新siRNA結構的制作方法
【專利摘要】本發明涉及具有新序列和結構基序的siRNA化合物，所述siRNA化合物下調特定人類基因的表達。本發明還涉及包含此類化合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。本發明還提供了治療和/或預防與所述基因相關的各種疾病或病癥和/或與此類疾病或病癥相關的癥狀的發病率或嚴重程度的方法，所述方法包括給需要治療此類疾病或病癥和/或癥狀的受試者施用治療有效劑量的該化合物或所述藥物組合物從而治療受試者。
【專利說明】新siRNA結構
[0001]本申請是申請日為2008年9月4日，申請號為200880110087.0，發明名稱為“新siRNA結構”的申請的分案申請。
[0002]貫穿本申請引用了各種專利和科學出版物。這些出版物的公開內容以其整體在此通過引用并入本申請，以更完整地描述本發明所屬領域的現有技術。
發明領域
[0003]本發明涉及新化合物、包含該化合物的藥物組合物以及使用其抑制某些哺乳動物基因包括 TP53BP2、LRDD, CYBA, CASP2、N0X3、HRK、RACl、RHOA 和 DUOXl 的方法。所述化合物和組合物因此在治療其中基因表達具有不良后果的疾病或病癥和/或與該疾病或病癥相關的癥狀的受試者時是有用的。在具體實施方案中，本發明提供包含該化合物的組合物及其使用方法。本發明還提供在制備化學修飾的siRNA寡核苷酸中有用的新結構基序、包含它的組合物及其使用方法。
[0004]發明背景
[0005]siRNA 和 RNA 干擾
[0006]RNA干擾(RNAi)是涉及雙鏈(ds) RNA-依賴的基因特異性轉錄后沉默的現象。由于存在響應于長鏈dsRNA分子激活的主動的、非特異性抗病毒防御機制，研究該現象和實驗性操作哺乳動物細胞的最初嘗試均以失敗告終(Gil等人ApOptOSiS，2000.5:107-114)。隨后發現21個核苷酸RNA的合成雙鏈體可在哺乳動物細胞中介導基因特異性RNAi，而不刺激通用抗病毒防御機制。(參見Elbashir等人Nature 2001,411:494-498和Caplen等人PNAS USA 2001,98:9742-9747)。因此，小干擾RNA (siRNA)已成為嘗試理解基因功能的有力工具。
[0007]RNA干擾(RNAi)在哺乳動物中是由小干擾RNA(siRNA) (Fire等人Nature 1998，391:806)或微小 RNA(miRNA)(Ambros, Nature 2004,431(7006):350-355 ；Bartel, Cell2004,116(2):281-97)介導的。在植物中相應的過程通常稱為特異性轉錄后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并在真菌中也可稱為壓抑(quelling)。
[0008]siRNA是下調或沉默(阻止)其內源性(細胞內)對應物(counterpart)的基因/mRNA表達的雙鏈RNA或修飾的RNA分子。RNA干擾的機制在下文詳述。
[0009]若干研究顯示siRNA療法在哺乳動物和人類二者中都是有效的。Bitko等人表明當鼻內施用時，針對呼吸道合胞病毒(RSV)核殼體N基因的特異性siRNA分子有效治療小鼠(Nat.Med.2005，11 (1):50-55)。討論siRNA療法的近期綜述是可獲得的(Barik等人 J.Mol.Med 2005，83:764-773 ;Dallas 和 Vlassov，Med.Sc1.Monitor 2006,12(4):RA67-74 ；Chakraborty, Current Drug Targets 2007,8(3):469-82 ;Dykxhoorn 等人 GeneTherapy 2006.13:541-552)。
[0010]Mucke(IDrugs 200710 (I):37-41)發表了目前療法用于治療眼部疾病例如年齡相關性黃斑變性(AMD)和青光眼的綜述，包括針對各種靶的siRNA。
[0011] SiRNA 結構[0012]與已知基因對應的siRNA的選擇和合成已經被廣泛報道；(參見例如U1-Tei等人 J Biomed Biotech.2006 ；2006:65052 ；Chalk 等人 BBRC.2004，319 (I):264-74 ；Sioud和 Leirdal，Met.Mol Biol.;2004，252:457-69 ;Levenkova 等人 Bioinform.2004，20 (3):430-2 ；U1-Tei 等人 NAR.2004，32 (3):936-48)。
[0013]修飾的siRNA的利用和制備的實例，參考例如，Braasch等人Biochem.2003，42(26):7967-75, Chiu 等人 RNA,2003,9(9):1034-48 ；PCT 公布 W02004/015107(atugenAG)和WO 02/44321 (Tuschl等人)。美國專利號5，898，031和6，107，094，教導了化學合成低聚物。美國專利公布號2005/0080246和2005/0042647分別涉及具有交替基序的低聚化合物和具有化學修飾的核苷間鍵合的dsRNA化合物。
[0014]其他修飾已經公開。結果表明5'-磷酸部分的并入增強siRNA在果蠅胚胎中的活性(Boutla 等人 Curr.Biol.2001，11:1776-1780)和是人類 HeLa 細胞中 siRNA 功能所必需的(Schwarz 等人 Mol.Cell，2002，10:537-48)。Amarzguioui 等人(NAR，2003，31 (2):589-95)顯示siRNA活性取決于Y -O-甲基修飾的位置。Holen等人(NAR.2003,31 (9):2401-07)報道了具有少數2' -O-甲基修飾核苷的siRNA與野生型相比產生高活性，但隨著2' -O-甲基修飾的核苷數量的增加其活性降低。Chiu和Rana(RNA.2003,9 =1034-48)教導了相對于未修飾的siRNA，在有義鏈或反義鏈(完全修飾鏈)中并入2' -O-甲基修飾核苷的siRNA活性嚴重降低。據報道在反義鏈5'-末端放置2' -O甲基將嚴重限制其活性，而在反義鏈3'-末端和有義鏈的兩個末端的放置則是耐受的(Czauderna等人NAR.2003，31 (11):2705-16 ;W02004/015107)。本發明提供的分子的優勢在于其無毒性和可用于制備用于治療各種疾病的藥物組合物。
[0015]促凋亡某閔
[0016]促凋亡基因通 常定義為在凋亡性細胞死亡中起作用的基因。本發明中有用的促凋亡基因的非限制性列表如下:腫瘤蛋白P53結合蛋白2(TP53BP2);含有富含亮氨酸重復序列和死亡結構域(leucine-rich repeats and death domain containing, LRDD);細胞色素b-245，α多肽(CYBA，p22phoX);激活轉錄因子3 (ATF3);半胱天冬酶2，凋亡相關半胱氨酸肽酶(CASP2) ;NADPH 氧化酶 3 (N0X3) ；harakiri, BCL2 相互作用蛋白(HRK, BID3);補體成分l，q子成分結合蛋白(ClQBP) ;BCL2/腺病毒ElB 19kDa相互作用蛋白3 (BNIP3);絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8，JNKI);絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14，p38) ；ras相關C3肉毒桿菌毒素底物I (Rho家族小GTP結合蛋白RAC1);糖原合酶激酶3 β (GSK3B);嘌呤能受體Ρ2Χ，配體門控離子通道7(P2RX7);瞬時受體電位陽離子通道，亞家族M，成員2 (TRPM2);聚(ADP-核糖)糖原水解酶(poly (ADP-ribose) glycohydrolase, PARG) ;CD38 分子(CD38)；STEAP家族成員4(STEAP4);骨形態發生蛋白2 (BMP2);間隙連接蛋白，al，43kDa(連接蛋白43，GJA1) ;TYR0蛋白酪氨酸激酶結合蛋白(TYROBP);結締組織生長因子(CTGF);分泌磷蛋白I (骨橋蛋白，SPP1) ；ras同源物基因家族，成員A(RHOA)和雙氧化酶I (DU0X1)。
