專利名稱：一種貫眾提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥的提取物，具體地說是一種貴州中草藥貫眾的提取物，同時還涉及貫眾的提取物的制備方法和應用。
背景技術：
人體衰老與惡性腫瘤的發生均于人體細胞中過量的自由基，特別是與活性氧自由基有關。人體每個細胞的DNA每天都要受到104次氧化攻擊 而引起損傷。自由基摧毀細胞膜，使細胞不能吐故納新，并喪失了對細菌和病毒的抵御能力；自由基攻擊正在復制中的基因，造成基因突變，誘發癌癥的發生。而癌癥的發病率以每年在3%到5%的速度在提高，以癌癥引起的死亡率已經成為世界第一的死亡率。因此，尋找有效的抗癌抗氧化的藥物仍是全球性的嚴峻課題。發明人一直從事中草藥有效成分的提取分離及活性研究，特別重視抗癌和抗氧化發面的藥物的有效成分的提取及活性研究，發明人研究發現貫眾提取物具有抗癌和和抗氧化的作用。貫眾為鱗毛蕨科植物貫眾屬植物的干燥根莖及葉柄殘基，附生林下，產于貴州、云南、四川、西藏等。其味苦、微寒，有小毒，歸肝，胃經，具有清熱解毒、驅蟲等功能。現代藥理研究表明，具有抗病毒、驅蟲、抗腫瘤、興奮子宮等作用，臨床用于治療肺炎、乙型肝炎、腸道寄生蟲病、婦產科出血等。但在現有的中醫中藥資料中，尚未發現將貫眾的提取物用于治療癌癥或具有抗癌和抗氧化作用的記載和報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種貫眾的提取物。同時，本發明的目的還在于提供一種貫眾的提取物的制備方法。本發明的目的還在于提供一種貫眾的提取物在制備抗癌和抗氧化藥物方面的應用。為了實現上述目的，本發明一種貫眾提取物及其制備方法和應用，其提取物是以中藥貫眾為原料，經乙醇浸提而得的一種貫眾乙醇提取液，回收溶劑后得到乙醇總提取物，水分散后依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，回收乙酸乙酯和正丁醇溶劑后，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。將乙酸乙酯和正丁醇萃取物進行柱層析，得到16個粗分段。將貫眾乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段進行抗癌抗氧化活性測試，測試結果表明，貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段均有較好的抗癌抗氧化的活性。本發明一種貫眾提取物的制備方法，按以下步驟制備
(I)將干燥的貫眾的塊莖粉碎后，加入2-3倍原料和總量的80%的乙醇水溶液加熱回流提取，第一次回流提取6小時，第二次回流提取3小時，第三次回流提取I小時，然后合并三次乙醇浸提液。(2)將三次合并的乙醇浸提液減壓蒸餾，回收乙醇溶液，得到乙醇總提取物浸膏，將乙醇浸膏水分散，一次使用10升的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分別萃取3次。(3)將乙酸乙酯和正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。(4)將乙酸乙酯和正丁醇萃取物進行柱層析，得到16個粗分段。本發明一種貫眾提取物的應用是指貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段用于制備抗癌藥物方面的應用。本發明一種貫眾提取物的應用是指貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段用于制備抗氧化藥物方面的應用。將貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段使用DMSO溶解，阿霉素為陽性對照藥，O. 1%的DMSO的培養基為陰性對照，使用MTT法，對人類前列腺癌細胞PC3，胃癌細胞BGC-823，乳腺癌細胞Bcap-37以及黑色肉瘤細胞A375體外抑制增殖的生物活性研究。研 究表明貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段對這四種癌細胞具有較好的抑制作用。將貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段使用無水乙醇溶解，維生素C為陽性對照藥，無水乙醇為陰性對照，使用DPPH微孔板法測其抗氧化生物活性測試。測試結果表明貫眾的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段具有較好的抗氧化生物活性，甚至高于維生素C的抗氧化能力
