專利名稱：一株鴨出血性卵巢炎病毒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株鴨出血性卵巢炎病毒。該病毒分離自一種新的鴨病。屬動物病毒學領域。
背景技術：
自2010年4月初以來，我國浙江、江蘇、山東、福建、河北、北京等省份的種鴨、
蛋鴨發生一種以產蛋率急速下降、甚至停產及不同程度死亡為特征的疫病，俗稱種(蛋)鴨產蛋驟降、卵巢出血癥，引起此病的病毒最初命名為鴨黃病毒(Duck flavivirusvirus, DFV),現基本統一命名為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus，DH0V)。各品種蛋鴨、種鴨等均有發生，但主要見于開產蛋鴨。產蛋鴨發病后出現長時間(4(T60d)的產蛋率低下，恢復后所產種蛋的受精率和孵化率出現下降。發病鴨采食量顯著下降，拉綠色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滯，體重減輕。少量病鴨出現站立不穩、震顫，行走困難和姿勢異常。主要病變為出血性卵巢炎、間質性肝炎和非化膿性腦炎。該病近期成為危害中國養鴨業的重要疫病之一。產蛋率高的鴨群患病后4 5(1從產蛋高峰或高產蛋率迅速下降至209Γ30%，嚴重的于發病后7d左右停產；剛開產種(蛋)鴨產蛋率上升緩慢或減蛋，長時間低產蛋率或無產蛋高峰出現。不同地區、不同品種鴨群發病率高低不一，群內發病率幾乎100%，病死率為09Γ12%。國內外研究資料，黃病毒一般能在鼠腦、C6/36、BHK-21、Vero等組織或細胞上進行增殖，近年來，也有人接種9到10日齡雞胚或鴨胚尿囊液進行病毒分離增殖。考慮到細胞來源穩定、質量可控、無外源病毒污染，我們選定SPF源雞胚成纖維細胞(CEF)作為分離這種病毒的唯一細胞系。眾所周知，CEF細胞來源于SPF雞胚，其供體背景清楚(不含任何病源)、制備工藝成熟、方法簡單、對禽源病毒較為敏感。同時，SPF級鴨胚來源有限，而用SPF雞胚制備的CEF繁殖病毒，其每胚產量是SPF雞胚的10倍左右，且效價較高，在雞胚成纖維細胞繁殖的效價明顯高于雞胚和鴨胚上的效價。因此，我們選用CEF細胞用于這種病毒的分離培養，并取得成功，并對分離株進行了系統鑒定和E基因測序分析。由于是新發傳染病，人們對鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritisvirus, DHOV)的分離鑒定、生物學特性及主要抗原基因特征研究尚有較大的空白。
發明內容
本發明的目的是由病死蛋鴨體內分離病原、并對其分離物進行鑒定和利用。本發明采用的技術方案是采集病死鴨肝臟、卵巢等病變組織經研磨、離心、濾過后進行病原分離鑒定，對所獲得的病毒分離株進行細胞培養特點、電鏡觀察、效價測定、疑似病原RT-PCR/PCR檢測及測序、核酸型鑒定、理化特性鑒定、血凝性測定、血清中和試驗、動物試驗作進一步的鑒定。I.本研究通過對發病樣品處理，接種原代細胞CEF和MDCK等哺乳動物傳代細胞，相繼獲得具有同一種CPE表現的病毒分離物，經過效價測定、電鏡觀察、疑似病原RT-PCR/PCR檢測及E基因測序、核酸型鑒定、理化特性鑒定、血凝性測定、中和試驗及動物試驗，結果表明該分離株為鴨出血性卵巢炎病毒(Duckhemorrhagic hvaritis virus, DH0V),命名為DHOV JN株,屬黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群成員。2.細胞培養特性DHOV-JN分離株具有較廣的細胞適應譜，不僅能適應禽源細胞(CEF)、組織(SPF雞胚)，也能適應1 0(、8皿-21、31\￥61'0等哺乳動物傳代細胞系，也間接說明該病毒的宿主范圍可能較廣，對此應進行深入研究。考慮到細胞來源可控、無外源污染等因素，本研究選擇SPF源CEF作為分離、傳代、增殖該病毒的細胞，并取得成功，病毒能較好地適應CEF，效價也較高，達到105 5TCID5(i/0. lmL。這為進行病原鑒定、生物學特性、疫苗等研究奠定了極好的細胞平臺和研究基礎。3.病原學特點進行了電鏡觀察、理化特性、可疑病原檢測、基因測序和進化分析、病毒核酸型鑒定、血清中和研究，結果發現病毒粒子大于60nm、呈六邊形、有囊膜；該病毒對熱敏感(56°C 15min可滅活)，對氯仿、乙醚和堿敏感，對酸、胰酶不敏感；用AIV等8種禽源病毒RT-PCR/PCR和黃病毒RT-PCR檢測發現，僅能檢出黃病毒核酸陽性，測定其E基因長 度為1503bp,構建了基于黃病毒E基因的遺傳進化樹,發現該分離株屬黃病毒屬恩塔亞病毒群的成員；IUDR代謝試驗結果證實該分離株的核酸型為RNA ;該分離株不能被禽流感、新城疫、減蛋綜合癥、鴨肝炎、傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎、番鴨呼腸孤以及禽網狀內皮增生癥等8種常見禽源病毒的陽性血清所中和。4.病毒的致病性為驗證DHOV-JN株對禽類的致病性，我們進行了該毒株對SPF雞胚、SPF小雞、SPF蛋雞、雛鴨以及臨床健康蛋鴨的致病性試驗。結果發現DHOV-JN株可使9日齡SPF雞胚的發育顯著推遲，解剖發現胚體出血、成型雞胚的肝臟腫大、呈現“花斑肝”。