[0017]轉讓給本發明受讓人的PCT專利申請號PCT/IL2007/001278 (PCT公布號WO2008/050329)和美國序列號11/978,089涉及上述基因的抑制劑，并通過引用以其整體并入。
[0018]聽力損失
_9] 化學誘導的耳毒性[0020]各種治療藥物對聽細胞和螺旋神經節神經元的耳毒性效應經常是限制它們治療有用性的因素。常用的耳毒性藥物包括廣泛使用的化療藥物順鉬及其類似物、氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、奎寧及其類似物、水楊酸及其類似物和環利尿劑(loop-diuretics)。
[0021]例如，已知抗細菌氨基糖苷類如慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布拉霉素等有嚴重的毒性副作用，特別是耳毒性和腎毒性，這降低了它們作為治療劑的價值(參見Goodman和 Gilman 的 The Pharmacological Basis of Therapeutics (治療劑的藥理學基礎)，第6 版，A.Goodman Gilman 等人編輯；Macmillan Publishing C0.，Inc., 1980.New York,第1169-71頁)。因此，耳毒性是公認的抗生素施用的劑量限制性副作用。研究表明，每天接受I克超過I周后，4-15%患者發展可測量的聽力損失，如果繼續治療，則逐漸惡化并可能導致永久性耳聾。
[0022]耳毒性也是順鉬的嚴重的劑量限制性副作用，順鉬是已證明對各種人類癌癥包括睪丸癌、卵巢癌、膀胱癌、頭頸癌有效的鉬配合物。已顯示順鉬I Pkttindκ )損害聽覺系統和前庭系統。水楊酸類，例如阿斯匹林，由于其抗炎、鎮痛、解熱和抗血栓效應而成為最常用的治療藥物。不幸的是，它們也有耳毒性的副作用，并可導致耳鳴(“耳中鳴響”)和暫時性聽力損失。此外，如果長期高劑量使用該藥物，可出現慢性的和不可逆轉的聽力損傷。
[0023]不限于理論，順鉬藥物和其他潛在的耳毒性藥物通過內耳組織中細胞凋亡誘導耳毒性效應，尤其是內耳毛細胞(Zhang等人Neuroscience 2003,120(1): 191-205 ;Wang等人2003，J.Neuroscience, 23 (24):8596-8607)。長期高劑量使用耳毒性藥物會導致持久性和不可逆轉的聽力損傷。哺乳動物的聽毛細胞的只在胚胎發育時產生并如果在出生后損失則不可再生。因此，毛細胞的損失將導致完全的和不可逆轉的耳聾。
[0024]不幸的是，目前沒有有效治療耳蝸使耳聾好轉的療法。因此，防止聽毛細胞死亡的有效治療會有很大的治療價值。轉讓給本發明 申請人:的美國序列號11/655，610涉及治療受試者聽力損傷的方法，所述方法包括給受試者施用包含有效量P53多核苷酸抑制劑和任選地促凋亡基因抑制劑的組合物。
[0025]老年件耳聾
[0026]另一種類型的聽力損失是老年性耳聾，它是老年人逐漸發生的聽力損失。約30-35 %年齡介于65-75歲之間的成年人和40-50 %年齡在75歲和以上的人經歷聽力損失。因此，存在對預防、降低或治療牽涉內耳組織特別是內耳毛細胞的內耳疾患和聽力損傷的發病率和/或嚴重程度的措施的需要。
[0027]聲損傷
[0028]聲損傷是長期暴露于高噪音所導致的聽力損失類型。不希望限于理論，暴露于高噪音導致耳蝸上的毛細胞敏感性降低。對于更加嚴重的暴露，損傷可從相鄰支持細胞的損失發展到柯替器(organ of Corti)的完全破壞。感覺細胞死亡可導致漸進性沃勒變性(ffallerian degeneration)和初級聽神經纖維的損失。
[0029]因此，存在對預防、降低或治療化學毒性導致的疾病或疾患包括內耳疾患及聽力損傷、腎損害(腎毒性)和神經損傷(神經毒性)的發病率和/或嚴重程度的措施的需要。
[0030]急性腎功能衰竭
[0031]急性腎功能衰竭(ARF)是特征為在數天內發生腎功能的快速惡化的臨床綜合征。ARF的主要特征是腎小球濾過率(GFR)突然下降，導致含氮廢物(尿素、肌酐)滯留。在世界范圍內，每年每I百萬人中約170-200人發生嚴重的ARF。現今，還沒有對確定的ARF的特異療法。已發現一些藥物在動物模型中改善毒性和缺血性實驗性ARF，如降低的血清肌酐水平，減少的組織學損害和更快恢復腎功能所表現的。這些藥物包括抗氧化劑、鈣通道阻滯劑、利尿劑、血管活性物質、生長因子、抗炎劑等。然而，當這些藥物進行臨床試驗時則表現出沒有益處，并且未批準其對治療ARF有用。
[0032]大多數住院的ARF患者中，ARF是由急性腎小管壞死(ATN)引起的，性腎小管壞死由缺血和/或腎毒性損害引起。腎灌注不足是由低血容量休克、心源性休克和感染性休克，由施用血管收縮藥物或腎損傷造成的。腎毒素包括外源性毒素如造影劑和氨基糖苷類以及內源性毒素如肌紅蛋白。最近的研究表明，腎組織細胞凋亡在大多數人類ARF病例中是突出的。凋亡性細胞死亡的主要位點是遠端腎單位。在缺血性損傷的初始階段，肌動蛋白細胞骨架的完整性喪失導致上皮扁平，和刷狀緣喪失，焦點細胞接觸喪失，以及隨后細胞從深層基底脫離。已經建議，凋亡性腎小管細胞死亡可能比壞死性細胞死亡更多地預測功能變化(Komarov 等人 1999, Science.285(5434): 1733-7 ；Supavekin 等人 2003, KidneyInt.63(5):1714-24)。綜上所述，目前還沒有預防和/或治療急性腎功能衰竭的理想治療模式，而且顯然需要為此研發新化合物。
[0033]腎移棺
[0034]移棺物功能延識.[0035]移植物功能延遲(Delayed graft function, DGF)是腎移植中手術后早期最常見的并發癥，并且導致不理想的移植結果(Moreso等人N印hiOl.Dial.Transplant.1999.14(4):930-35)。雖然移植物功能延遲的發生率和定義在移植中心之間不同，但結果是不變的并包括延長的住院、其他侵入性程序以及對患者和醫療保健系統的額外成本。
[0036]急性移植排斥反應
[0037]急性移植排斥反應可分為三類，取決于移植物破壞(graft destruction)的發作。超急性排斥是應用于極早期移植物破壞通常在最初的48小時內的術語。急性排斥反應在移植后幾天到幾個月或甚至幾年發作，并可涉及體液和/或細胞的機制。慢性排斥反應與慢性同種異體免疫反應有關。
[0038]青光眼
[0039]青光眼是世界上引起失明的主要原因之一。它影響了全世界大約6680萬人。每年至少有12，000美國人因這種疾病所致盲(Kahn和Mi I ton，Am J Epidemiol.1980，111 (6):769-76)。青光眼的特征是視神經頭部的軸突變性，主要是由于升高的眼壓(IOP)。原發性開角型青光眼(POAG)是青光眼最常見的形式之一，由于小梁網(TM)中房水外流的阻力增加，造成IOP升高和最終的視神經損傷。Mucke (IDrugs 2007,10(1):37-41)綜述了目前的療法，包括用于治療眼部疾病例如年齡相關性黃斑變性(AMD)和青光眼的針對各種靶的SiRNA0
[0040]急件呼吸窘迫綜合征
