專利名稱：荷電的脂蛋白絡合物及其用途的制作方法
技術領域：
本公開提供了荷電的脂蛋白絡合物、包括該絡合物的藥物組合物以及使用該絡合物治療或預防多種病癥和失調的方法，所述病癥和失調包括血脂異常和/或與其相關的疾病、失調和/或病癥。
3.
背景技術：
循環的膽固醇經由血液中轉運脂質的、脂質與蛋白質組成的血漿脂蛋白絡合物顆粒運送。血漿中循環的脂蛋白顆粒具有以下四種主要類別并且均包括在脂肪轉運系統中:乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒構成了腸內脂肪吸收的短壽命產物。VLDL尤其是LDL負責將膽固醇由肝(膽固醇在肝中合成或由飲食來源獲得)遞送至肝外的組織——包括動脈壁。相反，HDL介導膽固醇的逆轉運(RCT)和膽固醇脂質的去除，特別是介導由肝外組織至肝(膽固醇在肝中儲存、代謝、消除或再循環)的膽固醇的逆轉運(RCT)和膽固醇脂質的去除。HDL在炎癥、轉運氧化的脂質和白細胞介素中也起到了關鍵性作用。脂蛋白顆粒具有包括膽固醇(通常為膽固醇酯的形式)和甘油三酯的疏水核。該核為包括磷脂、未酯化的膽固醇和載脂蛋白的表層所圍繞。載脂蛋白介導脂質轉運，并且載脂蛋白中的一部分可與脂質代謝中涉及的酶相互作用。已經鑒別了至少十種載脂蛋白，其包括:ApoA_1、ApoA-11、ApoA-1V、ApoA-V、ApoB、ApoC-1、ApoC-11、ApoC-1I1、ApoD、ApoE、ApoJ和ApoH。還發現了與脂蛋白締合的其他蛋白質，如LCAT(卵磷脂:膽固醇酰基轉移酶)、CETP(膽固醇脂轉移蛋白)、PLTP (磷脂轉移蛋白)和PON (對氧磷酶)。心血管疾病，如冠心病、冠狀動脈疾病和動脈粥樣硬化在極大程度上與血清中升高的膽固醇濃度有關。例如，動脈粥樣硬化是一種緩慢進展型疾病，其經由動脈壁內膽固醇的蓄積而表征。證明脂質在動脈粥樣硬化病變中沉積理論的、令人矚目的證據主要來自于血漿LDL;因此，LDL已被普遍地認為是“有害的”膽固醇，相反，HDL血清濃度與冠心病成反比。事實上，HDL較高的血清濃度被認為是負向的風險因素。據假設，較高濃度的血 漿HDL不僅保護性地對抗冠狀動脈疾病，而且實際上可以誘導動脈粥樣硬化斑塊的消退(參見，如，Badimon等人，1992，Circulation86 (Suppl.111):86-94;Dansky 和 Fisher, 1999，Circulation 100:1762-63;Tangirala 等人，1999，CirculationlOO(17):1816-22;Fan 等人，1999，Atherosclerosisl47(I): 139-45;Deckert 等人,1999,CirculationlOO(I I):1230-35;Boisvert 等人，1999，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.19(3):525-30;Benoit 等人，1999，Circulation99(l):105-10;Holvoet 等人，1998，J.Clin.1nvest.102(2):379-85;Duverger等人,1996,Circulation94(4):713-17;Miyazaki 等人,1995,Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.15(11):1882-88;Mezdour 等人，1995，Atherosclerosisl13 (2):237-46;Liu 等 A , 1994, J.Lipid Res.35 (12): 2263-67; Plump 等人，1994，Proc.Nat.AcacLSc1.USA91 (20):9607-11;Paszty 等人,1994, J.Clin.1nvest.94(2):899-903;She 等人，1992，Chin.Med.J.(Engl) 105 (5): 369-73; Rubin 等人，1991，Nature353 (6341): 265-67;She 等人,1990, Ann.NY Acad.Sc1.598:339-51;Ran, 1989, Chung Hua Ping LiHsueh Tsa Chih (還翻譯為:Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi) 18 (4): 257-61; Quezado 等人，1995，J.Pharmacol.Exp.Ther.272(2):604-11;Duverger 等人，1996，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.16(12):1424-29;Kopfter 等人,1994, Circulation;90 (3):1319-27;Miller 等人,1985,Nature314(6006):109-11;Ha 等人,1992, Biochim.Biophys.Actal 125 (2):223-29;Beitz 等人，1992，Prostaglandins Leukot.Essent.FattyAcids47 (2):149-52).作為結論，HDL已被普遍認為是“有利的”膽固醇(參見，如，Zhang，等人，2003Circulationl08:661-663)oHDL的“保護性”作用在大量研究中得以證實(如，Miller等人，1977，Lancetl (8019):965-68;Whayne 等人,1981, Atherosclerosis39:411_19)。在這些研究中，LDL 升高的濃度似乎與增加的心血管風險相關，而較高的HDL濃度好像具有心血管保護作用。體內研究已經進一步證明了 HDL的保護作用，其顯示注入兔中的HDL可以阻礙膽固醇誘發的動脈病變的形成(Badimon等人，1989，Lab.1nvest.60:455-61)和/或可以誘導所述動脈病變消退(Badimon 等人,1990, J.Clin.1nvest.85:1234-41)。3.1膽固醇逆轉運、HDL和載脂蛋白A-1膽固醇逆轉運(RCT)通路起消除來自肝外大部分組織的膽固醇的作用并且對于維持機體內大部分細胞的結構和功能至關重要。RCT主要由以下三個步驟組成:(a)膽固醇外流，即，膽固醇最初由不同的外周細胞池的去除；(b)膽固醇酯化，其經由卵磷脂:膽固醇酰基轉移酶(LCAT)的作用而防止外流的膽固醇再次進入細胞中；以及(c)將HDL膽固醇和膽固醇酯攝取至肝細胞進行水解，然后進行再循環、貯存、在膽汁中分泌或代謝成膽酸。LCAT (RCT中的關鍵酶)由肝產生并在與HDL成分締合的血漿中進行循環。LCAT將源自細胞的膽固醇轉化為膽固醇酯，所述膽固醇酯在指定去除的HDL中被隔離(參見Jonas2000, Biochim.Biophys.Actal529 (1-3): 245-56)。膽固醇酯轉移蛋白(CETP)與磷脂轉移蛋白(PLTP)致力于循環的HDL群的進一步改造。CETP將LCAT生成的膽固醇酯運至其他的脂蛋白，特別是包括ApoB的脂蛋白，如VLDL和LDL。PLTP向HDL供應卵磷脂。HDL甘油三酯通過細胞外的肝甘油三酯脂肪酶進行代謝，并且脂蛋白膽固醇在肝中經由幾種機制而除去。HDL顆粒的功能特征主要通過它們的主要載脂蛋白組分,如ApoA-1和ApoA-1I而確定。還觀察到與 HDL 締合的微量 ApoC-1、ApoC_I1、ApoC_II1、ApoD、ApoA_IV、ApoE、ApoJ。HDL根據RCT代謝級聯或通路過 程的重構狀態而以多種不同的尺寸以及上述成分的不同混合物存在。
每個HDL顆粒通常包括至少I個分子的，并且通常包括2至4個分子的ApoA-1。如Prof.Gerd Assmann所描述的,HDL顆粒也可以只包括ApoE( Y-LpE顆粒),其還被認為負責膽固醇外流(參見，如，von Eckardstein 等人，1994，Curr Opin Lipidol.5 (6): 404-16)。ApoA-1作為前原載脂蛋白A-1 (preproapolipoprotein A-1)由肝和小腸合成，并作為原載脂蛋白A-1 (proapolipoprotein A-1) (proApoA-1)分泌且快速地發生裂解從而產生血