DHOV-JN株能致死2日齡SPF小雞，一般3 5天死亡，死亡率為30% 50% ;初期雞只食欲較對照差，耐過后無影響；死亡雞解剖可見腦膜變軟，腎臟和脾臟稍微腫大。但該病毒對50日齡的SPF雞沒有顯著的臨床影響。但該病毒對剛孵出的2日齡雛鴨具有致死性，用DHOV-JN株攻擊2日齡雛鴨，實驗組全部死亡，解剖發現肝臟病變嚴重，多器官出血；對開產蛋鴨具有較強的致病性，解剖發現，實驗組的蛋鴨產蛋率嚴重下降，卵巢組織出現了卵泡液化、卵泡發育遲緩、出血以及輸卵管萎縮等現象，肝臟發黃、腫大、質地變脆，脾臟腫大等。上述結果表明，分離自蛋鴨的DHOV-JN株對雞、鴨都具有極強的致病性，是否對鵝具有致病性由于時間關系本研究為開展試驗，但據黃欣梅(黃欣梅，李銀，趙冬敏，等.新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定.江蘇農業學報，2011，27 (2) :354 360.)等的研究，這種病毒對鵝也具有相似的致病性。這些結果證實，這種新分離到的禽黃病毒對家禽業具有顯著危害，需要加強流行病學、病原學、免疫學等研究。綜上所述I.該株病毒為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus, DHOV)JN株，該株病毒已于2012年3月22日將該分離株送交北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏號為 CGMCCNo. 5907。2.該分離毒株主要特點(I)分離的鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒從一種臨床癥狀稱為鴨出血性卵巢炎的病鴨采集肝臟、卵巢組織，用SPF源CEF分離獲得；
(2)鴨出血性卵巢炎病毒 CGMCC No. 5907 株病毒能在 CEF、MDCK、Vero、BHK_21、ST和Marc-145單層細胞上進行增殖，并能致這些細胞產生較為一致的CPE ；(3)用 SPF 源 CEF 測得 CGMCC No. 5907 株病毒效價為 105_5TCID5(l/0. ImL ；(4) CGMCC No. 5907株病毒接種雞/和鴨能復制出典型的鴨出血性卵巢炎。3.鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒用于制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。4.鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒在鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗中用作攻毒毒株。
具體實施例方式I.病毒分離 (I)病料處理本發明人由某蛋鴨場產蛋下降病鴨中采集，每份病料主要有病死蛋鴨的部分卵巢組織、肝臟等病變組織。無菌操作剪取5. Og組織，加入少量的MEM (含青霉素、鏈霉素1000U/mL)，研磨至糊狀，再加入4倍體積的MEM稀釋成懸濁液，樣品在_80°C和室溫反復凍融3次,再經4°C、12000r/min離心IOmin,收集上清液用O. 22 μ m的一次性濾器濾過除菌，最后分裝_80°C凍存備用。(2)雞胚成纖維細胞(CEF)分離用9日齡SPF雞胚(SPF雞胚，SPF蛋雞均購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司)，無菌條件下去頭、爪、內臟以眼科翦剪碎，然后加
O.25%的胰酶進行消化，待液體自然渾濁后加MEM培養基終止，再用滅菌的6層紗布過濾后搖勻分裝入普通細胞培養瓶，置37°C、5%C02培養箱內培養。待CEF鋪滿單層后按5%的量接入經預處理、并濾過除菌的組織上清液，繼續培養觀察至72h，無論有無病變均收獲，然后繼續盲傳至F5代，直至細胞病變出現并趨于穩定，收獲培養物_80°C保存備用。取一 80°C保存的病料處理上清液接種CEF，連續傳7代，經觀察傳至F4代開始出現CPE，F5代的50h CEF開始出現CPE，65h時病變明顯(75%細胞有病變)，CPE主要表現為細胞圓縮、融合，并逐漸拉網，然后脫落崩解。見下
圖1、2。從F5代開始CPE趨于穩定。(3)病毒在其他細胞上的增殖用_80°C凍存的病毒CEF F5代培養物各ImL分別接種已長滿單層的MDCK (狗腎傳代細胞)、VeiO (非洲綠猴腎細胞)、BHK-21 (乳倉鼠腎細胞)、ST (豬睪丸細胞)以及Marc-145 (非洲綠猴腎細胞克隆細胞株)(以上傳代細胞均為本申請人實驗室保藏)，作用I 2h后，置37°C、5%C02的培養箱中進行連續培養觀察，記錄各種細胞的CPE情況。傳代增殖方法與用雞胚成纖維細胞(CEF)方法基本相同。用JN株CEF F5代分離物分別接種MDCK、Vero、BHK_21、ST以及Marc-145單層細胞，均能產生明顯的CPE，病變表現與病毒致CEF的特點基本一致。2.分離物的鑒定(I)效價測定取新制備好的CEF細胞，接種96孔細胞培養板，每孔接種細胞懸液100 μ L，待細胞長成良好單層后。取置于一 80°C保存的JN株CEF F5代分離物進行10倍系列稀釋至10_7，取每個稀釋度的病毒液，分別接種于已生長良好CEF細胞96孔細胞培養板上，每個滴度接種8孔，每孔100 μ L，同時設立陽性對照和陰性對照各8孔。將細胞培養板置37°C、5%C02培養3 5d，每天觀察細胞出現病變的情況，出現CPE者判為感染，按Reed —Muench法計算TCID5tl，結果測定JN株CEF F5代分離物的效價(TCID5tl)為105 5/0· ImL0