[0041]急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，也稱為呼吸窘迫綜合征(RDS)或成人呼吸窘迫綜合征(相對于嬰兒呼吸窘迫綜合征，IRDS)是對各種形式肺損傷的嚴重反應。其為造成增加通透性的肺水腫的最嚴重的疾患。[0042]ARDS是各種直接和間接損害引起的嚴重肺部疾病。其特征是肺實質炎癥，該肺實質炎癥導致氣體交換受損與伴隨的炎癥介質的全身釋放，所述炎癥介質引起炎癥、缺氧，并經常導致多器官功能衰竭。這種情況會危及生命而且往往致命的，通常需要機械通氣并進入加護病房。急性呼吸窘迫綜合征不太嚴重的形式稱為急性肺損傷(ALI)。
[0043]器官移植后缺血再灌注損傷
[0044]缺血再灌注損傷(IRI)是器官同種異體移植物接受者死亡的主要原因之一。重大IRI發生在從死亡捐贈者的每個器官移植病例和在從活體捐贈者的一些器官移植病例。它導致急性排斥反應增加和長期同種異體移植功能損害。肺移植是終末期肺部疾病病人的唯一最終治療(definitive therapy),在所有固體同種異體移植接受者中存活率差。
[0045]急性肺移植排斥反應
[0046]急性同種異體移植排斥反應仍然是肺移植中嚴重的問題，盡管免疫抑制藥物有所進展。缺血再灌注(I/R)損傷和缺氧損傷可造成排斥反應和最終早期發病和死亡。
[0047]脊髓損傷
[0048]脊髓損傷，是導致感覺和/或運動喪失的脊髓障礙，也稱為脊髓病。兩種最常見的類型是創傷引起的脊髓損傷和疾病引起的脊髓損傷。創傷常常是由車禍、跌倒、槍擊、潛水事故等引起的。可影響脊髓的疾病包括脊髓灰質炎、脊柱裂、腫瘤、弗里德賴希共濟失調(Friedreich， s ataxia)。
[0049]壓瘡
[0050]壓瘡(Pressure sore)，通常稱為褥瘡或壓迫性潰瘍，為損壞的皮膚和組織部位。隨著長期受壓，可發展組織缺血，造成間質組織中代謝廢物的積累，造成缺氧和細胞死亡。這種壓力引起的缺血還導致過度組織缺氧，進一步促使細菌繁殖和組織破壞。
[0051]年齡相關性黃斑變性
[0052]超過65歲的美國人中最佳矯正視力下降的最常見的原因是稱為年齡相關性黃斑變性(AMD)的視網膜疾患。受AMD影響的眼部區域是黃斑區，為視網膜中心的一個小區域，主要是感光細胞組成。隨著AMD的進展，該病的特征是尖銳的中央視力的喪失。所謂的“干性” AMD占AMD患者的約85-90%并涉及由于細胞的整體萎縮所致的眼色素分布改變、光感受器損失和視網膜功能減弱。“濕性”AMD涉及異常脈絡膜血管增殖導致視網膜下空間形成凝塊或傷痕。因此，“濕性”AMD的發作是由于神經視網膜下方異常脈絡膜新生血管網絡的形成(脈絡膜新生血管形成，CNV)。新形成的血管過度泄漏，導致視網膜下積液和血液積聚導致視敏度損失。最終，隨著包括脈絡膜和視網膜的大盤狀疤痕的形成，有關區域功能性視網膜完全喪失。干性AMD患者可以維持質量下降的視力，而濕性AMD常常導致失明(Hamdi和 Kenney, Frontiers in Bioscience, e305_314, May2003)。
[0053]糖尿病性視網膜病
[0054]糖尿病性視網膜病變(DR)被認為是表現過度的毛細血管通透性、血管閉合和新血管增殖的視網膜血管病。DR以兩個階段發生:非增殖階段和增殖階段。在非增殖階段該疾病的特征是視網膜毛細血管周細胞喪失、基底膜增厚和微動脈瘤的發展、圓點狀和污點狀出血和硬性滲出物。在增殖階段該疾病的特征是大量新生血管發生、血管侵入到玻璃體、出血和纖維化隨后的視網膜牽引，視網膜牽引導致視力嚴重損傷。轉讓給本發明的受讓人的美國專利號6740738和相關專利和申請涉及抑制RTP801基因和蛋白質用于治療視網膜病變以及其他病變的方法。
[0055]口腔粘膜炎
[0056]口腔黏膜炎，也稱為口腔炎，是化學治療和放射線療法常見和衰弱副作用，其表現為紅斑和口腔和咽喉潰瘍性病變部位疼痛。口腔粘膜炎患者日常活動如吃飯、喝水、吞咽和說話都可能困難或難以做到。姑息性療法包括施用止痛藥和局部清洗。
[0057]干眼綜合征
[0058]干眼綜合征是由于潤滑眼睛的淚膜減少所致的常見問題。大多數干眼病患者會有不適感，和沒有視力損失；盡管在嚴重的情況下，角膜可能受到損傷或感染。潤濕滴液(人工眼淚)可用于治療干眼綜合征，潤滑膏可用于更嚴重的情況。
[0059]缺血件眼病
[0060]缺血性視神經病變(ION)包括各種視神經缺血產生的疾病。根據定義，ION定義為眼前病變如果存在急性視神經盤水腫，表明最接近眼球的一部分視神經梗死。缺血性視神經病變也可是眼后，位于眼球的背后幾厘米。缺血性視神經病變通常只發生在60歲以上的人。多數病例是非動脈炎性和可歸因于視神經灌注動脈粥樣硬化、糖尿病或高血壓的影響。顳動脈炎導致約有5%的病例(動脈性Ι0Ν)。
[0061]癥狀和體征是突然、部分或完全喪失視力，伴隨著視盤腫脹，而且往往出血。視野缺損可能表現為喪失一半的橫向劃分視野或有中央或中心外(環繞生理盲點)盲點。視力下降緊接著視盤蒼白。 更有效治療上述疾病和病癥的療法，將有很大的治療價值。
[0062]發明概述
[0063]本發明提供新TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、N0X3、HRK、RAC1、RH0A 和 DUOXlsiRNA，以及新的化學和/或結構修飾的siRNA化合物，以抑制一般基因表達和特別是哺乳動物基因 TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、N0X3、HRK、ClQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF、SPPl、RHOA 和 DUOXl 的表達。(關于基因的詳情參見以下表A)。
[0064]進一步提供具有有利性質并可應用于任何靶序列的siRNA，特別是在此公開的siRNA寡核苷酸，的新雙鏈寡核苷酸結構。本發明所公開的化學修飾的siRNA基序在制備用于RNA干擾(RNAi)的穩定和活性化合物中是有用的。
[0065]本發明還提供包括一種或多種所述寡核苷酸的藥物組合物。本發明進一步涉及在需要其的受試者中治療或預防疾病或病癥的發病率或嚴重程度的方法，其中所述疾病或病癥和/或與之相關的癥狀與靶基因的表達相關。在一些實施方案中所述疾病或病癥選自由聽力損失，急性腎功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸損傷，肺移植后缺血再灌注損傷，眼缺血病癥，器官移植包括肺、肝臟、心臟、胰腺和腎臟移植，腎毒性和神經毒性，脊髓損傷，壓瘡，年齡相關性黃斑變性(AMD)，干眼綜合征，口腔粘膜炎，缺血性眼神經病變(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)組成的組。該方法涉及給需要所述治療的哺乳動物施用預防或治療有效量的一種或多種所述化合物，其抑制或降低至少一種所述基因的表達或活性。
[0066]因此，本發明一方面提供新寡核苷酸序列用于抑制選自LRDD、CYBA, CASP2、N0X3、HRK、RAC1、RHOA和DUOXl的基因，所述基因的mRNA多核苷酸序列分別如SEQ ID NOS:1_2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46 和 47-48 所示。表 D (D1-D34)提供本發明的 19、21 和 23-mer有義寡核苷酸和相應的反義寡核苷酸。本發明的另一方面提供用于抑制一般基因表達或選自 TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、N0X3、HRK、ClQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG, CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP, CTGF, SPPl、RHOA 或 DUOXl 的基因的基因表達的化學和/或結構修飾的核酸化合物。在不同實施方案中修飾的化合物包含存在于表B(B1-B74)和C(C1-C3)的如SEQ ID NOS:97-68654所示的寡核苷酸序列(在美國序列號11/978，089和PCT專利申請號PCT/IL 2007/001278中公開，在此通過引用整體并入)。