衆形式的ApoA-1-—種243個氨基酸的多肽鏈(Brewer等人，1978, Biochem.Biophys.Res.Commun.80:623-30)。在實驗中直接注射入血流的前原ApoA-1也可以裂解為血衆形式的 ApoA-1 (Klon 等人,2000, Biophys.J.79 (3): 1679-85; Segrest 等人,2000, Curr.0pin.Lipidol.11(2):105-15; Segrest 等人，1999，J.Biol.Chem.274(45): 31755-58)。ApoA-1包括6至8個不同的22-氨基酸a -單環或者包括經常為脯氨酸連接體部分間隔開的功能性重復。該重復單元以兩親的螺旋形構型存在(Segrest等人，1974，FEBSLett.38:247-53)并具有ApoA-1的主要生物學活性，即具有脂質結合和卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)活性。ApoA-1與脂質形成以下三種類型的穩定絡合物:稱為前-1HDL的、不含脂質的小絡合物；稱為前-2HDL的、包括極性脂質(磷脂和膽固醇)的平盤狀顆粒；以及稱為球狀或成熟HDUHDL3和HDL2)的、包括極性和非極性脂質的球狀顆粒。循環群中的大部分HDL包括 ApoA-1 和 ApoA-1I (“AI/AI1-HDL 成分”)。然而，只包括 ApoA-1 的 HDL 成分(“A1-HDL成分”)在RCT中表現更有效。一些流行病學研究證明了 Apo-A1-HDL成分抗動脈粥樣硬化的假設(Parra 等人,1992, Arterioscler.Thromb.12:701-07; Decossin 等人,1997, Eur.J.Clin.1nvest.27:299-307)。HDL由幾種具有不同尺寸、不同脂質組成和載脂蛋白組成的顆粒群制成。可以根據它們的性能而進行分離，所述性能包括其水合密度、載脂蛋白組成和荷電性能。例如，前-P-HDL的特征為具有比成熟a-HDL更少的表面電荷。由于這種電荷差異，而使得前-0 -HDL和成熟a -HDL在瓊脂糖凝膠中具有不同的電泳遷移率(David等人，1994，J.Biol.Chem.269(12):8959-8965)。`前-P-HDL與成熟a-HDL的代謝也不同。前-P-HDL具有以下兩種代謝歸宿:由血漿除去以及通過腎代謝或者是重構成優先通過肝降解的中等尺寸HDL (Lee等人，2004，J.Lipid Res.45 (4): 716-728)。盡管由細胞表面轉移膽固醇的機制(S卩，膽固醇外流)是未知的，但是仍認為不含脂質的絡合物、前-P-1HDL是RCT中涉及的外周組織所轉移的膽固醇的優選受體(參見 Davidson 等人，1994，J.Biol.Chem.269:22975-82;Bielicki 等人，1992，J.LipidRes.33:1699-1709; Rothblat 等人，1992，J.LipidRes.33:1091-97;以及 Kawano 等人，1993, Biochemistry32:5025-28;Kawano 等人,1997, Biochemistry36:9816-25)。在膽固醇由細胞表面募集的這種過程中，前-P -1HDL快速地轉化為前-P -2HDL。PLTP可以增加前-0-2HDL盤(disc)形成的速率，但缺少表明PLTP在RCT中的作用的數據。LCAT優先與盤狀的小(前-P ) HDL和球狀的(即成熟)HDL反應，而將卵磷脂或其他磷脂的2-酰基轉移至膽固醇的游離羥基殘基以形成膽固醇酯(保留在HDL中)和溶血卵磷脂。LCAT反應需要ApoA-1作為活化劑；S卩，ApoA-1是LCAT的天然輔因子。HDL中隔離的膽固醇至其酯的轉化防止了膽固醇重新進入細胞中，且凈結果為膽固醇由細胞除去。
ApoA1-HDL成分(即，包括ApoA-1而無ApoA-1I)中成熟HDL顆粒中的膽固醇酯經由肝除去并比源自包括ApoA-1和ApoA-1I的HDL (Al/AI1-HDL成分)的那些更有效地加工入膽汁中。這可部分地歸因于ApoA1-HDL至肝細胞膜的更有效的結合。已經假定存在HDL受體，并且已將B類I型清除劑受體(SR — BI)鑒別為HDL受體(Acton等人，1996，Science271:518-20;Xu 等人，1997，Lipid Res.38:1289-98)。SR—BI 在生成類固醇的組織(如，腎上腺)及肝中大量表達(Landschulz等人，1996，J.Clin.1nvest.98:984-95; Rigotti 等人，1996，J.Biol.Chem.271:33545-49)。對于 HDL 受體的綜述，參見 Broutin 等人的 1988, Anal.Biol.Chem.46:16-23。最初經由ATP-結合盒轉運子Al的脂化對于血漿HDL的形成以及對于前-0 -HDL顆粒的膽固醇外流能力而言是至關重要的(Lee和Parks, 2005, Curr.0pin.Lipidol.16(1): 19-25)。根據這些作者，這種最初的脂化使得前-P -HDL更有效地起膽固醇受體的作用并且防止了 ApoA-1與預存在的血漿HDL顆粒快速締合，從而得到前-P -HDL顆粒更強的膽固醇外流能力。CETP還可在RCT中起重要作用。CETP活性或其受體VLDL和LDL的變化在HDL群的“重構”中起重要作用。例如，在CETP不存在下，HDL變成不可清除的大顆粒。(對于RCT 和 HDL 的綜述，參見 Fielding 和 Fielding, 1995，J.Lipid Res.36:211-28; Barrans 等人,1996, Biochem.Biophys.Actal300:73-85;Hirano 等人,1997, Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.17(6): 1053-59)。HDL也可在其他脂質和非極性分子的逆轉運以及解毒作用中起重要作用，即，將脂質由細胞、器官和組織轉運至肝進行代謝和排泄。此類脂質包括鞘磷脂(SM)、氧化的脂質和溶血磷脂酰膽堿。例如，Robins 和 Fasulo (1997, J.Clin.1nvest.99:380-84)已經證明了HDL刺激植物留醇經由肝轉運入膽汁分泌物。HDL的主要組分ApoA-1可以與SM于體外締合。當使用牛腦SM (BBSM)對ApoA-1進行體外重構(reconstitu ted)時,在臨近BBSM相變溫度的溫度28°C下產生最大的重構率(Swaney, 1983，J.Biol.Chem.258(2)，1254-59)。在 BBSM: ApoA-1 比值為 7.5: I 或更低(wt/wt)時，形成了一種重構的均質HDL顆粒，每個顆粒包括三分子ApoA-1并且具有360: I的BBSM: ApoA-1摩爾比。該HDL顆粒在電子顯微鏡下為盤狀的絡合物，其類似于通過在磷脂/蛋白質升高的比值下將ApoA-1與磷脂酰膽堿進行重組而獲得的絡合物。然而，BBSM: ApoA-1比值為15: I (wt/wt)時，形成了具有較高磷脂:蛋白質摩爾比(535: I)的、較大直徑的盤狀絡合物。這些絡合物與使用磷脂酰膽堿形成的ApoA-1絡合物相比，明顯更大、更穩定并且對于變性更具抵抗力。初期膽固醇受體(前-P-HDL以及包括ApoE的遷移脂蛋白)中鞘磷脂(SM)的增多表明SM可以增強這些顆粒促進膽固醇外流的能力(Dass和Iessup, 2000, J.Pharm.Pharmacol.52:731-61; Huang 等人,1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:1834-38; Fielding和 Fieldingl995, J.Lipid Res.36:211-28)。3.2HDL和ApoA-1的保護機制近來對于HDL保護機制的研究焦點在于載脂蛋白A-1(ApoA-1)——HDL的主要組分。較高血漿濃度的ApoA-1與冠狀病變的缺失或減少有關(Maciejko等人，1983，N.Engl.J.Med.309:385-89; Sedlis 等人，1986，發行 73:978-84)。