(2)電鏡觀察取JN株CEF F5代分離物做負染電鏡觀察，結果發現JN株CEF F5代病毒粒子大于60nm、呈六邊形、有囊膜，見圖3。(3)中和試驗用固定抗體一稀釋病毒法進行。取一 80°C保存的JN株CEF F5代分尚物，根據病毒含量測定結果將待檢病毒液稀釋為100TCID5(i/0. ImL,將病毒稀釋液分別與等體積的AIV、NDV、EDSV、DHV、IBDV、IBV、MDRV以及REV標準陽性血清(均購自中國獸醫藥品監察所)震蕩混合均勻，至37°C作用2h，期間震蕩2 3次。作用結束后，將中和液接種96孔CEF細胞板，每孔100 μ L，同時設立陽性對照和正常細胞對照。將細胞培養板置37°C、5%C02培養5 7d,每天觀察細胞出現病變的情況并詳細記錄。按Reed — Muench法計算TCID50,結果未見任何一份血清被中和，說明JN株不屬于這些常見的禽源病毒，需要進一步鑒定。(4)核酸型鑒定用終濃度為50 μ g/mL的5’-碘脫氧尿核苷處理DHOV-JN株CEF F5代培養物后，測得其TCID50S IO5.3/0· lrnL，未處理對照組TCID5tl為105 5/0· lmL，說明5’-碘 脫氧尿核苷不能抑制JN分離株在CEF中的增殖，該病毒為RNA病毒。(5)疑似病原RT-PCR/PCR檢測登錄GenBank，下載51個具有代表性的黃病毒全基因序列，經DNAstar軟件分析其E基因后，利用Primer5. O軟件設計了 I對檢測引物，FLVTF 5’ -TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’，FVTRl :5’ -TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’，預期目的片段為549bp ;按照本發明中初步建立的本病以及其他8種病毒的RT-PCR檢測方法(見表I)進行擴增和電泳檢測(圖4)。表I分離毒及8種疑似禽源病毒PCR檢測條件
權利要求
1.一株鴨出血性卵巢炎病毒，其特征在于該株病毒為鴨出血性卵巢炎病毒DHOV-JN株，該株病毒已于2012年3月22日將該分離株送交北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏號為CGMCCNo. 5907。
2.如權利要求I所述的一株鴨出血性卵巢炎病毒，其特征在于 (1)鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒從一種臨床癥狀稱為鴨出血性卵巢炎的病鴨采集肝臟、卵巢組織，用SPF源CEF分離獲得； (2)鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒能在CEF、MDCK, Vero, BHK-21、ST和Marc-145單層細胞上進行增殖，并能致這些細胞產生較為一致的CPE ；(3)用SPF 源 CEF 測得 CGMCC No. 5907 株病毒效價為 105·5TCID50/0. ImL ； (4)CGMCC No. 5907株病毒接種雞/和鴨能復制出典型的鴨出血性卵巢炎。
3.如權利要求I所述的一株鴨出血性卵巢炎病毒的應用，其特征在于鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒用于制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。
4.如權利要求3所述的一株鴨出血性卵巢炎病毒的應用，其特征在于鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒在鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗中用作攻毒毒株。
全文摘要
本發明涉及一株鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritis,DHOV)。從臨床發病蛋鴨的組織病料中用SPF源雞胚成纖維細分離到一株DHOV-JN，該分離株能在CEF上增殖并能致其產生典型的細胞病變，亦能在MDCK、Vero、BHK-21、ST和Marc-145單層細胞上進行增殖并出現較為一致的CPE，用CEF測得分離株效價為105.5TCID50/0.1mL；該分離株屬黃病毒科、黃病屬、恩塔亞病毒群的成員；該毒株可以此研究為基礎開發相應的RT-PCR檢測/診斷方法(試劑)，也可研制用于本病臨床預防用疫苗等生物制品。
文檔編號A61K39/12GK102899295SQ20121042534
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者鄒敏, 吳發興, 劉 東, 劉新文, 申洪銀, 孫健, 劉蕾, 范根成, 杜元釗 申請人:青島易邦生物工程有限公司