[0067]在某些實施方案中，化學和/或結構修飾的SiRNA化合物包含存在于表D(D1_D34 ；SEQ ID NOS:68，655-87，088)的寡核苷酸序列。
[0068]本發明一方面提供化合物，該化合物具有如下所列的結構(A):
[0069](A) 5' (N)x-Z3'(反義鏈)
[0070]3' V -(N' )y 5'(有義鏈)
[0071]其中N和K中的每一個是選自以下的核苷酸:未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、未修飾的脫氧核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸；
[0072]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0073]其中X和y中的每一個是介于18和40之間的整數；
[0074]其中Z和V中的每一個可存在或不存在，但是如果存在，則是共價連接到其所存在的鏈的3'末端的1-5個連續核苷酸；
[0075]其中(N)X的序列包括存在于表D(D1_D34)中的一個或多個反義序列。
[0076]在某些實施方案中，(N) X和(N' )y完全互補。在其他實施方案中(N) X和(N')y基本上互補。在某些實施方案中(N) X與靶序列完全互補，在其他實施方案中(N) X與靶序列基本上互補。根據某些優選實施方案本發明提供siRNA化合物，該siRNA化合物包含一個或多個修飾的核苷酸，其中修飾的核苷酸在糖基部分、堿基部分或核苷酸間鍵合部分具有修飾。
[0077]本發明一方面提供化合物，該化合物具有如下所列的結構(IX):
[0078](IX) 5' (N)x-Z 3'(反義鏈)
[0079]3' V -(N' )y_z" 5'(有義鏈)
[0080]其中N和K中的每一個為可以是未修飾的或修飾的核糖核苷酸或非常規部分；
[0081]其中(N) X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0082]其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，則獨立地是共價連接到其所存在的鏈的3'末端的1-5個連續核苷酸；
[0083]其中z "可存在或不存在，但是如果存在，則是共價連接到(K )y的Y末端的加帽部分；
[0084]其中X = 18 到 27 ;
[0085]其中y = 18 到 27 ;
[0086]其中(N)X包含修飾 的和未修飾的核糖核苷酸，每個修飾的核糖核苷酸在其糖基上具有2' -O-甲基，其中在(N)X的3'末端的N是修飾的核糖核苷酸，(N) X包含從3'末端開始的至少5個交替的修飾的核糖核苷酸和共計至少9個修飾的核糖核苷酸，并且每個剩余的N是未修飾的核糖核苷酸；
[0087]其中在(N' )y中存在至少一個非常規部分，該非常規部分可能是脫堿基核糖部分、脫堿基脫氧核糖部分、修飾的或未修飾的脫氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸，和通過2/ -5'核苷酸間磷酸鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸；和
[0088]其中(N)x的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因編碼的mRNA的序列基本上相同。
[0089]在一些實施方案中X = y = 19。在其他實施方案中x = y = 23。在一些實施方案中至少一個非常規部分存在于(N' )y中的位置15、16、17或18。在一些實施方案中所述非常規部分選自鏡像核苷酸、脫堿基核糖部分和脫堿基脫氧核糖部分。在一些優選實施方案中所述非常規部分是鏡像核苷酸，優選L-DNA部分。在一些實施方案中L-DNA部分位于位置17,位置18或位置17和18。
[0090]在其他實施方案中所述非常規部分是脫堿基部分。在不同實施方案中(N' )y包含至少5個脫堿基核糖部分或脫堿基脫氧核糖部分。
[0091]在又其他實施方案中(N' )y包含至少5個脫堿基核糖部分或脫堿基脫氧核糖部分，并且至少I個K是LNA。
[0092]在結構(IX)的一些實施方案中，(N)X包含9個交替的修飾的核糖核苷酸。在結構(IX)的其他實施方案中(N) X包含9個交替的修飾的核糖核苷酸，還包含位于位置2的2' O修飾的核苷酸。在一些實施方案中(N)X包含位于奇數位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的W O Me修飾的核糖 核苷酸。在其他實施方案中(N)X還包含位于位置2和18中一個或兩個位置的2' O Me修飾的核糖核苷酸。在又其他實施方案中(N)X包含位于位置2、
4、6、8、11、13、15、17、19的2' O Me修飾的核糖核苷酸。
[0093]在一些實施方案中z "存在。在不同實施方案中z "存在，并且選自脫堿基核糖部分、脫氧核糖部分、反向脫堿基核糖部分、脫氧核糖部分、C6-氨基-P1、鏡像核苷酸。
[0094]在結構(IX)的一些實施方案中，(N)y包含在位置17、位置18或兩個位置17和18的鏡像核苷酸；其中(N' )y包含在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的2' O-Me修飾的核糖核苷酸；且其中所述靶基因是CASP2。
[0095]本發明另一方面提供化合物，該化合物具有如下所列的結構(X):
[0096](X) 5' (N)x-Z3'(反義鏈)
[0097]3' V -(N' )y_z" 5'(有義鏈)
[0098]其中N和K中的每一個為可以是未修飾的或修飾的核糖核苷酸或非常規部分；
[0099]其中(N) X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0100]其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，則獨立地是共價連接到其所存在的鏈的3'末端的1-5個連續核苷酸；
[0101]其中Z"可存在或不存在，但是如果存在，則是共價連接到(K )y的Y末端的加帽部分；
[0102]其中X = 18 到 27 ；
[0103]其中y = 18 到 27 ；[0104]其中(N) X包括修飾的或未修飾的核糖核苷酸，和任選地至少一個非常規部分；
[0105]其中在(N' )y中存在至少一個非常規部分，該非常規部分可以是脫堿基核糖部分、脫堿基脫氧核糖部分、修飾的或未修飾的脫氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸，和非堿基配對的核苷酸類似物或通過2' -5'核苷酸間磷酸鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸；和
[0106]其中(N)x的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因編碼的mRNA的序列基本上相同。
[0107]在一些實施方案中X = y = 19。在其他實施方案中x = y = 23。在一些優選實施方案中(N)X包含修飾的和未修飾的核糖核苷酸,和至少一個非常規部分。在不同實施方案中(N)X包含與所述mRNA互補的少于15個連續核苷酸。