貫眾屬植物的主要化學成分主要是萜類、酚類、留體類化合物，因此為研究其主要抗癌抗氧化化學成分，本發明涉及使用氣質聯用的方法對活性較好的提取層進行化學成分分析。圖I :山地貫眾乙酸乙酯層化學成分分析。在保留時間15分鐘和30分鐘左右峰面積較多，由此可知在此保留時間的化合物主要是萜類和酚類化合物，因此萜類和酚類物質可能是此萃取層的主要活性成分。圖2 :山地貫眾正丁醇層化學成分分析。在保留時間30分鐘左右峰面積最多，由此可知在此保留時間出現的化合物主要是萜類化合物，因此在此萃取層主要的活性物質是萜類成分。圖3 :山地貫眾分離段Fr. 3化學成分分析。在保留時間20分鐘左右峰面積最多，由此可知在此保留時間出現的化合物主要是酚類化合物，因此在此萃取層主要的活性物質是酚類成分。圖4 山地貫眾分離段Fr. 5化學成分分析。在保留時間20分鐘左右峰面積最多，可能原因是洗脫劑極性變化不大，酚類依然是此分離段的主要成分。圖5 山地貫眾分離段Fr. 6化學成分分析。在保留時間30分鐘左右峰面積最多，由此可知在此保留時間出現的化合物主要是萜類化合物，因此在此萃取層主要的活性物質是萜類成分。圖6 山地貫眾分離段Fr. 12化學成分分析。在保留時間30分鐘左右峰面積最多，可能原因是洗脫劑極性增強，萜類物質也逐漸增多。
具體實施例方式實施例I
稱取干燥的貫眾塊莖15千克粉碎后，加入2-3倍原料和總量的80%的乙醇水溶液加熱回流提取，第一次回流提取6小時，第二次回流提取3小時，第三次回流提取I小時，然后合并三次乙醇浸提液。將三次合并的乙醇浸提液減壓蒸餾，回收乙醇溶液，得到乙醇總提取物浸膏。實施例2
將乙醇浸膏水分散，一次使用10升的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分別萃取3次。將
乙酸乙酯和正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。乙酸乙酯和正丁醇萃取均為褐色粘稠物質。實施例3
將貫眾乙酸乙酯進行硅膠(200-300目)柱層析，石油醚乙酸乙酯(20:1-1:1)，點板跟蹤，合并比移值(Rf值)相同的流段，總共得到10個粗分段(Fr. I-Fr. 10)。實施例4
將貫眾乙酸乙酯進行MCI柱層析，以甲醇水為洗脫劑，洗脫劑由20%的甲醇水溶液到100%的甲醇溶液，點板跟蹤，合并Rf值相同的流段，總共得到6個粗分段(Fr. Il-Fr. 16)。實施例5
本實例為提取物的抗癌生物活性的測試實驗 方法噻唑藍(MTT)比色法
原理MTT 全稱為 3-(4，5-Dimethylthiazol_2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，漢語化學名為3- (4，5-二甲基噻唑_2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽，商品名噻唑藍。MTT法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT是一種接受氫離子的黃色染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色可溶性MTT還原為藍紫色不溶性甲臢結晶。甲臢結晶的生成量與活細胞數目成正比，而死細胞無此功能。二甲基亞砜、SDS可溶解該結晶，利用酶標儀測定595 nm處的吸光度，可以間接反映活細胞的數量。在一定的細胞范圍之內，MTT形成的結晶物的數量與細胞數成正比。儀器倒置生物顯微鏡XDS-IB (重慶光電儀器有限公司)，CO2培養箱(日本SANYO公司)，96孔板酶標儀BI0-RAD680(美國BIO-RAD公司)，96孔板，以及各種規格的移液器
坐寸ο試劑胎牛血清(天津市灝陽生物制品科技有限公司)，胰蛋白酶(美國SIGMA公司)，RPMI 1640培養基(美國GIBICO公司)，MTT (北京鼎國生物技術發展有限公司)，SDS (北京鼎國生物技術發展有限公司)，二甲基亞砜(北京鼎國生物技術發展有限公司)。細胞培養PC3、BGC-823、Bcap-37和A375細胞均為貼壁細胞，用含10 %胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基用含在37 °C、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，記錄細胞生長狀態。2天換一次培養液，當貼壁細胞鋪滿瓶底80%以上時，傳代培養。傳代培養步驟吸除培養瓶內廢棄培養基，向瓶內加入無血清培養基洗一次，吸除無血清培養基，向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液O. 5 mL,置培養箱中大約2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，當發現細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即加入有血清培養基終止消化，用吸管吸取有血清培養基輕輕反復吹打瓶壁細胞，連續吹打直至細胞完全從瓶壁上脫落，形成單細胞懸液。