在實驗動物中注入ApoA-1或HDL可產生顯著的生物化學變化，以致于降低了動脈粥樣硬化病變的程度及嚴重性。在Maciejko和Mao (1982, Arteriosclerosis〗:407a)、Badimon 等人(1989，Lab.1nvest.60:455-61; 1989，J.Clin.1nvest.85:1234-41)的最初報告之后，發現通過注入HDL(d=1.063-1.325g/ml)可顯著地降低喂食膽固醇的兔中動脈粥樣硬化病變的程度(降低45%)以及降低其膽固醇酯含量(降低58.5%)。他們還發現注入HDL可使確定的病變出現接近50%的消退。Esper等人(1987，Arteriosclerosis7:523a)已經證明注入HDL可以顯著地改變患有遺傳性高膽固醇血癥的、Watanabe兔的血漿脂蛋白組成，所述遺傳性高膽固醇血癥可發展成早期的動脈病變。在這些兔中，注入HDL可使保護性HDL與導致動脈粥樣硬化的LDL之間的比值超過兩倍。通過ApoA-1在體外發揮溶纖維蛋白活性的觀察結果進一步了解了 HDL在動物模型中預防動脈疾病的潛力(Saku 等人，1985, Thromb.Res.39:1_8)。RonnebergerC 1987, XthInt.Congr.Pharmacol,悉尼，990)證明 ApoA-1 可以增加 Beagle 犬與 Cynomologous 猴的血纖蛋白溶解。發現在體外的人血衆中具有類似的活性。Ronneberger能夠證實ApoA-1治療的動物中，脂質沉積和動脈斑塊形成的減少。
體外研究表明ApoA-1與卵磷脂的絡合物可以促進游離的膽固醇由培養的動脈平滑肌細胞外流(Stein 等人,1975, Biochem.Biophys.Acta, 380:106-18)。HDL 通過這種機制還可以減少這些細胞的增殖(Yoshida等人，1984，Exp.MoI Pathol.41:258-66)。也已證明使用包括ApoA-1或ApoA-1I模擬肽的HDL灌注療法通過ABCl轉運子而調節血漿HDL濃度，從而產生了治療心血管疾病的效力(參見，如，Brewer等人,2004, Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.24:1755-1760)。已經分離出ApoA-1的兩種天然形成的人突變體，其中精氨酸殘基變異為半胱氨酸。在載脂蛋白A-1 (ApoA-1m)中，這種取代出現在殘基173，而在載脂蛋白A-1巴黎(ApoA-1p)中，這種取代出現在殘基151 (Franceschini等人，1980，J.Clin.1nvest.66:892-900;Weisgraber 等人，1983，J.Biol.Chem.258:2508-13;Bruckert 等人，1997，Atherosclerosisl28:121-28;Daum 等人，1999，J.Mo1.Med.77:614-22;Klon等人，2000，Biophys.J.79 (3): 1679-85)。包括 ApoA_IM 或 ApoA-1p 二硫化物連接的同源二聚體的重構HDL顆粒與包括野生型ApoA-1的重構HDL顆粒相比，其清除二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)乳狀液的能力及其促進膽固醇外流的能力相似(Calabresi等人,1997b, Biochemistry36:12428-33;Franceschini 等人,1999, Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.19:1257-62;Daum 等人，1999，J.Mo1.Med.77:614-22)。在兩種突變體中，雜合的個體降低了 HDL的濃度，但是自相矛盾地是，其也降低了動脈粥樣硬化的風險(Franceschini 等人,1980, J.Clin.1nvest.66:892-900;Weisgraber 等人,1983, J.Biol.Chem.258:2508-13; Bruckert 等人，1997，Atherosclerosisl28:121-28)。盡管包括任一變體的重構HDL顆粒與包括野生型ApoA-1的重構HDL顆粒相比時具有降低的效力，但是其能夠活化 LCAT (Calabresi 等人,1997a, Biochem.Biophys.Res.Commun.232:345-49; Daum 等人，1999，J.Mo1.Med.77:614-22)。ApoA-1m突變體作為常染色體顯性性狀遺傳；并且已經鑒別了該家族內的八代載體(Gualandri 等人，1984，Am.J.Hum.Genet.37:1083-97)。單個 ApoA_IM 載體狀態的特征為顯著降低的HDL膽固醇濃度。盡管單個載體顯著降低HDL膽固醇濃度，但是其并未明顯地表現出任何增加的動脈疾病風險。事實上，通過研究系譜檔案發現這些受試者受到“保護”而使其免于動脈粥樣硬化(Sirtori等人，2001, Circulation, 103:1949-1954; Roma等人，1993，J.Clin.1nvest.91(4):1445-520)。ApoA-1m在載體突變體中的、可能的保護作用機制似乎與ApoA-1m突變體的結構修飾有關，而在該結構中，缺失了一個a -螺旋并且增加了暴露的疏水性殘基(Franceschini等人，1985，J.Biol.Chem.260:1632-35)。多個a -螺旋緊密結構的缺失使該分子的柔韌性增加，而所述分子與常規的ApoA-1相比，更易于與脂質締合。此外，載脂蛋白-脂質絡合物對變性更敏感，從而表明在突變體中，也可以改善脂質的遞送。Bielicki 等人(1997，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.17 (9): 1637-43)已經證明ApoA-1m與野生型ApoA-1相比，具有募集膜膽固醇的有限能力。此外，由ApoA_IM與膜脂質締合而形成的初生HDL主要是7.4nm的顆粒而不是由野生型ApoA-1形成的、較大的9-和
11-nm的絡合物。這些觀察結果表明在ApoA-1基本序列中Arg173 — Cys173的取代干擾了細胞膽固醇募集和初生HDL集結的正常過程。該突變明顯與膽固醇由細胞除去的、降低的效力有關。因此，其導致動脈粥樣硬化的性質可能與RCT無關。歸因于Arg173 — Cys173取代的、最顯著的結構變化是ApoA_IM的二聚作用(Bielicki 等人，1997，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.17(9):1637-43)。ApoA_IM 可以與自身形成同源二聚體而與ApoA-1I形成異源二聚體。對于包括載脂蛋白混合物的血液成分的研究表明，循環中二聚體和絡合物的存在是造成載脂蛋白消除半衰期延長的原因。已在載體突變體的臨床研究中觀察到此類消除半衰期的延長(Gregg等人，1988，NATOARff on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to PhenotypicExpression, LimoneS G)。其他研究表明 ApoA_IM 二聚體(ApoA-1M/ApoA_IM)可在體外的 HDL顆粒互變中起抑制因子的作用(Franceschini等人，1990，J.Biol.Chem.265:12224-31 )。3.3目前用于血脂異常及相關失調的治療脂質代謝紊亂是與升高的血清膽固醇和甘油三酯濃度以及較低的血清HDL:LDL比值相關的疾病，并且其包括高脂血癥(特別是高膽固醇血癥)、冠心病、冠狀動脈疾病、血管和血管周圍疾病、以及諸如動脈粥樣硬化的心血管疾病。