專利名稱：一種小核酸分子快遞技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是指ー種小核酸分子快遞技木。
背景技術：
基因治療是ー種近年來發展起來的新型治療技木。由于基因治療的靶點明確，該技術在治療重大疾病(如惡性腫瘤，糖尿病，病毒性肝炎等)方面顯示出專一、高效的優勢，近年來發展起來的小RNA干擾技術為基因治療又提供了ー種新的技術方法，基因治療技術從實驗室研究走向臨床應用的技術瓶頸之ー是核酸的導入技術，核酸的轉移效率對于矯正在許多疾病中涉及的核酸表達的缺乏和過量是必要的，核酸轉移還可以用于研究基因的表達調控和功能評估和鑒定，以及干細胞的自我更新和定向分化的分子基礎的解析和應用，如今，人們提出了許多方法來進行此類遺傳信息的細胞內釋放，大體上可以分為病毒載體介導的和非病毒介導的核酸導入技術這兩大類，盡管病毒載體在外源核酸的導入效率方面有著顯著的成效，但是由于它們常常具有免疫源性，細胞毒性和生物危險性，尤其是臨床研究中出現的腺病毒載體導致的癌癥，病毒載體的這種長期毒性對通過病毒載體轉導核酸藥物的臨床治療產生了相當大的負面影響。另外ー類的核酸轉染技術是使用化學的或生化的載體。這些合成的載體具有兩個主要功能與要轉染的核酸復合和促進其穩定性增加以及促進它穿過原生質膜。在開發的合成載體中聚賴氨酸類的陽離子聚合物和DEAE葡聚糖或脂轉染劑，聚こ烯亞胺轉染劑都是被廣泛使用的。不同的合成多聚體導入核酸藥物的作用機制細節各不相同，但它們也存在著ー些共同特點，這些特點是基于核酸分子本身帶負電，而細胞膜本身也帶負電，核酸分子被導入到細胞內的過程中必須克服核酸分子與細胞表面的負電荷產生的靜電斥力，所以目前已經廣泛用于實驗室研究的各種核酸轉染劑都富含陽離子基團以中和核酸以及細胞表面的負電荷，最簡單的轉染劑就是磷酸I丐，其它的如陽離子脂質體，陽離子聚合-L-賴氨酸以及聚こ烯亞胺等，然而由于上述有機聚合物的細胞毒性，轉染劑造成的核酸藥物的脫靶效應，限制了它們在基因治療中的廣泛應用，同時上述轉染劑的轉染效率不夠高也限制了它們在基因治療中的廣泛使用，基因治療的藥物導入技術仍然是當前的技術瓶頸，尋找新的高效低毒以及組織專ー的核酸轉染方法仍然是當前的ー個非常重要的課題。
發明內容
本發明提出小核酸分子快遞技術，解決了現有技術中基因治療的藥物導入技術瓶頸的問題。本發明的技術方案是這樣實現的ー種小核酸分子快遞技術，利用多肽類轉染劑將堿基數為10 100的小分子核酸/脫氧核酸或經過化學修飾的小分子核酸轉染進入細胞。作為優選的技術方案，所述多肽類轉染劑與堿基數為10 100的單鏈或雙鏈的小RNA/DNA或經過化學修飾的單鏈或雙鏈的小RNA/DNA的質量比只為0. 02 200g多肽/g核酸。作為優選的技術方案，所述多肽類轉染劑包括10 50個氨基酸殘基；所述多肽類轉染劑的轉染多肽含有帶正電荷的氨基酸，所述正電荷氨基酸數目占多肽氨基酸數目的20% 80% ;所述連續分布的數目為4 20 ;所述正電荷氨基酸如賴氨酸、精氨酸；這些帶陽性電荷的氨酸序列的作用被認為是和核酸分子通過靜電作用形成復合物的結構單元，如多肽-核酸復合物在精氨酸的正電荷作用下與細胞表面的負電荷作用，指導多肽/核酸復合物在細胞的表面結合形成復合物；所述多肽類轉染劑的轉染多肽為如下的9組多肽的序列中的ー種或任意幾種多肽1:R2GSTDR1KRRRRRR3RRRR ；多肽2 AR3QAIR1 IR2FQNKKRKKRKKK ；多肽3 RRRRRRRSPLMVR1GGR2GGLK ；多肽4 :R2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽5 :ACSRlSPSR2HCGRRRRRRR ；多肽6 AWGSR2GWSPKYIRRRRRR ；
多肽7 PPLSSSTTGGGY2GGGY1HRRRKRKRRRK ；多肽8 :RRRRRRRGAR2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽9 AGY2LMSTLY1RRRRRKRKR ;其中Rl，R2，R3為20個天然氨基酸或其D-型氨