用吸管吸出單細胞懸液，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，加入新的培養基，置于37 °C、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。取對數生長期細胞為實驗對象。實驗方法取對數生長期細胞，用O. 25%胰蛋白酶消化后，重懸于含10 %FBS的RPMI 1640的培養基中，以2 X IO4個/mL的終濃度接種于96孔培養板上，每孔100 L，置于37 °C、5 % CO2的飽和濕度培養箱中培養。24小時后吸掉培養基，加入含不同濃度藥物的有血清培養基，每孔200 L。放入培養箱培養72小時后吸掉含藥培養基，加入濃度為O. 5mg/mL的MTT，每孔100 L，培養4小時后每孔再補加100 L 10%的SDS，放入培養箱10小時，使結晶充分溶解后取出，冷卻至室溫，在595 nm波長下測OD值，計算抑制率。實驗中同時設空白對照組、陰性對照組和陽性對照組。空白對照組不加細胞只加有血清RPMI1640培養基，陰性對照組加入與藥物同體積的DMS0，陽性對照組加入與被測藥物同濃度的ADM。實驗結果以SPSS 13. O軟件進行方差分析，P〈0. 05時為差異顯著，P〈0. 01時為差 異極顯著。細胞增殖的抑制率計算公式如下
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表I供試石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物在設定濃度下對癌細胞的體外增殖抑制活
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表2供試粗分段在濃度為100 μ g/ml下對癌細胞的體外增殖抑制活性
權利要求
1.一種貫眾提取物其特征是提取物是以中藥貫眾的塊莖為原料經乙醇浸提并經減壓蒸餾而得到乙醇總提取物浸膏，乙醇總提取物浸膏水溶液依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，減壓蒸餾回收溶劑后得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物，為褐色粘稠物質，再分別將乙酸乙酯和正丁醇萃取物使用柱層析進行粗分，得到粗分段，使用噻唑藍(MTT)比色法以及1，I-二苯基-2-苦肼基[DPPH]微孔板法對萃取物和粗分段進行活性測試，測試結果表明乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段都表現出較好的抗癌以及抗氧化的活性。
2.根據權利要求I所述的一種貫眾提取物及其制備方法，其特征在于按以下步驟制備 (1)將干燥的貫眾的塊莖粉碎后，加入2-3倍原料和總量的80%的乙醇水溶液加熱回流提取，第一次回流提取6小時，第二次回流提取3小時，第三次回流提取I小時，然后合并三次乙醇浸提液 (2)將三次合并的乙醇浸提液減壓蒸餾，回收乙醇溶液，得到乙醇總提取物浸膏，將乙醇浸膏水分散，一次使用10升的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分別萃取3次 (3)將乙酸乙酯和正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物 (4)將乙酸乙酯和正丁醇萃取物進行柱層析，得到16個粗分段。
3.根據權利要求I所述將乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及16個粗分段，分別使用MTT法進行抗癌生物活性測試和使用DPPH微孔板法進行抗氧化活性測試，測試表明，貫眾乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及部分粗分段具有較好的抗癌和抗氧化的生物活性，以此可用于制備抗癌和抗氧化方面藥物的應用。
全文摘要
本發明公開了一種貫眾提取物及其制備方法和應用，設計一種中草藥提取物，是以貴州中草藥貫眾塊莖為原料，經乙醇浸提而得到乙醇總提取物，乙醇總提取物水溶液依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，減壓蒸餾回收溶劑后得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物，再分別將乙酸乙酯和正丁醇萃取物使用柱層析進行粗分，得到粗分段。乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及粗分段都表現出抗癌以及抗氧化的特性。可用于制備抗癌以及抗氧化的藥物。
文檔編號A61P35/00GK102861109SQ20121040494
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者楊松, 楊勝杰, 薛偉, 胡德禹, 劉明川, 梁娜, 劉敏潔, 趙洪菊, 龔華玉 申請人:貴州大學