也可以包括與動脈粥樣硬化相關的綜合征，比如由動脈機能不全引起的間歇性跛行。目前具有大量可用于降低與脂質代謝紊亂相關的、高血清膽固醇和甘油三酯的治療。但是，鑒于療效、副作用和患病人群，而使得每種治療具有各自的缺點和不足。膽汁酸結合樹脂是一類中斷膽汁酸由腸至肝的再循環的藥物，如消膽胺(Questran Light ,Bristol-Myers Squibb)和鹽酸考來替泊(Colestid'Upjohn 公司)。當口服時，這些帶正電荷的樹脂在腸中與帶負電荷的膽汁酸結合。由于所述樹脂不能由腸吸收，因此它們攜帶著膽汁酸一起排出。但是，此類樹脂的使用充其量只能將血清膽固醇濃度降低約20%，而且其與以下的胃腸副作用有關——包括便秘和一些維生素缺乏癥。此外，由于所述樹脂也可以結合其他的藥物，因而必須在所述樹脂攝入前至少一個小時或者攝入之后四至六小時才能服用其他的口服藥物，從而使得心臟病患者的用藥方案復雜化。抑制素(statins)是降膽固醇藥物，其通過抑制膽固醇生物合成通路中所涉及的關鍵HMGCoA還原酶而阻斷膽固醇的合成。抑制素有時可結合膽汁酸結合樹脂使用，所述抑制素的例子如洛伐他汀(Mevacor )、辛伐他汀(Zocor )、普伐他汀(Pravachol )、氟伐他汀(Lescof)和阿伐他汀(Lipitor )。抑制素顯著降低血清膽固醇和血清LDL的濃度，并且延緩冠狀動脈粥樣硬化的進程。然而，血清HDL膽固醇的濃度僅中等地增加。LDL作用減弱的機制可能涉及VLDL濃度的降低以及LDL受體細胞表達的誘導，而其造成了產量減少和/或LDL代謝增強。包括肝和腎功能障礙的副作用與這些藥物的使用有關(PhysiciansDesk Reference,第 56 版，2002) Medical Economics)。煙酸(尼克酸)是一種水溶性的維生素B-絡合物，其作為食物添加物和抗高血脂藥使用。煙酸減少了 VLDL的形成并且在降低LDL方面是有效的。在一些情況中，煙酸與膽汁酸結合樹脂結合使用。當煙酸以足夠的劑量使用時，可以增加HDL，但是當以這樣高的劑量使用時，其有效性受到嚴重副作用的限制。Niaspaif是一種延長釋放的煙酸形式，其與純煙酸相比產生更少的副作用。煙酸/洛伐他汀(Nicostatin )是一種含有煙酸和洛伐他汀的制劑，其聯合了每種藥物的益處。貝特類藥物(Fibrates)是一類降脂質藥物，其用于治療各種形式的高脂血癥(SP，血清甘油三酯升高)，所述高脂血癥也可以與高膽固醇血癥有關。貝特類藥物似乎減少了VLDL成分并且適當地增加了 HDL，但是，這些藥物對于血清膽固醇的作用卻是可變的。在美國，貝特類藥物如氯貝丁酯(Atromid-S )、非諾貝特(Tricor )和苯扎貝特(Bezalip*')已被批準作為降血脂藥使用，但仍未獲得批準用作高膽固醇血癥藥物。例如，氯貝丁酯是一種降血脂藥，其(經由未知的機制)通過減少VLDL成分而起降低血清甘油三酯的作用。盡管在某些患者亞群中可以降低血清膽固醇，但是其對于藥物的生物化學反應是可變的，并且不可能總是預知哪名患者將獲得有利的結果。Atromid-S8'未表現出預防冠心病的療效。化學和藥理學相關的藥物吉非貝齊(Lopicf )是一種脂質調節劑，其中等地降低血清甘油三酯和VLDL膽固醇，并中等增加HDL膽固醇——HDL2和HDL3亞成分以及ApoA-1和A-1I(匡口，AI/AMT-HDL成分)。但是,該脂質應答是不均勻的(heterogeneous),特別是在不同的患者群體中。此外，盡管在無冠心病史或存在冠心病癥狀的、40-55歲之間的男性患者中觀察到了冠心病的預防作用，但是卻不能將這些結果明確地外推至其他的患者群體(如，婦女、老年人和較年輕的男性)。事實上，在患有確定的冠心病的患者中并未觀察到療效。嚴重的副作用與貝特類藥物的使用有關，而所述副作用包括毒性作用，如惡性腫瘤(特別是胃腸癌)、膽囊疾病以及非冠狀死亡發 生幾率的增加。認為口服雌激素補償療法可以用于減輕絕經后婦女的高膽固醇血癥。然而，HDL的增加可能伴有甘油三酯的升高。當然，雌激素治療受限于具體的患者群體(絕經后婦女)并且與嚴重的副作用有關，而所述副作用包括誘發惡性腫瘤、膽囊疾病、血栓栓塞性疾病、肝腺瘤、血壓升高、葡萄糖耐受不良以及高鈣血癥。其他可用于治療高脂血癥的藥物包括依澤替米貝(Zetia ; Merck),其阻斷或抑制膽固醇的吸收。但是，依澤替米貝的抑制劑已顯示出某種毒性。因此，存在對安全藥物的需求，該藥物能夠更有效地降低血清膽固醇、增加HDL血清濃度、預防和/或治療血脂異常和/或與血脂異常相關的疾病、病癥和/或失調。例如，HDL以及與磷脂絡合的、重組形式的ApoA-1可以起用于以下非極性或兩親性分子的吸收劑/清除劑的作用，所述非極性或兩親性分子如膽固醇及衍生物(氧留醇、氧化的留醇、植物留醇等)、膽固醇酯、磷脂及衍生物(氧化的磷脂)、甘油三酯、氧化產物和酯多糖(LPS)(參見，如，Casas 等人，1995，J.Surg.Res.Nov59 (5): 544-52)。HDL 還可以起TNF-a及其他淋巴因子的清除劑的作用。HDL還可以起人血清對氧磷酶的載體的作用，所述人血清對氧磷酶如P0N-1、-2、-3。對氧磷酶是一種與HDL締合的酯酶，其對于保護細胞組分對抗氧化是重要的。LDL的氧化在氧化應激過程中產生，其似乎與動脈粥樣硬化的形成有直接關聯(Aviram, 2000, Free Radic.Res.33Suppl: S85-97)。對氧磷酶似乎在動脈粥樣硬化和心血管疾病的易受性方面起重要作用(Aviram, 1999，Mo1.Med.Today5 (9): 381-86)。人血清對氧磷酶(P0N-1)與高密度脂蛋白(HDL)結合。其活性與動脈粥樣硬化呈負相關。P0N-1水解有機磷酸酯并且可以通過抑制HDL和低密度脂蛋白(LDL)的氧化而保護免受動脈粥樣硬化(Aviram, 1999, Mo1.Med.Today5 (9):381_86)。實驗研究表明這種保護作用與P0N-1水解氧化的脂蛋白中的特異性脂質過氧化物的能力有關。保持或促進P0N-1活性的干預可有助于延緩動脈粥樣硬化與冠心病的發作。HDL進一步具有抗血栓藥和纖維蛋白原還原劑的作用以及作為失血性休克藥物的作用(Cockerill等人，W001/13939，2001年3月I日公布)。HDL，特別是ApoA-1，其已被證明使敗血癥產生的酯多糖順利地交換為包括ApoA-1的脂質顆粒，從而功能性的中和了所述酯多糖(Wright等人，W09534289，1995年12月21日公布；Wright等人，1999年7月27日發行的美國專利第5，928，624號；Wright等人，1999年8月3日發行的美國專利第5，932，536 號)。然而，由于治療施用需要大量的載脂蛋白以及由于蛋白質生產昂貴的成本、對于較低的生產總收率的考慮，使得目前ApoA-1、ApoA-1m, ApoA-1p及其他變體、以及重構HDL的治療使用受到了限制。早期的臨床試驗已經表明用于治療心血管疾病的劑量范圍為每次輸注1.5-4g之間的蛋白質。完全治療所需的輸注次數是未知的。(參見，如,Eriksson 等人,1999, CirculationlOO (6): 594-98; Carlson,1995, Nutr.Metab.Cardiovasc.Dis.5:85-91;Nanjee 等人，2000，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.20 (9):2148-55;Nanjee 等人，1999，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.19 (4):979-89;Nanjee 等人，1996，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.16 (9): 1203-14)。因此，需要開發用于治療和/或預防脂質代謝疾病、病癥和/或紊亂的新方法。 不應將本申請第2部分或任何其他部分中的任何參考文獻的引證或標識解釋為同意此類參考文獻是作為本發明的現有技術而提供。
4.