基酸中的任何ー個，D-型氨基酸取代天然氨基酸的好處是所得多肽對蛋白水解酶的耐受能力更強。作為優選的技術方案，所述氨基酸殘基為D型氨基酸和經過化學修飾的氨基酸；其中，所述化學修飾包括N-端修飾、C-端修飾以及側鏈修飾。作為優選的技術方案，所述修飾劑為膽固醇、膽固烷醇、植物固醇、植物固烷醇、熒光分子標記、PEG或PEI。多肽的其它部分主要由非電荷氨基酸組成，提高多肽對細胞膜的穿透能力。疏水區域中増加疏水性氨基酸，尤其是色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸有助于提高多肽對核酸分子的轉染能力。多個連續的非電荷氨基酸區域，如多個絲氨酸的存在也有助于提高多肽對核酸的轉染能力；一些多肽中具有細胞膜受體的配體序列如；RGS序列有助于多肽和細胞膜上的整合素V III結合，有助于提高核酸復合物在富含整合素V III的細胞，如HeLa細胞中的轉染效率，在一段連續的帶陽性電荷的氨基酸(如精氨酸和賴氨酸)序列的第2或/和第3位將帶陽性電荷的氨基酸置換為絲氨酸可使復合物進入細胞漿后易于釋放核酸分子，從而使得核酸分子能夠尋找其作用位點，發揮其生物功能，此外，由于細胞內含有蛋白酶，蛋白酶對多肽的水解作用能夠進ー步幫助核酸分子從多肽-核酸分子復合物中的釋放，為了保證合成的多肽具有良好的水溶性，在多肽的非正電荷氨基酸區域內也適當設計少量的帶電荷氨基酸。多肽的修飾還包括PEG修飾，類固醇類修飾，硬脂酸基，月桂酸基，聚こ烯亞胺修飾，甜菜堿修飾。修飾的位置包括除賴氨酸/精氨酸簇之外的任何部位，包括N-端修飾，C-端修飾,巰基修飾等。這種多肽類轉染劑可用于小RNA/DNA的細胞導入，從而可于臨床的基因治療和細胞治療。
表I列出了符合本發明保護權項的具有核酸轉染功能的小肽的序列。這些序列僅僅是為了便于說明本發明的具有高效轉染核酸分子的多肽轉染劑的結構特點，而不僅僅局限于表I所列舉的多肽，如改變陽性氨基酸的數目和排列組合可形成數千計的序列
權利要求
1.一種小核酸分子快遞技術，其特征在于利用多肽類轉染劑將堿基數為10 100的小分子核酸/脫氧核酸或經過化學修飾的小分子核酸轉染進入細胞。
2.如權利要求1所述的一種小核酸分子快遞技術，其特征在于所述多肽類轉染劑與堿基數為10 100的單鏈或雙鏈小分子RNA/DNA或經過化學修飾的單鏈或雙鏈小分子RNA/DNA的質量比只為O. 02 200g多肽/g核酸。
3.如權利要求1所述的一種小核酸分子快遞技術，其特征在于所述多肽類轉染劑包括10 50個氨基酸殘基；所述多肽類轉染劑的轉染多肽含有帶正電荷的氨基酸，所述正電荷氨基酸數目占多肽氨基酸數目的20 % 80 %;所述正電荷氨基酸連續分布的數目為4 20 ；所述多肽類轉染劑的轉染多肽為如下的9組多肽的序列中的一種或任意幾種多肽1:R2GSTDR1KRRRRRR3RRRR ；多肽 2 AR3QAIR1 IR2FQNKKRKKRKKK ；多肽 3 RRRRRRRSPLMVR1GGR2GGLK ；多肽 4 :R2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽 5 :ACSRlSPSR2HCGRRRRRRR ；多肽 6 AWGSR2GWSPKYIRRRRRR ；多肽 7 PPLSSSTTGGGY2GGGY1HRRRKRKRRRK ；多肽 8 :RRRRRRRGAR2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽9 AGY2LMSTLY1RRRRRKRKR ;其中Rl，R2，R3為20個天然氨基酸或其D-型氨基酸中的任何一個。
4.如權利要求3所述的一種小核酸分子快遞技術，其特征在于所述氨基酸殘基為D型氨基酸和經過化學修飾的氨基酸；其中，所述化學修飾包括N-端修飾、C-端修飾以及側鏈修飾。
5.如權利要求4所述的一種小核酸分子快遞技術，其特征在于所述修飾劑為膽固醇、膽固烷醇、植物固醇、植物固烷醇、熒光分子標記、PEG或PEI。
全文摘要
本發明提出了一種小核酸分子快遞技術，利用多肽類轉染劑將堿基數為10～100的單鏈或雙鏈小分子核酸或脫氧核酸轉染進入細胞，可以有效將小分子核酸或經過化學修飾的小分子核酸轉染進入懸浮的和貼壁的細胞，解決了現有技術中基因治療藥物導入技術瓶頸的問題。
文檔編號A61K48/00GK103031337SQ20121036744
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者殷勤偉, 黃兵 申請人:北京吉利奧生物科技發展有限公司