[0108]在一些實施方案中，位于(N)X的:V末端的N是修飾的核糖核苷酸，并且(N) X包括至少8個修飾的核糖核苷酸。在其他實施方案中所述至少8個修飾的核糖核苷酸中的至少5個交替開始于3,端。在一些實施方案中(N)X包含位于位置5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15之一的脫堿基部分。
[0109]在一些實施方案中，(N' )y中的所述至少一個非常規部分位于位置15、16、17或18。在一些優選實施方案中所述非常規部分選自鏡像核苷酸,優選L-DNA部分。在一些實施方案中L-DNA部分位于位置17，位置18或位置17和18。在其他實施方案中，(N' )y中的所述至少一個非常規部分是脫堿基核糖部分或脫堿基脫氧核糖部分。在某些實施方案中，(N) X和(N' ) y之間有少于15個堿基對。
[0110]在結構⑴的一些實施方案中z"存在。在結構⑴的不同實施方案中z"存在，并且選自脫堿基核糖部分、脫氧核糖部分、反向脫堿基核糖部分、脫氧核糖部分、C6-氨基-P1、鏡像核苷酸。
[0111]在另一方面本發明提供化合物，該化合物具有如下所列的結構(XI):
[0112](XI) 5' (N)x-Z3'(反義鏈)
[0113]3' I' -(N' )y_z" 5'(有義鏈)
[0114]其中N和K中的每一個為可以是未修飾的或修飾的核糖核苷酸或非常規部分；
[0115]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0116]其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，則獨立地是共價連接到其所存在的鏈的3'末端的1-5個連續核苷酸；
[0117]其中z "可存在或不存在，但是如果存在，則是共價連接到(K )y的Y末端的加帽部分；
[0118]其中X = 18 到 27;
[0119]其中y = 18 到 27;
[0120]其中(N)X包含修飾的或者未修飾的核糖核苷酸和非常規部分的組合，任何修飾的核糖核苷酸在其糖基上具有2, -O-甲基；
[0121]其中(K )y包含修飾的或者未修飾的核糖核苷酸和任選地非常規部分，任何修飾的核糖核苷酸在其糖基上具有2’ OMe ；
[0122]其中(N)X的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N’)y的序列與靶基因編碼的mRNA的序列基本上相同；其中存在與所述 mRNA互補的少于15個連續核苷酸。[0123]在一些實施方案中X = y = 19。在其他實施方案中x = y = 23。在一些優選實施方案中所述至少一個優選的非常規部分存在于(N)X中，并且是脫堿基核糖部分或脫堿基脫氧核糖部分。在其他實施方案中，所述至少一個非常規部分存在于(N) X,并且是非堿基配對的核苷酸類似物。在不同實施方案中(N) X包含與所述mRNA互補的少于15個連續核苷酸。在不同實施方案中(N' )y包含未修飾的核糖核苷酸。在一些實施方案中(N)X包含至少5個脫堿基核糖部分或脫堿基脫氧核糖部分或其組合。在某些實施方案中(N) X和/或W ) y包含不與W ) y和/或(N) X中相應的修飾的或未修飾的核糖核苷酸堿基配對的修飾的核糖核苷酸。
[0124]結構(IX)，(X)和(XI)基序用于針對哺乳動物或非哺乳動物基因的任何寡核苷酸對(有義和反義鏈)。在一些實施方案中哺乳動物基因是人類基因。在不同實施方案中人類基因的mRNA如SEQ ID NOS:1_41，46-48之一所示。在一些實施方案中(N)X和(N' )y的寡核苷酸序列如表 B(B1-74)、C(C1-C4)和 D(D1_D34) (SEQ ID NO:97-87,178)所示。
[0125]在一些實施方案中結構(IX)、(X)和(XI)基序與表B(B1-B74)，C(C1_C3C4)和表D(D1-D34) (SEQ ID NOS:97-87,178)所示的寡核苷酸對組合使用。
[0126]在另一方面本發明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述任一種化合物和藥學上可接受的載體。
[0127]在又一方面本發明提供了一種在需要其的受試者中治療或預防疾病或病癥的發病率或嚴重程度的方法，其中所述疾病或病癥和/或與之相關的癥狀選自由聽力損失，急性腎功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸損傷，肺移植后缺血再灌注損傷，眼缺血病癥包括前部缺血性視神經病變，器官移植包括肺、肝臟、心臟、胰腺和腎臟移植 和包括DGF，腎毒性和神經毒性，脊髓損傷，壓瘡，年齡相關性黃斑變性(AMD)，干眼綜合征，Ι0Ν，口腔粘膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)組成的組，所述方法包括給受試者施用有效預防或治療所述疾病或病癥的量的包含上述任一種化合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
[0128]在不同實施方案中本發明提供有結構(IV)所列的siRNA:
[0129](IV) 5' (N)x-Z3'(反義鏈)
[0130]3' V -(N' )y 5'(有義鏈)
[0131]其中N和K中的每一個是選自以下的核苷酸:未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸，未修飾的脫氧核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸；
[0132]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0133]其中Z和Z'不存在；
[0134]其中X = y = 19 ;
[0135]其中在(N' )y中位置15、16、17、18和19的至少一個位置的核苷酸包含選自以下的核苷酸:脫堿基假核苷酸、鏡像核苷酸、脫氧核糖核苷酸和通過2' -5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸；
[0136]其中(N)X包含交替的修飾的核糖核苷酸和未修飾的核糖核苷酸，每個修飾的核糖核苷酸經修飾使得在其糖基上具有2' -O-甲基，并且位于(N)X的中間位置的核糖核苷酸是修飾的或未修飾的，優選地未修飾的；和[0137]其中(N)x的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與祀基因的mRNA基本上相同。
[0138]在結構(IV)的一些實施方案中，位于(N' )y的位置17和18中一個或兩個位置的核苷酸包含選自以下的核苷酸:脫堿基假核苷酸、鏡像核苷酸和通過2' -5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸。在一些實施方案中鏡像核苷酸選自L-DNA和L-RNA。在不同實施方案中鏡像核苷酸是L-DNA。
[0139]在不同實施方案中(K )y包含位于位置15的修飾的核苷酸，其中所述修飾的核苷酸選自鏡像核苷酸和脫氧核糖核苷酸。
[0140]在某些實施方案中(N' )y還包含位于位置2的修飾的核苷酸或者假核苷酸，其中假核苷酸可能是脫堿基假核苷酸類似物，并且修飾的核苷酸任選地是鏡像核苷酸。