發明內容
本公開提供了荷電的脂蛋白絡合物、包括該絡合物的組合物以及使用該絡合物治療和/或預防多種失調和病癥的方法，所述失調和病癥包括血脂異常和/或與其相關的各種疾病、失調和/或病癥。該絡合物一般為脂蛋白，其包括兩種成分(載脂蛋白成分和脂質成分)，并且包括作為關鍵成分的、特定量的荷電磷脂(或兩種或多種不同的、通常類似荷電的磷脂混合物)。該荷電磷脂在生理PH下可具有正電荷或負電荷，但是在多種實施方案中為負電荷，在一些實施方案中，該荷電的磷脂包括一種或多種磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酸。所述載脂蛋白成分包括一種或多種蛋白質、肽或肽類似物，所述蛋白質、肽或肽類似物能夠使包括在絡合物中的膽固醇流動(稱為“載脂蛋白”)。這樣的載脂蛋白的具體實例是ApoA-1。其他的具體實例在下文作進一步描述。所述脂質成分通常包括一種或多種中性的磷脂和荷電的磷脂，并且可以任選的包括其他的脂質，例子如甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯、溶血磷脂及其各種類似物和/或衍生物。在一些實施方案中，荷電的脂蛋白絡合物不包括此類任選的脂質。中性的磷脂可以是在生理pH下具有凈電荷約為零的任何磷脂。在一些實施方案中，所述中性的磷脂是在生理PH下具有凈電荷約為零的兩性離子。在一些實施方案中，所述中性的磷脂包括卵磷脂(也稱為磷脂酰膽堿或“PC”)。在一些實施方案中，所述中性的磷脂包括鞘磷脂(“SM”)。在一些實施方案中，所述中性的磷脂包括卵磷脂與SM的混合物。在荷電的脂蛋白絡合物的多個實施方案中，脂質成分包括卵磷脂或SM、至少一種荷電的磷脂、以及其他任選的脂質的，所述脂蛋白絡合物被稱為“三元”絡合物，原因是它們包括以下三種“主要”的組分:載脂蛋白、卵磷脂或鞘磷脂、以及荷電的磷脂。在荷電的脂蛋白絡合物的多個實施方案中，脂質成分包括卵磷脂和SM、至少一種荷電的磷脂、以及其他任選的脂質的，所述脂蛋白絡合物被稱為“四元”絡合物。該荷電脂蛋白絡合物的、包括脂質成分的荷電磷脂的總量可以改變，但是其范圍通常為約0.2至10wt%。在一些實施方案中，所述脂質成分包括約為總量0.2至2wt%、0.2至 3wt%、0.2 至 4wt%、0.2 至 5wt%、0.2 至 6wt%、0.2 至 7wt%、0.2 至 8wt% 或 0.2 至 9wt% 的荷電磷脂。在一些實施方案中，所述脂質成分包括約為總量0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8、
0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、
2.8,2.9或3.0wt%的荷電磷脂，和/或包括任何將這些值作為端點的范圍。在一些實施方案中，所述脂質成分包括約為總量 0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2,1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9 或 3.0wt% 的荷電磷脂，一直到約為總量4、5、6、7、8、9或10wt%的荷電磷脂。包括脂質成分的中性磷脂的總量也可以改變，并且其取決于所包括的荷電磷脂與任何任選脂質的量。在不包括任選脂質的實施方案中，所述脂質成分通常將包括約為總量90至99.8wt%的中性磷脂。如上所述，該中性磷脂可以包括卵磷脂、SM或卵磷脂與SM的混合物。卵磷脂和/或SM可以包括該中性磷脂的塊(bulk),或者可選地,除卵磷脂和/或SM之外,該中性磷脂還可以包括中性磷脂。在中性磷脂包括卵磷脂而不包括SM的實施方案中，該中性磷脂通常包括約5至100wt%的卵磷脂。在一些實施方案中，該中性磷脂包括100wt%的卵磷脂。在中性磷脂包括SM而不包括卵磷脂的實施方案中，該中性磷脂通常包括約5至100wt%的SM。在一些實施方案中，該中性磷脂包括100wt%的SM。在中性磷脂包括卵磷脂與SM的混合物的實施方案中，包括全部中性磷脂的混合物的量以及該混合物包括的卵磷脂與SM的相對量(S卩，卵磷脂:SM的摩爾比)可以改變。通常，該中性磷脂將包括約5至100wt%的卵磷脂/SM混合物。在一些實施方案中，該中性磷脂所包括的全部為卵磷脂與SM (即，卵磷脂與SM的10(^丨％混合物)。卵磷脂與SM的摩爾比(卵磷脂:SM)可以改變，但其范圍通常為約20: I至I: 20。在一些實施方案中，卵磷脂:SM的摩爾比范圍為約10: 3至10: 6。在其他實施方案中，卵磷脂:SM的摩爾比范圍為約1: 20至3: 10。
如果包括任選的脂質，其通常包括約50wt%或更少的脂質成分。在一些實施方案中，該脂質成分包括低于總量約30wt%的任選脂質。在特定的實施方案中，所述脂質成分包括低于總量約5wt%、10wt%或20wt%的任選脂質。所述荷電脂蛋白絡合物中脂質與載脂蛋白的摩爾比也可以改變。在一些實施方案中，所述荷電脂蛋白絡合物包括脂質:載脂蛋白的摩爾比范圍為約2: I至約200: I。在一些實施方案中，脂質:載脂蛋白的摩爾比為約50: I。此處描述的荷電脂蛋白絡合物可以采用多種形狀、尺寸和形式，其范圍可以從膠束結構至類似于天然形成的前-P HDL顆粒的小盤狀顆粒，至類似于天然形成的a -HDL顆粒的較大的盤狀顆粒，至類似于天然形成的HDL2或HDL3的大球形顆粒。如本領域已知的，可以通過調節包括脂質成分的脂質的組成與重量(或摩爾)比、以及調節脂質:載脂蛋白的摩爾比而控制此處描述的荷電脂蛋白絡合物的期望尺寸和形狀(參見，如，Barter等人，1996，J.Biol.Chem.271:4243-4250)。在一些實施方 案中，所述荷電的脂蛋白絡合物為盤狀顆粒形式，其中所述脂質成分基本上由約為總量90至99.8wt%的全中性磷脂與約為總量0.2至10被％的全負電荷磷脂組成。該盤狀顆粒可以大(如，具有約10至14nm的扁圓徑)或小(如,具有約5至IOnm的扁圓徑)。如本領域已知的，可以通過調節脂質:載脂蛋白的摩爾比而控制該盤狀顆粒的尺寸(參見，如，Barter等人，1996，見上)。例如,可以使用尺寸排阻柱色譜法(size exclusioncolumn chromatography)來測定顆粒的尺寸。藥物組合物通常包括如此處所描述的荷電脂蛋白絡合物，并且可以任選地包括一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。在一些實施方案中，將該藥物組合物包裝成適于施用的單位劑量。例如，在一些實施方案中，將包括單位劑量干燥的(例如凍干)荷電脂蛋白絡合物的組合物包裝于密封瓶中。此類組合物適合用水、生理溶液(比如鹽水)或緩沖液重構，并經由注射施用。此類組合物可以任選地包括一種或多種促進該荷電絡合物重構的抗粘結劑和/或抗凝劑，或者包括一種或多種經設計用以調節重構的混懸液的pH、滲透壓和/或鹽度的緩沖劑、糖或鹽(如氯化鈉)。預期此處描述的荷電脂蛋白絡合物和組合物可影響和/或促進膽固醇外流和/或消除膽固醇，并由此預期所述絡合物和組合物可用于治療和/或預防多種病癥和失調，例子包括血脂異常和/或與血脂異常相關的或者與脂質消耗、聚集或排除(如，脂肪沉著、細胞降解)/或非極性分子(比如毒素、外援物等)相關的疾病、病癥和/或失調。可以使用此處描述的荷電脂蛋白絡合物和組合物進行治療或預防的此類疾病、失調和/或相關的病癥的非限制性實例包括外周血管病、高血壓、炎癥、阿爾茨海默病、再狹窄、動脈粥樣硬化以及動脈粥樣硬化的多種臨床表現，例子如休克、失血性休克、短暫性腦缺血發作、心肌梗死、急性冠狀動脈綜合征、心絞痛、腎血管性高血壓、腎血管機能不全、間歇性跛行、嚴重的肢體缺血、靜止痛和壞疽。該方法通常包括向受試者施用足以治療或預防特定適應癥的、有效量的此處描述的荷電脂蛋白絡合物或藥物絡合物(composition)。該絡合物和/或組合物可以單獨施用(作為單一療法)，或者可選地，它們可以配合其他的治療劑一起施用，該治療劑可用于治療和/或預防血脂異常和/或與血脂異常相關的病癥、疾病和/或失調。可以與此處描述的荷電脂蛋白絡合物和組合物配合施用的治療劑的非限制性實例包括膽汁酸結合樹脂、HMGCoA還原酶抑制劑(抑制素)、煙酸、樹脂、膽固醇吸收抑制劑和貝特類藥物。盡管不預期受到任何操作的理論束縛，但仍認為包括脂質成分的荷電磷脂使得此處描述的荷電脂蛋白絡合物和組合物具有優于常規脂蛋白絡合物的、改善的治療性能。