 μ g/50 μ I(用生理鹽水稀釋制備的核酸疫苗pcDNA3. l-hIL10-CBD)的核酸疫苗。2.小鼠傷ロ的制備及再次疫苗的注射24h后，全層切除小鼠背部畫出的O. 4cmX Icm區域，傷ロ暫時應用無菌油紗包扎。三天后打開包扎傷ロ的油紗，露出創面，同上再次分別注射相同劑量的生理鹽水、空載體及疫苗。分別于7，14，21，28d采集傷ロ處組織及血清樣品。(ニ)小鼠傷ロ愈合過程中hIL-ΙΟ的測定血清樣品應用新博盛生物技術有限公司“人IL-10 ELISA試劑盒”說明書測定。測定后IL-10標準品的標準曲線方程為y=42. 04χ-5. 23 (r = O. 9863)，按說明書測定樣品的OD45tol值，井根據曲線方程計算出核酸疫苗的濃度，如表I所示。表I疫苗治療后小鼠血清中hIL-ΙΟ的產生及變化(ng/ml)
權利要求
1.一種預防及治療瘢痕的疫苗，其特征是它是由編碼人白細胞介素10基因、膠原特異結合的多肽CBD基因與真核表達載體PCDNA3. 1(+)在基因水平融合后構成，其中，編碼人白細胞介素10基因簡稱hIL-ΙΟ基因；融合后的hIL-10-CBD重組基因的核酸序列Nol 5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagacc ctccgcacc3’，其中 3’，5’ 分別代表重組核酸鏈的 3’，5’端。
2.根據權利要求I所述的ー種預防及治療瘢痕的疫苗，其特征是所述的hIL-ΙΟ基因，其相應的核酸序列No2:5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3， 其中，3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。
3.根據權利要求I所述的ー種預防及治療瘢痕的疫苗，其特征是所述膠原特異結合的多肽CBD基因，其核酸序列No3 :5’ accaagaagaccctccgcacc3’，其中3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。
4.根據權利要求I所述的ー種預防及治療瘢痕的疫苗，其特征是所述的融合后的hIL-10-CBD重組基因在制備用于預防或治療瘢痕疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種預防及治療瘢痕的疫苗及制備方法，該疫苗由編碼人白細胞介素10(human interlenkin 10,hIL-10)基因、膠原特異結合的多肽CBD基因與真核表達載體pcDNA3.1(+)在基因水平融合后構成。經Balb/C小鼠傷口愈合模型試驗證實，該疫苗在一定時間內能夠持續誘導小鼠合成分泌hIL-10-CBD。分泌的hIL-10-CBD蛋白能夠與傷口愈合過程中細胞產生的膠原蛋白特異結合，既可以降低疫苗量、毒副作用及治療成本，又能夠在瘢痕部位特異有效地發揮藥理作用，從而阻止了胞外基質的過度沉積而造成的纖維化，達到了預防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕外觀的療效。本發明通過基因工程手段把人白細胞介素10(human interlenkin 10，hIL-10)與膠原特異結合的CBD多肽在基因水平融合與真核表達載體pcDNA3.1(+)在基因水平融合后組成。
文檔編號A61P17/02GK102836424SQ201210361718
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者胡大海, 石繼紅, 朱雄翔, 韓軍濤, 胡曉龍, 方小兵, 白曉智, 蔡維霞, 湯朝武 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學