[0141]在不同實施方案中反義鏈(N)X包含位于奇數位置(從5'到3';位置1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19)的Y O-Me修飾的核糖核苷酸。在一些實施方案中(N)X還包含位于位置2和18中一個或兩個位置的W O-Me修飾的核糖核苷酸。在其他實施方案中(N) X包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2' O Me修飾的核糖核苷酸。
[0142]考慮了結構(IV)、(IX)和⑴的其他實施方案,其中X = y = 21或其中x = y =23 ;在這些實施方案中，對上文論述過的(N' )y修飾不是在位置17和18而是在21-mer寡核苷酸的位置19和20以及23-mer寡核苷酸的位置21和22 ;類似地，在位置15、16、17、18或者19的修飾為在21-mer寡核苷酸的位置17、18、19、20或21和23_mer寡核苷酸的位置
19、20、21、22、或23。反義鏈上的W O Me修飾做出類似的調整。在一些實施方案中(N)X包含在奇數位置(5'到3'，21-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修飾]和23-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 [位置12的核苷酸未修飾])的W O Me修飾的核糖核苷酸。在其他實施中(N) X包含在21-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 [位置11的核苷酸未修飾]和23-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修飾]的2' O Me修飾的核糖核苷酸。
[0143]在一些實施方案中(N' )y還包含5'末端加帽核苷酸。在不同實施方案中末端加帽部分選自脫堿基假核苷酸類似物、反向脫堿基假核苷酸類似物、L-DNA核苷酸和C6-亞胺磷酸酯。
[0144]結構(IV)基序用于針對哺乳動物或非哺乳動物基因的任何寡核苷酸對(有義和反義鏈)。在一些實施方案中哺乳動物基因是人類基因。在不同實施方案中人類基因的mRNA 如 SEQ ID NOS:1-41,46-48 之一所示。
[0145]在一些實施方案中結構(IV)基序與表B(B1-B74)、C(C1_3C4)和表D(D1_D34) (SEQID NOS:97-87,178)所示的寡核苷酸對組合使用。
[0146]在其他實施方案中本發明提供化合物，該化合物具有如下所列的結構V:
[0147]5' (N)x-Z3'(反義鏈)
[0148]3' V -(N' )y 5'(有義鏈)
[0149]其中N和N'中的每一個選 自假核苷酸和核苷酸；
[0150]其中每個核苷酸選自未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、未修飾的脫氧核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸；[0151]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0152]其中Z和t不存在；
[0153]其中X = 18 到 27;
[0154]其中y = 18 到 27;
[0155]其中(N)X的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因的mRNA基本上相同；
[0156]其中至少一個N選自脫堿基假核苷酸、非配對的核苷酸類似物和(N)X的位置中與靶基因mRNA錯配的核苷酸，而使(N) X包含與靶基因mRNA互補的少于15個連續核苷酸。
[0157]在其他實施方案中本發明提供雙鏈化合物，該雙鏈化合物具有如下所列的結構(VI):
[0158](VI) 5' (N)x-Z 3'(反義鏈)
[0159]3' V -(N' )y 5'(有義鏈)
[0160]其中N和K中的每一個是選自以下的核苷酸:未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、未修飾的脫氧核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸； [0161]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0162]其中Z和t不存在；
[0163]其中X和y中的每一個是介于18和40之間的整數；
[0164]其中(N)x的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因的mRNA基本上相同；
[0165]其中(N)x、(N' )y或(N)x和(N' )y包含非堿基配對的修飾的核苷酸，而使(N)X和(K )y在雙鏈化合物中形成小于15個堿基對。
[0166]在其他實施方案中本發明提供化合物，該化合物具有如下所列的結構(VII):
[0167](VII) 5' (N)x-Z 3'(反義鏈)
[0168]3' V -(N' )y 5'(有義鏈)
[0169]其中每個N是選自以下的核苷酸:未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、未修飾的脫氧核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸；
[0170]其中每個N'是選自六元糖核苷酸、七元糖核苷酸、嗎啉代部分、肽核酸及其組合的核苷酸類似物；
[0171]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0172]其中Z和t不存在；
[0173]其中X和y中的每一個是介于18和40之間的整數；
[0174]其中(N)x的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因的mRNA基本上相同。
[0175]在其他實施方案中本發明提供化合物，該化合物具有如下所列的結構(VIII):
[0176](VIII) 5' (N)x-Z 3'(反義鏈)
[0177]3' V -(N' )y 5'(有義鏈)[0178]其中N和K中的每一個是選自以下的核苷酸:未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、未修飾的脫氧核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸；
[0179]其中(N)X和(N' )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸；
[0180]其中Z和Z'不存在；
[0181]其中X和y中的每一個是介于18和40之間的整數；
[0182]其中(N)X或(N' )y內部位置的一個N或N'，或位于(N)X或(N' )y的末端位置的一個或多個N或K包含脫堿基部分或W修飾的核苷酸；
[0183]其中(N)x的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因的mRNA基本上相同。
[0184]在結構(V)-(VIII)的一些實施方案中，(N)X包含交替的修飾的核糖核苷酸和未修飾的核糖核苷酸；每個修飾的核糖核苷酸經修飾使得其糖基上具有2, -O-甲基。在一些實施方案中位于(N)X中間位置的N是未修飾的。
[0185]在結構(IV)的一些實施方案中，(N' )y的位置17和18中的一個或兩個位置的核苷酸包含選自以下的核苷酸:脫堿基假核苷酸、鏡像核苷酸和通過2' -5'核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸。在一些實施方案中鏡像核苷酸選自L-DNA和L-RNA。在不同實施方案中鏡像核苷酸是L-DNA。