小的盤狀前-P HDL與大的盤狀和/或球形HDL之間的一個關鍵區別在于顆粒的電荷，其中所述小的盤狀前-P HDL在腎中降解，而所述大的盤狀和/或球形HDL被肝識別，在肝中進行膽固醇的貯存、再循環、代謝(作為膽汁酸)或消除(在膽汁中)。所述小的盤狀前-P HDL與具有負電荷的所述大的盤狀和/或球形HDL相比，具有更少的表面負電荷。盡管不預期受到任何操作的理論束縛，但仍認為較多的負電荷是觸發肝識別顆粒的因素之一，并且由此避免了經由腎代謝所述顆粒。此處描述的荷電脂蛋白絡合物和組合物比常規的脂蛋白絡合物在循環中停留更長時間的看法可部分歸因于荷電磷脂的存在，或者該電荷可以電荷依賴的方式影響所述脂蛋白的半衰期。期望脂蛋白較長的循環(滯留)時間有利于膽固醇流動(使該絡合物具有更多的時間以蓄積膽固醇)和酯化(為LCAT提供更多的時間以催化酯化反應)。該電荷還可提高捕獲和/或除去膽固醇的幾率，從而促使大量的除去膽固醇。因而，期望此處描述的荷電脂蛋白絡合物和組合物能夠提供優于常規脂蛋白治療的治療益處，而卻只需施用更少的絡合物和/或組合物，以及施用更少的次數。本發明還涉及以下項:1.一種重構的荷電脂蛋白絡合物，其包括載脂蛋白成分和脂質成分，其中所述脂質成分包括中性磷脂以及約0.2至3wt%的荷電磷脂。2.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂包括卵磷脂或鞘磷脂。3.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂包括卵磷脂與鞘磷脂的混合物。4.根據項3所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述卵磷脂:鞘磷脂的摩爾比范圍為約100: 5至5: 100。5.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質成分進一步包括任選的脂質。6.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質:載脂蛋白的摩爾比范圍為約2: I至200: 1，其中載脂蛋白的值以ApoA-1當量表示。7.根據項6所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質:載脂蛋白的摩爾比范圍為約20:1至60:1。8.根據項6所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質:載脂蛋白的摩爾比范圍為約50: I。9.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其包括約2-4當量的ApoA-1、約I分子荷電磷脂以及約400分子中性磷脂。10.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其包括約2-4當量的、約I分子荷電磷脂以及約200分子中性磷脂。11.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酰肌
醇。 12.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酰絲氨酸。13.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酸。14.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酰甘油。15.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂選自磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸及其混合物。16.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述鞘磷脂包括D-赤蘚糖_鞘憐脂和/或D-赤鮮糖-二氫鞘憐脂。17.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂和/或所述荷電磷脂的酰基鏈彼此相互獨立地選自含有6至24個碳原子的、飽和、單不飽和以及多不飽和烴。18.根據項17所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂和/或所述荷電磷脂的每條酰基鏈相同。19.根據項17所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂和/或所述荷電磷脂的每條酰基鏈不同。20.根據項17所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂和所述荷電磷脂的所述酰基鏈含有相同數目的碳原子。21.根據項17所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述中性磷脂和所述荷電磷脂的所述酰基鏈具有不同的飽和度。22.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白選自前原載脂蛋白、前原 ApoA-1、原 ApoA-1、ApoA-1、前原 ApoA-1 1、原 ApoA-1 1、ApoA-1 1、前原 ApoA-1V、原ApoA-1V、ApoA-1V、ApoA_V、前原 ApoE、原 ApoE、ApoE、前原 ApoA-1 米蘭、原 ApoA-1 米蘭、ApoA-1米蘭、前原ApoA-1巴黎、原ApoA-1巴黎和ApoA-1巴黎及其混合物。23.根據項22所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白包括同源二聚體和/或異源二聚體。24.根據項22所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白包括單體。25.根據項I所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白包括ApoAI肽模擬物。26.一種重構的荷電脂蛋白絡合物，其包括載脂蛋白成分和脂質成分，其中所述脂質成分基本上由卵磷脂、鞘磷脂以及約I至10wt%的荷電磷脂組成。27.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質成分含有約I至4wt%的所述荷電磷脂。 28.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質成分含有約I至3wt%的所述荷電磷脂。29.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質成分含有約I至2wt%的所述荷電磷脂。30.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酰肌醇。31.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酰絲氨酸。32.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酸。33.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂包括磷脂酰甘油。34.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂選自磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油及其混合物。35.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質:載脂蛋白的摩爾比范圍為約2: I至200:，其中載脂蛋白的值以ApoA-1當量表示。36.根據項35所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質:載脂蛋白的摩爾比為約50: I。37.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白選自前原載脂蛋白、前原 ApoA-1、原 ApoA-1、ApoA-1、前原 ApoA-1 1、原 ApoA-1 1、ApoA-1 1、前原 ApoA-1V、原ApoA-1V、ApoA-1V、ApoA_V、前原 ApoE、原 ApoE、ApoE、前原 ApoA-1 米蘭、原 ApoA-1 米蘭、ApoA-1米蘭、前原ApoA-1巴黎、原ApoA-1巴黎和ApoA-1巴黎及其混合物。38.根據項37所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白為同源二聚體
和/或異源二聚體。39.根據項37所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白為單體。40.根據項26所述 的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述載脂蛋白包括ApoAI模擬物。41.根據項26所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其基本上由2-4當量的ApoA_1、2分子荷電磷脂、50-80分子卵磷脂以及20-50分子SM組成。42.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其基本上由2-4當量的ApoA_1、2分子荷電磷脂、50分子卵磷脂以及50分子SM組成。43.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其基本上由2-4當量的ApoA-1、2分子荷電磷脂、80分子卵磷脂以及20分子SM組成。44.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其基本上由2-4當量的ApoA-1、2分子荷電磷脂、70分子卵磷脂以及30分子SM組成。45.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其基本上由2-4當量的ApoA-1、2分子荷電磷脂、60分子卵磷脂以及40分子SM組成。46.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述2-4當量的ApoA-1為2~4 分子的 ApoA-1。47.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述2-4當量的ApoA-1為
1-2分子的ApoA-1m 二聚體。48.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述2-4當量的ApoA-1為
12-40分子的單螺旋ApoA-1模擬肽。49.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述卵磷脂選自POPC、DPPC及其混合物。50.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述SM選自D-赤蘚糖-鞘磷脂、D-赤蘚糖-二氫鞘磷脂及其混合物。
51.根據項41所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述荷電磷脂選自磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸及其混合物。52.一種藥物組合物，其包括根據項1-51任一所述的荷電脂蛋白絡合物以及藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。53.一種在受試者中治療血脂異常或與血脂異常相關的疾病的方法，其包括向受試者施用有效量的、根據項1-51任一所述的荷電脂蛋白絡合物。54.根據項53所述的方法，其中所述荷電脂蛋白絡合物的施用量可有效地使受試者中游離或絡合的載脂蛋白的血清濃度與基線水平相比升高約10-300mg/dL。55.根據項53所述的方法，其中所述荷電脂蛋白絡合物的施用量范圍為每次注射約 I 至 100mg/kg 當量的 ApoA-1。56.根據項53所述的方法，其中所述荷電脂蛋白絡合物經靜脈內施用。57.根據項53所述的方法，其施用于治療血脂異常。58.根據項53所述的方法，其施用于治療與血脂異常相關的疾病。59.根據項53所述的方法，其中所述荷電脂蛋白絡合物可與膽汁酸樹脂、煙酸、抑制素、貝特類藥物和/或膽固醇吸收抑制劑一起輔助施用。60.根據項53所述的方法，其中所述荷電脂蛋白絡合物以藥物組合物的形式施用，所述藥物組合物包括荷電的絡合物以及藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。5.附圖簡述
圖1提供了由原Ap o-AI (33wt%)和鞘磷脂(67wt%)組成的、未荷電脂蛋白絡合物的色譜圖；圖2提供了由原Apo-AI (33wt%)、鞘磷脂(65wt%)和磷脂酰甘油(2wt%)組成的荷電脂蛋白絡合物實施方案的色譜圖；圖3提供了繼施用對照、未荷電的脂蛋白絡合物(曲線標記為IIA)或如此處所描述的荷電脂蛋白絡合物實施方案(曲線標記為IIB)之后，兔的HDL中作為時間函數測量的游離膽固醇總量的曲線圖；以及圖4提供了繼施用對照、未荷電的脂蛋白絡合物(組IIA，兩只動物)或如此處所描述的荷電脂蛋白絡合物實施方案(組IIB，兩只動物)之后，兔的HDL中作為時間函數測量的游離膽固醇平均量的曲線圖。
6.
具體實施例方式除了其他事物之外，本公開提供了荷電的脂蛋白絡合物及組合物，其可用于治療和/或預防血脂異常和/或與血脂異常相關的疾病、失調和/或病癥。如發明內容部分所討論的，該荷電的脂蛋白絡合物包括兩種主要的成分——載脂蛋白成分和脂質成分，并且包括作為關鍵成分的、特定量的一種或多種荷電磷脂。該荷電的脂蛋白絡合物可以由天然來源分離，比如由人血清分離(此處稱為“分離的荷電脂蛋白絡合物”)，或者所述荷電的脂蛋白絡合物可以由其單獨組分制備或重構(此處稱為“重構的荷電脂蛋白絡合物”)。與本領域技術人員所理解的一樣，由于可以選擇性地控制重構的荷電脂蛋白絡合物各種組分的特性與數量，因而該重構的荷電脂蛋白絡合物在多種應用中是有利的。
6.1載脂蛋白與載脂蛋白肽荷電的脂蛋白絡合物中包括載脂蛋白成分的載脂蛋白的性質并不是成功的關鍵所在。事實上，任何提供如此處所描述的治療和/或預防益處的載脂蛋白和/或其衍生物或類似物均可包括在該荷電的絡合物中。此外，由于任何a螺旋肽或肽類似物或任何其他類型的“模擬”載脂蛋白活性的分子(例子如ApoA-1)在與脂質締合時可活化LCAT或形成盤狀的顆粒，因此其可包括荷電的絡合物，并且由此而包括在“載脂蛋白”的定義內。適宜的載脂蛋白的實例包括但不限于前原載脂蛋白形式的ApoA-1、ApoA-11、ApoA-1V、ApoA-V 和 ApoE ;原形式和成熟形式的人 ApoA-1、ApoA-1I> ApoA-1V 和 ApoE ；以及活化的多晶型、異構型、變體和突變體以及截斷形式，其中最常見的是ApoA-1m (ApoA-1m)和ApoA-1p (ApoA-1pX還已知載脂蛋白突變體含有半胱氨酸殘基，并且也可使用(參見，如，U.S.2003/0181372)。載脂蛋白可以是單體或二聚體形式，而所述二聚體可以為同源二聚體或異源二聚體。例如，可以使用以下的同源二聚體和異源二聚體(切實可行的):原 ApoA-1 和成熟 ApoA-1 (Duverger 等人，1996，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.16(12):1424-29),ApoA-1m (Franceschini 等人，1985，J.Biol.Chem.260:1632-35)、ApoA-1pCDaum 等人，1999，J.Mo1.Med.77:614-22),ApoA-1KShelness 等人，1985，J.Biol.Chem.260(14):8637-46;Shelness 等人，1984，J.Biol.Chem.259(15):9929-35)、ApoA-1V(Duverger 等人,1991, Eur0.J.Biochem.201 (2): 373-83)、ApoE (McLean 等人,1983, J.Biol.Chem.258(14):8993-9000), ApoJ和ApoH。