[0186]在不同實施方案中(K )y包含位于位置15的修飾的核苷酸，其中修飾的核苷酸選自鏡像核苷酸和脫氧核糖核苷酸。
[0187]在某些實施方案中(K )y還包含位于位置2的修飾的核苷酸，其中修飾的核苷酸選自鏡像核苷酸和脫堿基假核苷酸類似物。
[0188]在不同實施方案中反義鏈(N)X包括位于奇數位置(5'到3';位置1、3，5、7、9、
11、13、15、17、19)的W O-Me修飾的核糖核苷酸。在一些實施方案中(N)X還包含位于位置2和18中的一個或兩個位置的W O-Me修飾的核糖核苷酸。在其他實施方案中(N) X包括位于位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2' O Me修飾的核糖核苷酸。
[0189]考慮了結構(IV)的其他實施方案,其中X = y = 21或其中x = y = 23 ;在這些實施方案中，對上文論述過的(N' )y修飾不是在位置17和18而是在21-mer寡核苷酸的位置19和20以及23-mer寡核苷酸的位置21和22 ;類似地位置15、16、17、18或19的修飾為21-mer寡核苷酸的位置17、18、19、20或21和23-mer寡核苷酸的位置19、20、21、22或23。反義鏈上的W O Me修飾做類似調整。在一些實施方案中(N)X包含在奇數位置(5'到3' ;21-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修飾]和23-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 [位置12的核苷酸未修飾]的2! O Me修飾的核糖核苷酸。在其他實施方案中(N)X包含在21-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 [位置11的核苷酸未修飾]和23-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、
10、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修飾]的2' O Me修飾的核糖核苷酸。
[0190] 在一些實施方案中(N' )y還包含Y末端加帽核苷酸。在不同實施方案中末端加帽部分選自脫堿基假核苷酸類似物、反向脫堿基假核苷酸類似物、L-DNA核苷酸和C6-亞胺磷酸酯。
[0191]結構(IV)基序用于針對哺乳動物或非哺乳動物基因的任何寡核苷酸對(有義和反義鏈)。在一些實施方案中哺乳動物基因是人類基因。在不同實施方案中人類基因的mRNA 如 SEQ ID NOS:1-41,46-48 之一所示。
[0192]在一些實施方案中結構(IV)基序與表B(B1-B74)、C(C1-C4)和表D(D1_D34)中所示的寡核苷酸對組合使用。
[0193]本發明的第二方面提供基于本文公開的結構(C)-(H)以及相關結構(I)-(XI)的化學和/或結構修飾的siRNA化合物。在不同實施方案中siRNA化合物基于表B (B1-B74)、表C(C1-C4)和/或表D(D1-D34)所不的有義寡核苷酸和相應的反義寡核苷酸中的一個。
[0194]本發明的另一方面提供藥物組合物，其包含有效抑制人類基因表達的量的本發明的修飾的或未修飾的化合物和藥學上可接受的載體，其中該化合物包含存在于表D(D1-D34)的反義序列，(N)X0
[0195]本發明又一方面提供藥物組合物，其包含有效抑制人類基因表達的量一種或多種本發明的修飾的化合物和藥學上可接受的載體，其中該化合物包含表B(B1-B74)或表C(C1-C4)和/或表D(D1-D34)所示的反義序列，(N)X0
[0196]本發明另一個方面涉及給需要治療的受試者治療與基因表達相關的疾病或病癥和/或與該疾病或病癥相關的癥狀的方法，其中所述基因的miRNA多核苷酸序列如SEQ IDNOS =1-41,46-48中的任一個所示，所述方法包括給受試者施用治療有效劑量的量的根據本發明的siRNA從而 治療受試者。
[0197]更具體地，本發明提供用于治療患有急性腎功能衰竭(ARF)，聽力損失，青光眼，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸損傷，器官移植包括肺、腎、骨髓、心臟、胰腺、角膜或肝臟移植損傷(例如缺血再灌注損傷)和包括移植物功能延遲(DGF)腎毒性，脊髓損傷，壓瘡，干眼綜合征，口腔粘膜炎，缺血性視神經病變(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)的受試者的方法和組合物。
[0198]本發明的方法包含給受試者施用抑制基因表達的一種或多種siRNA化合物，其中所述基因的mRNA多核苷酸序列如SEQ ID NOS:1_41，46-48中的任一個所示。在此公開的新結構，當整合到任何靶基因的反義和相應有義核酸序列時提供siRNA化合物，所述siRNA化合物用于降低靶基因表達。靶基因是哺乳動物或者非哺乳動物基因。在特定實施方案中，靶基因是具有選自SEQ ID NOS:1-41，或46-48中的任一個的mRNA的哺乳動物基因。
[0199]轉讓給本發明的受讓人的PCT公布號W02008/050329中公開了如表B和C所示的有義和相應反義核苷酸序列，該公布在此通過引用整體并入。
[0200]本發明排除序列和修飾均已知的s iRNA化合物。
[0201]附圖簡述
[0202]圖1A和IB呈現了 19-mer siRNA結構和用本發明的2' _0_甲基化化合物得到的
實驗結果；
[0203]圖2顯示了在有義鏈和反義(AS)鏈上都具有交替甲基化模式的23-mer siRNA化合物的實例；
[0204]圖3A和3B呈現了包含2' -O甲基化單體的23_mer CASP2siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果；
[0205]圖4A和4B呈現了包含2' -O甲基化單體的23_mer CASP2siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果；[0206]圖5A和5B呈現了包含2' -O甲基化單體的23_mer CASP2siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果；
[0207]圖6A和6B呈現了包含2' 5'橋接核苷酸的19_mer QM5 (靶向p53) siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果；
[0208]圖7A和7B呈現了包含Y 5^橋接核苷酸的19_mer CASP2siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果；
[0209]圖8A和8B分別呈現了包含2' 5'橋接核苷酸的19_mer REDD2和QM5siRNA結構。
[0210]圖9A和9B呈現了包含2' 5'橋接核苷酸(星號)和2' -O甲氧基核糖核苷酸(粗體，下劃線)的組合的19-mer QM5siRNA結構，和圖9C-9E顯示了這些化合物的活性。
[0211]圖1OA和IOB呈現了包含2' 5'橋接核苷酸(星號)和2' _0甲氧基核糖核苷酸(粗體，下劃線)的組合的19-mer QM5siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果。圖1OC和IOD顯示了血清穩定性結果；
[0212]圖1lA和IlB呈現了包含2' 5'橋接核苷酸(星號)和2' _0甲氧基核糖核苷酸(粗體，下劃線)的組合的23-mer CASP2siRNA結構，及用這些化合物得到的實驗結果；