載脂蛋白可以包括與促進其分離的元件(比如His標簽)或經設計用于其他目的的其他元件相應的殘基，只要當該載脂蛋白包括在絡合物中時能夠保留某些生物活性即可。如本領域所公知的，此類載脂蛋白可以由動物來源進行純化(特別是由人類來源)或者進行重組生產，參見，如 ，Chung 等人，1980，J.Lipid Res.21 (3): 284-91; Cheung等人，1987，J.Lipid Res.28(8):913-29.還可參見美國專利第 5，059，528,5, 128，318、6，617，134 號以及美國公布文本第 20002/0156007、2004/0067873、2004/0077541 和2004/0266660 號。適合作為載脂蛋白用于此處描述的荷電絡合物及組合物中的、與載脂蛋白相應的肽和肽類似物以及模擬ApoA-1、ApoA-1m, ApoA-1I, ApoA-1V和Ap0-E活性的激動劑的非限制性實例在以下文獻中公開:美國專利第6，004, 925,6, 037, 323和6，046, 166號(授予Dasseux等人)；美國專利第5，840，688號(授予Tso);美國公布文本2004/0266671、2004/0254120,2003/0171277 和 2003/0045460 (Fogelman 的)；以及美國公布文本2003/0087819(Bielicki的)，通過引用將其全部公開內容并入本文。這些肽和肽類似物可以包括L-氨基酸或D-氨基酸或者包括L-氨基酸與D-氨基酸的混合物。所述肽和肽類似物還可以包括一種或多種非肽或酰胺鍵合，比如一種或多種公知的肽/酰胺等排物。可以使用本領域已知的任何肽合成技術來合成或制備此類“肽和/或肽模擬物”載脂蛋白，所述肽合成技術包括，如美國專利第6，004, 925,6, 037，323和6，046，166號中描述的技術。該荷電的絡合物可以包括單種類型的載脂蛋白，或者包括兩種或多種不同的載脂蛋白的混合物，所述兩種或多種不同的載脂蛋白可以源自相同或不同的物種。盡管不需要，但是該荷電的脂蛋白絡合物仍優先地包括源自受治療動物物種的氨基酸序列的載脂蛋白或與其相應的載脂蛋白，以避免產生對治療免疫應答的誘導作用。載脂蛋白肽模擬物的使用還可以誘導或避免產生免疫應答。6.2 磷脂荷電的絡合物及組合物的脂質成分包括以下兩種類型的磷脂:中性磷脂和荷電磷月旨。如此處所用，“中性磷脂”是在生理PH下凈電荷約為零的磷脂。雖然其他類型的凈電荷中性磷脂是已知并可以使用的，但是在多種實施方案中，該中性磷脂為兩性離子。該中性磷脂包括卵磷脂和/或SM中的一種或兩種，并且可以任選地包括其他中性磷脂。在一些實施方案中，所述中性磷脂包括卵磷脂但不包括SM。在其他實施方案中,所述中性磷脂包括SM但不包括卵磷脂。在又一實施方案中，所述中性磷脂包括卵磷脂和SM。除了卵磷脂和/或SM之外,所有這些具體示例的實施方案還可包括中性磷脂,但在多種實施方案中，并不包括此類額外的中性磷脂。使用的SM的特性并不是成功的關鍵所在。因此，如此處所用，“SM”的表達不僅包括源自天然來源的鞘磷脂，而且包括與天然形成的SM—樣的、不受LCAT水解影響的天然形成的SM的類似物和衍生物。SM是一種結構極類似于卵磷脂的磷脂，但是其與卵磷脂不一致之處在于其不具有甘油骨架，并由此而不具有結合酰基鏈的酯鍵。相反，SM具有神經酰胺骨架，在該骨架中酰胺鍵與酰基鏈連接。SM并不是LCAT的底物，并且其通常不能被LCAT水解。但是，SM可以起LCAT抑制劑的作用或者可以通過稀釋底物磷脂的濃度而降低LCAT的活性。由于SM未被水解，因此其在循環中可滯留更長的時間。預期這種特征可使包括SM的、荷電的脂蛋白絡合物具有更長的藥理作用持續時間(膽固醇的流動)，并且其與不包括SM的載脂蛋白絡合物相比，能夠獲取更多的脂質，尤其是膽固醇(參見，如，美國公布文本第2004/0067873號中描述的載脂蛋白絡合物，通過引用將其全部公開內容并入本文)。這種作用可以使包括SM的脂蛋白絡合物與不包括SM的脂蛋白絡合物相比，治療所需的次數更少或者劑量更低。事實上，SM可以源自任`何來源。例如，SM可以由牛奶、蛋或腦獲得。還可以使用SM類似物或衍生物。有用的SM類似物和衍生物的非限制性實例包括但不限于棕櫚酰鞘磷月旨、硬脂酸鞘憐脂、D-赤鮮糖-N-16: 0-鞘憐脂及其二氫異構體、D-赤鮮糖-N-16: 0-二氫-鞘磷脂。可以人工地使由天然來源分離的鞘磷脂富含一種特殊的飽和或不飽和酰基鏈。例如，牛奶鞘磷脂(Avanti鞘磷脂，Alabaster, Ala.)的特征為具有飽和的長酰基鏈(即，具有20個或多個碳原子的酰基鏈)。相反，蛋鞘磷脂的特征為具有飽和的短酰基鏈(S卩，具有少于20個碳原子的酰基鏈)。例如，雖然只有大約20%的牛奶鞘磷脂包括C16:0(16個碳，飽和的)酰基鏈，但是卻有約80%的蛋鞘磷脂包括C16:0酰基鏈。可以通過使用溶劑萃取來使牛奶鞘磷脂的組成富含與蛋鞘磷脂具可比性的酰基鏈組分，反之亦然。為使SM具有特定的酰基鏈，其可以是半合成的。例如，牛奶鞘磷脂可以首選由牛奶進行純化，然后可以對一種特殊的酰基鏈，如C16:0酰基鏈進行裂解并替換為另一種酰基鏈。SM還可以通過如大規模合成來進行完全合成。參見，如，Dong等人的、1993年6月15日發行的、題為 “Synthesis ofD-ervthro-sphingomyelins” 的美國專利第 5, 220, 043 號；Weis, 1999，Chem.Phys.Lipidsl02(1-2):3-12。可以選擇性地改變包括半合成或合成SM的酰基鏈的長度和飽和度。所述酰基鏈可以是飽和或不飽和的，并且可以含有約6至約24個碳原子。每條鏈可以含有相同數目的碳原子，或者可選地，每條鏈可以含有不同數目的碳原子。在一些實施方案中，半合成或合成的SM包括混合的酰基鏈，以使其中的一條鏈為飽和的而另一條鏈為不飽和的。在具有這樣混合的酰基鏈的SM中，該鏈的長度可以相同或不同。在其他實施方案中，半合成或合成SM的酰基鏈可均為飽和或不飽和的。此外，該鏈可以含有相同或不同數目的碳原子。在一些實施方案中，包括半合成或合成SM的這兩種酰基鏈是相同的。在具體的實施方案中，該鏈與天然形成的脂肪酸的酰基鏈一致，所述天然形成的脂肪酸的例子如油酸、棕櫚酸或硬脂酸。在另一個具體的實施方案中，這兩種酰基鏈均為飽和的并且均含有6至24個碳原子。以下的表I提供了可以包括在半合成和合成SM中的、存在于通常形成的脂肪酸中的酰基鏈的非限制性實例:
權利要求
1.一種重構的荷電脂蛋白絡合物，其包括載脂蛋白成分和脂質成分，其中所述脂質成分主要包括:⑴約0.2至3wt%的一種或多種負電荷磷脂，(ii)鞘磷脂，以及任選(iii)卵磷脂。
2.根據權利要求1所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述一種或多種負電荷磷脂構成約I至3wt%的脂質成分。
3.根據權利要求2所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述一種或多種負電荷磷脂構成約2至3wt%的脂質成分。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其中所述脂質成分主要包括一種 或多種負電荷磷脂和鞘磷脂。
5.根據權利要求1所述的重構的荷電脂蛋白絡合物，其包括約100:5至約5:100的摩爾比的所述鞘磷脂和卵磷脂。
6.一種藥物組合物，其包括根據權利要求1-5中任一項所述的脂蛋白絡合物在水性載體中的無菌混懸液、溶液或乳劑。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其包括一種或多種緩沖劑、糖或鹽。
8.根據權利要求7所述的藥物組合物，其包括一種或多種糖。
9.一種藥物組合物，其包括粉末形式的根據權利要求1-5中任一項所述的脂蛋白絡合物。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中將所述脂蛋白絡合物進行凍干。
全文摘要
本公開提供了荷電的脂蛋白絡合物，其包括作為一種組分的負電荷磷脂，預期所述負電荷磷脂可使所述絡合物具有改善的治療性能。
文檔編號A61P3/06GK103182069SQ20121051864
公開日2013年7月3日 申請日期2006年3月23日 優先權日2005年3月24日
發明者吉恩-路易斯.H.達索伊克斯 申請人:塞勒尼斯醫療控股公司