[0213]圖12 A和12B呈現了包含2' 5'橋接核苷酸(星號)的23-mer CASP2siRNA結構和用這些化合物得到的實驗結果；
[0214]圖13A顯示了包含L-DNA核苷酸的QM5siRNA結構；和圖13B顯示了用這些化合物得到的實驗結果；圖13C顯示了血清穩定性，和圖13D顯示了包含L-DNA核苷酸的siRNA與包含交替2'甲氧基模式的siRNA相比的IC50值；
[0215]圖14A顯示了包含LNA核苷酸的QM5siRNA結構；而圖14B顯示了用這些化合物得到的實驗結果；
[0216]圖15顯示了串聯siRNA化合物的實例及其血清穩定性結果；
[0217]圖16顯示了星形(star) siRNA化合物的實例及其血清穩定性結果；
[0218]圖17A-17C顯示了包含修飾組合的siRNA化合物的實例；
[0219]圖18描述了 RNA/DNA嵌合寡核苷酸；
[0220]圖19A-19D顯示了包含單獨的或與附加修飾組合的L-DNA基序的寡核苷酸的實例；
[0221]圖20描述了在制備根據本發明的雙鏈體化合物中有用的另外的寡核苷酸結構；
[0222]圖21舉例說明了用于本文詳述的各種結構的非堿基配對的核苷酸單體的實例；
[0223]圖22提供了本發明中用作Y加帽結構的C6-氨基-磷酸(C6-氨基-Pi)部分的化學結構的圖像；
[0224]圖23提供了用于RNAi的包含根據本發明序列和結構基序的化合物表。
[0225]發明詳述
[0226]本發明總體上涉及下調各種基因的表達的化合物，特別地涉及新的小干擾RNA(siRNA)以及這些新siRNA在治療遭受各種醫學病癥的受試者中的應用。
[0227]因此，本發明一方面提供用于抑制選自LRDD、CYBA, CASP2、N0X3、HRK、RACK RHOA和DUOXl的基因的新寡核苷酸序列，所述基因的mRNA多核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1_2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46和47-48所示。寡核苷酸序列呈現于表D (D1-D34)，其中有義鏈與互補的反義鏈配對。還提供了在針對任何靶基因的siRNA的制備中有用的新結構基序。表B(B1-B74)、C(C1-C4)和D(D1_D34)提供了本發明使用的優選siRNA的列表。對于每個基因有19-mer, 21-mer和23-mer序列的獨立表,所述序列基于它們在專有性算法中作為靶向人類基因表達的最佳序列的得分按優先次序列出。
[0228]在此詳細討論了抑制本發明基因的分子和組合物，并且所述分子和/或組合物的任一個可有益地用于遭受所述病癥的任一種的受試者的治療。
[0229]本發明的siRNA化合物具有可例如增強活性，增加穩定性，和/或最小化毒性的結構和修飾；本發明的新修飾SiRNAs有益地應用于在預防或削弱靶基因表達中有用的雙鏈RNA,特別地是此處論述的靶基因。
[0230]在下面的表A中呈現了某些靶基因和優選的適應癥的詳情。
[0231]表A:本發明的靶基因
[0232]
【權利要求】
1.一種化合物，該化合物具有如下所列的結構(X): (X)5' (N)X-Z 3'(反義鏈) 3' V -(N' )y-z" 5'(有義鏈) 其中N和K中的每一個為可以是未修飾的或修飾的核糖核苷酸或非常規部分； 其中(N)X和(K )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸； 其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，則獨立地是共價連接到其所存在的鏈的 末端的1-5個連續核苷酸； 其中z"可存在或不存在，但是如果存在，則是共價連接到(N' )y的5'末端的加帽部分； 其中X = 18到27 ； 其中y = 18到27 ； 其中(N) X包含修飾的或未修飾的核糖核苷酸，和任選地至少一個非常規部分； 其中在(N' )y中存在至少一個非常規部分，該非常規部分可能是脫堿基核糖部分、脫堿基脫氧核糖部分、修飾的或未修飾的脫氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸、非堿基配對的核苷酸類似物或通過2' -5'核苷酸間磷酸鍵與相鄰核苷酸連接的核苷酸；和 其中(N)X的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因編碼的mRNA的序列基本上相同。
2.根據權利要求1所述的化合物，其中X= y = 23。
3.根據權利要求1所述的化合物，其中(N)X包含修飾的和未修飾的核糖核苷酸，和至少一個非常規部分。
4.一種化合物，該化合物具有如下所列的結構(XI): (XI)5' (N)x-Z 3'(反義鏈) 3' V -(N' )y-z" 5'(有義鏈) 其中N和K中的每一個為可以是未修飾的或修飾的核糖核苷酸或非常規部分； 其中(N)X和(K )y中的每一個是其中每個連續的N或K通過共價鍵與下一個N或N'連接的寡核苷酸； 其中Z和Z'可存在或不存在，但是如果存在，則獨立地是共價連接到其所存在的鏈的 末端的1-5個連續核苷酸； 其中z"可存在或不存在，但是如果存在，則是共價連接到(N' )y的5'末端的加帽部分； 其中X = 18到27 ； 其中y = 18到27 ； 其中(N)X包含修飾的或未修飾的核糖核苷酸和非常規部分的組合，任何修飾的核糖核苷酸在其糖基上具有2, -O-甲基； 其中W )y包含修飾的或未修飾的核糖核苷酸和任選地非常規部分，任何修飾的核糖核苷酸在其糖基上具有2’ OMe ； 其中(N)X的序列與(N' )y的序列基本上互補；并且(N' )y的序列與靶基因編碼的mRNA的序列基本上相同；和其中存在與所述mRNA互補的少于15個連續核苷酸。
5.根據權利要求4所述的化合物,其中X= y = 23。
6.權利要求4所述的化合物，其中至少一個非常規部分存在于(N)X，并且是脫堿基核糖部分或脫堿基脫氧核糖部分。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的化合物，其中所述靶基因選自哺乳動物和非哺乳動物基因。
8.根據權利要求7所述的化合物，其中所述哺乳動物基因是人類基因，其中該基因編碼的 mRNA 如 SEQ ID NO:1_41 或 46-48 之一所示。
9.一種藥物組合物,該藥物組合物包含根據權利要求1-8中任一項所述的化合物，和藥學上可接受的載體。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物用于制備在需要其的受試者中治療或預防疾病或病癥的發病率或嚴重程度的藥物的用途，其中所述疾病或病癥和/或與之相關的癥狀選自由聽力損失，急性腎功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸損傷，肺移植后缺血再灌注損傷，眼缺血病癥包括前部缺血性視神經病變，器官移植包括肺、肝臟、心臟、胰腺和腎臟移植和包括DGF，腎毒性和神經毒性，脊髓損傷，壓瘡，年齡相關性黃斑變性(AM D)，干眼綜合征，ION，口腔粘膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)組成的組。
【文檔編號】A61P9/10GK103898110SQ201210369167
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2008年9月4日 優先權日:2007年10月3日
【發明者】埃萊娜·范斯坦, 侯賽因·阿依古恩, R·斯卡里特, 夏甲·卡林斯基, 伊戈·邁特, 詹姆士·麥克斯威根, 列昂尼德·拜格爾曼 申請人:夸克制藥公司